河南省某兔場兔肝球蟲和大腸桿菌混合感染情況及耐藥性研究

張 昕,張自強,朱欣妍,張晨杰,劉玉梅

(河南科技大學 動物科技學院,河南 洛陽 471000)

兔球蟲病是家兔中最常見的也是危害最嚴重的寄生蟲病,被列為國家二類動物疫病。根據(jù)國內(nèi)外學者的報道,各兔場均發(fā)現(xiàn)不同程度的球蟲感染[1-4]。按球蟲的種類和寄生部位不同可將兔球蟲病分為肝型、腸型和混合型。臨床上混合型和腸型常見,分別占31.75%和56.48%,肝型較為少見,約占3.34%[5]。兔球蟲病多發(fā)于幼兔,感染率、病死率高,可出現(xiàn)高達70%的死亡率;成年兔一般均可耐過,但可排出卵囊成為長期帶蟲者和傳染源,且耐過兔長期消瘦、發(fā)育遲緩、體質(zhì)變差、抗病能力降低,極易繼發(fā)其他病原菌的感染[6]。兔大腸桿菌病是一種條件性致病菌,當兔生活環(huán)境發(fā)生變化、飼養(yǎng)管理不當、斷奶以及患上其他致使家兔抵抗力降低的疾病時,通常會引起該病的發(fā)生,該病呈現(xiàn)暴發(fā)性、潛伏期短、死亡率高的特點[7]。

目前國內(nèi)外對于兔混合型或腸型球蟲病繼發(fā)大腸桿菌報道較多,但關(guān)于兔肝球蟲與大腸桿菌混合感染報道較少[8]。本研究結(jié)合實際生產(chǎn)中疑似兔肝球蟲與大腸桿菌混合感染病例,通過臨床癥狀觀察、病理剖檢、球蟲檢測以及從病兔組織分離病原菌,并進行PCR鑒定、基因測序及藥敏試驗,確定球蟲感染類型以及病原菌的耐藥譜,對科學用藥、預防控制肝球蟲和大腸桿菌混合感染提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源

2021年1月,河南省某兔場商品兔群出現(xiàn)食欲不振、消瘦、腹圍增大并伴有明顯腹瀉癥狀為主要特征的疾病,病兔出現(xiàn)大量死亡,死亡率約70%。通過臨床觀察發(fā)病兔、病理剖檢、球蟲檢測及無菌采集病死兔肝臟、肺臟、氣管、腎臟、盲腸等組織,進行病原菌的分離培養(yǎng)及檢測。

1.2 主要試劑與儀器

普通瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基購自北京索萊寶科技有限公司;藥敏紙片、細菌微量生化鑒定管購自杭州微生物試劑有限公司;Premix TaqTM(E× TaqTM Version 2.0 plus dye)購自大連TaKaRa公司;細菌基因組DNA小量提取試劑盒、Proteinase K、DL2000 DNA Maker購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司;溴化乙錠溶液購自蘇州天可貿(mào)易有限公司。試驗用主要儀器包括顯微鏡、臺式冷凍高速離心機(Beckman Coulter)、普通PCR儀(Applied Biosystems 2720)、凝膠成像系統(tǒng)(BIORAD)、電泳儀(北京市六一儀器廠)。

1.3 球蟲檢測

取3～5 g新鮮糞便,加入7 mL飽和食鹽水,搗碎混勻,再加入50 mL飽和食鹽水,混勻后60目篩網(wǎng)過濾,取濾液,注滿麥克馬斯特板計數(shù)室,置于顯微鏡下放3～5 min,而后在顯微鏡下計數(shù)1 cm2的蟲卵總數(shù),求2個計數(shù)室中蟲卵數(shù)的平均數(shù),根據(jù)公式OPG=(n1/0.15)×60÷m計算出每克糞便中的蟲卵數(shù)(OPG)。其中n1為卵數(shù),0.15為每個計數(shù)室有效體積,60為糞液總體積,m為糞便克數(shù)。

肝球蟲檢測:抽取膽汁涂片于玻片上,置于顯微鏡下檢測。

1.4 病原菌的分離純化

無菌采集病死兔肝臟、肺臟、氣管、腎臟、盲腸等組織,分別接種于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)24 h后,觀察菌落的生長情況。挑取疑似單個菌落接種于麥康凱瓊脂平板上純化,并對純培養(yǎng)細菌進行革蘭染色,鏡檢。

1.5 生化試驗

將分離的菌純培養(yǎng)物分別接種到微量生化管,37 ℃培養(yǎng)24～48 h,觀察并記錄結(jié)果。

1.6 引物設計與合成

選取GenBank中發(fā)布的大腸桿菌eae基因序列,經(jīng)DNA Star軟件對比分析后,利用Primer Primier 5.0軟件設計1對引物。引物由通用生物(安徽)股份有限公司合成,引物序列及目的片段的大小見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.7 分子生物學鑒定

取分離純化后的菌液,按照細菌基因組DNA小量提取試劑盒說明書上的步驟進行細菌DNA的提取后,以菌液的核酸為模板,分別進行大腸桿菌eae基因的PCR擴增。反應體系25 μL:DNA模板 1 μL,Premix TaqTM 12.5 μL,上、下游引物各1 μL,ddH2O 9.5 μL。反應條件:94 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s,54 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,30個循環(huán);72 ℃ 10 min;4 ℃保存。擴增后的PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測后,送至通用生物(安徽)股份有限公司進行測序,將測序結(jié)果與GenBank中已登錄的菌株進行同源性比對分析,并利用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.8 動物回歸試驗

將1株分離菌分別接種于普通營養(yǎng)培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)24 h后用平板法進行細菌計數(shù),稀釋菌液濃度至109CFU/mL。將8只20 g左右SPF級KM小鼠隨機分為2組,每組4只,第1組每只小鼠分別腹腔注射稀釋好的菌液0.2 mL,對照組小鼠注射相同劑量的PBS。相同環(huán)境下飼養(yǎng),接種后觀察,對病死鼠進行剖檢。

1.9 藥敏試驗

按照美國臨床檢驗標準委員會(NCCLS)推薦的K-B紙片法[9]進行藥敏試驗操作和結(jié)果判斷。將分離的菌接種到普通瓊脂培養(yǎng)基上,放入藥敏紙片,測量抑菌圈的直徑。抗生素紙片包括:紅霉素、慶大霉素、新霉素、四環(huán)素 、多西環(huán)素、復方新諾明、多黏菌素B、麥迪霉素、卡那霉素、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、氨芐西林、丁胺卡那、頭孢哌酮、氯霉素。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床剖檢

病兔腹瀉嚴重,排出棕褐色水樣糞便,污染肛門周圍和后肢被毛(圖1A)。腸系膜出血,盲腸出血嚴重(圖1B)。膽囊充盈(圖1C)。肝臟腫大,表面和實質(zhì)有白色和淡黃色結(jié)節(jié),呈圓形,如粟粒至豌豆大,沿膽小管分布(圖1D)。

圖1 病死兔剖檢Fig. 1 Dissection of sick and dead rabbits

2.2 球蟲檢測結(jié)果

隨機抽取5只兔子取糞樣檢測,OPG值分別是0.0156×104、0.0623×104、0.0321×104、0.0252×104、0.0276×104(圖2A),未達到腸球蟲感染標準(OPG≥0.5×104)[10]。膽汁涂片鏡檢可看到視野里出現(xiàn)大量球蟲卵囊(圖2B)。

圖2 球蟲檢測Fig. 2 Cryptococcus assay

2.3 細菌形態(tài)及培養(yǎng)特性觀察

經(jīng)細菌分離培養(yǎng),從5只病死兔肝臟中分離到5株細菌,5株菌體形態(tài)特征、培養(yǎng)特性、生化特性和藥物敏感性一致。細菌在普通瓊脂上生長后,能看到不產(chǎn)生色素、圓形、中等大小、表面有微微凸起、邊緣整齊、半透明灰白色的菌落(圖3A),在麥康凱瓊脂平板上能形成紅色菌落(圖3B)。革蘭染色鏡檢可見染色陰性、無芽孢的中等大小直桿菌,大小為(0.4～0.7)μm×(2～3)μm,其菌體兩端鈍圓,多單個散在或者成對排列(圖3C)。

圖3 細菌培養(yǎng)形態(tài)及革蘭氏染色A.普通瓊脂培養(yǎng);B. 麥康凱瓊脂培養(yǎng);C.革蘭染色鏡檢Fig. 3 Bacterial culture morphology and Gram stainingA. Ordinary AGAR culture;B. McConkey AGAR culture;C. Gram staining microscopy

2.4 生化試驗

細菌理化性質(zhì)見表2,其理化性質(zhì)符合大腸桿菌的生化特性。因此,據(jù)分離菌形態(tài)、培養(yǎng)特性及表2生化特性分析結(jié)果,初步判定此次分離培養(yǎng)菌為大腸桿菌。

表2 生化試驗結(jié)果Table 2 Biochemical test results

2.5 分子生物學鑒定

經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后,5只兔子的肝臟處分離得到的細菌約在833 bp處出現(xiàn)特異性條帶(圖4 )。分別將2種擴增產(chǎn)物的測序結(jié)果經(jīng)NCBI blast分析,采用DNAStar軟件中MegAlign進行多序列比對,采用MEGA 7.0軟件分別構(gòu)建其遺傳進化樹,結(jié)果見圖5。

圖4 分離菌eae基因 PCR擴增電泳圖M. DL2000 Marker;1～5.分離菌株Fig. 4 eae gene PCR amplification electrophoresis of isolation bacteriaM. DL2000 Marker; 1～5. Isolated strains

圖5 分離菌16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹(鄰接法構(gòu)建)Fig. 5 Phylogenetic tree of isolation bacteria 16S rRNA gene(Neighbor-joining,NJ)

2.6 動物回歸試驗

通過動物回歸試驗發(fā)現(xiàn),對照組小鼠在觀察期內(nèi)無臨床癥狀。試驗組小鼠在注射24 h后出現(xiàn)精神沉郁、進食減少、嗜睡等癥狀,48 h后開始出現(xiàn)死亡現(xiàn)象,至72 h 小鼠死亡3只,余1只存活,存活小鼠精神沉郁,被毛無光澤,厭食消瘦。死亡小鼠剖檢觀察發(fā)現(xiàn)皮下有出血點,腹水充盈,肝臟淤血腫大,腎臟腫大有出血點,腸道內(nèi)容物有血塊。肝臟、腎臟等組織接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng),分離菌的菌落特征和染色鏡檢結(jié)果均與原分離菌株一致,16S rRNA的PCR鑒定證實序列與原分離株相同。

2.7 藥敏試驗

根據(jù)美國臨床實驗室標準化委員會(NCCLS,2004年第14版)[9]推薦的K-B紙片擴散法進行藥敏試驗及結(jié)果判定。將該大腸桿菌接種到普通瓊脂培養(yǎng)基上,放入藥敏紙片,測量抑菌圈的直徑。大腸桿菌對不同藥物的敏感性見表3。由表3可知,大腸桿菌對多黏菌素B、丁胺卡那、氨芐西林、頭孢哌酮敏感,對環(huán)丙沙星表示中介,對紅霉素、慶大霉素、新霉素、麥迪霉素、四環(huán)素、卡那霉素、多西環(huán)素、復方新諾明、諾氟沙星、氯霉素不敏感。

表3 不同藥物對大腸桿菌菌株的抑菌效果Table 3 Bacteriostatic effects of different drugs on Brodetella bronchiseptica strains

3 討 論

兔球蟲病是養(yǎng)兔業(yè)危害最大的疾病之一,因球蟲造成的經(jīng)濟損失高居首位[11]。球蟲按感染部位可分為肝型、腸型和混合型,臨床上以混合型和腸型較為常見。Okumu等[12]通過抽檢肯尼亞農(nóng)場2 680只兔發(fā)現(xiàn)兔球蟲感染率85.1%,其中腸球蟲29.5%,肝球蟲11.5%,其余為混合感染。張嘉等[13]對福建某肉兔場球蟲感染進行調(diào)查發(fā)現(xiàn)球蟲總感染率為89.79%,以腸球蟲為主,混合型為次。葉勇剛等[14]對四川規(guī)模兔場球蟲病感染情況調(diào)查顯示總感染率為71.11%,其中1～3月齡幼兔感染率達96%,全部為混合型感染。彭家煒[15]對河南南陽地區(qū)兔球蟲病流行病學進行調(diào)查,發(fā)現(xiàn)總感染率為52.5%,幼兔的感染率顯著高于其他年齡段,均屬于混合型和腸型。ElShahawi等[16]調(diào)查了埃及家兔球蟲的感染情況,發(fā)現(xiàn)感染率達到70%,大多數(shù)是腸球蟲,混合型和肝型少見。

兔大腸桿菌病是兔養(yǎng)殖中的主要傳染病之一,癥狀以腹瀉為主,具有潛伏期短、死亡率高的特點。大腸桿菌極易產(chǎn)生耐藥性,近年來抗生素頻繁使用導致大腸桿菌耐藥性愈發(fā)嚴重,病情復雜化,治療難度增加,且各個地區(qū)臨床用藥的不同造成大腸桿菌對抗菌藥物的耐藥性呈現(xiàn)出不同程度的差異。韓超逸等[17]報道貴州省某兔場爆發(fā)大腸桿菌病,發(fā)病率17%,死亡率14%,藥敏結(jié)果顯示僅對慶大霉素和頭孢曲松敏感。王孝友[18]報道重慶市某兔場大腸桿菌對環(huán)丙沙星、慶大霉素、氟派酸、新霉素敏感,發(fā)病初期未能及時采取敏感藥物治療導致60日齡病兔腹瀉嚴重,發(fā)病后很快死亡。王佳佳等[19]報道河南省某兔場大腸桿菌與克雷伯氏菌混合感染導致病兔腹瀉迅速死亡,藥敏結(jié)果顯示大腸桿菌對慶大霉素、環(huán)丙沙星、頭孢氨芐、頭孢唑啉、頭孢哌酮、頭孢拉定、氨芐西林7種藥物敏感。高?；鄣萚20]報道分離得到的75株牛源大腸桿菌對阿莫西林、哌拉西林、氨芐西林、頭孢唑啉、氟苯尼考、恩諾沙星、四環(huán)素的耐藥率均大于90%,且多重耐藥菌株占85.33%,耐藥嚴重。王昌建[21]報道79株臨床分離的豬源大腸桿菌對β-內(nèi)酰胺酶類的藥物氨芐西林耐藥率為92.4%。

本次發(fā)病兔場病兔精神沉郁、食欲減退、俯臥不動、消瘦、腹脹、肝區(qū)觸診有痛感,腹瀉嚴重,排出棕褐色水樣糞便,死亡前歪倒,慘叫而亡。通過采取飽和食鹽水漂浮法對兔場病兔進行糞檢,檢測出球蟲的OPG值未達到腸球蟲感染標準(OPG≥0.5×104)。剖檢多只病兔后觀察發(fā)現(xiàn)個別肝臟表面和實質(zhì)有白色和淡黃色條形結(jié)節(jié),沿膽小管分布。抽取膽汁涂片顯微鏡下可見大量球蟲卵囊,其余病兔膽汁均可觀察到球蟲卵囊,是典型的由斯氏艾美耳球蟲寄生在肝臟和膽管上皮細胞造成的肝球蟲癥狀[10]。后經(jīng)細菌的分離培養(yǎng)、PCR鑒定和進一步的測序,確定分離菌為大腸桿菌,藥敏試驗結(jié)果顯示,該菌僅對多黏菌素B、丁胺卡那、氨芐西林、頭孢哌酮敏感,對其他藥物有較強抗性,耐藥嚴重。該兔場發(fā)病后,兔場技術(shù)人員檢測了糞便中的球蟲卵囊,未見球蟲感染,與實驗室檢測結(jié)果一致。由于肝球蟲感染在臨床球蟲感染中較為少見,且前期臨床和病理變化不明顯,導致該場技術(shù)人員未能及時發(fā)現(xiàn)肝球蟲及對癥治療,僅當做細菌感染治療。在使用大量針對細菌感染治療的藥物后,仍然不能有效控制兔群發(fā)病,兔群在肝球蟲與大腸桿菌相互協(xié)同作用下,病死率高達70%,造成兔場損失慘重。該兔場最終根據(jù)藥敏試驗結(jié)果,采用磺胺氯丙嗪鈉與丁胺卡那聯(lián)合用藥,控制住了兔場大規(guī)模的發(fā)病,療效顯著,避免了更大的經(jīng)濟損失。

在兔的養(yǎng)殖過程中,單獨的肝球蟲感染較為少見,球蟲感染常常會繼發(fā)細菌性感染,生產(chǎn)中應以預防為主、治療為輔,預防上采取加強飼養(yǎng)管理、消毒保持兔舍衛(wèi)生、定期使用藥物預防球蟲。在該病流行季節(jié)采取輪換或穿梭用藥進行預防。一旦發(fā)病,使用抗球蟲藥并通過藥敏試驗篩選出細菌敏感藥物進行科學合理的治療。