百香果酒發(fā)酵動力學及抗氧化活性研究

郝麗粉，葉曉芳，張靜進，林 奇，包媛媛*

（云南農(nóng)業(yè)大學 食品科學技術(shù)學院，云南 昆明 650201）

百香果（Passiflora edulis）又名西番蓮、雞蛋果，是西番蓮科西番蓮屬的一種草質(zhì)藤本植物，主要有紫果和黃果兩大類[1]。目前，紫皮百香果（Passiflora edulisSims）是種植和銷售最多的品種之一，其含有豐富的可溶性糖、有機酸、維生素等活性物質(zhì)[2]，果皮中富含果膠、粗纖維、多糖、黃酮和多酚類物質(zhì)[3-4]。具有消炎[5]、鎮(zhèn)靜[6]、抗焦慮[7]、治療失眠[8]等功效。果酒的酒精發(fā)酵是指果汁中的糖在酵母菌的一系列酶的作用下，通過復雜的化學變化，最終產(chǎn)生乙醇和二氧化碳的過程[9]。經(jīng)發(fā)酵得到的百香果酒營養(yǎng)豐富，風味獨特，酒精度低[10]。目前，國內(nèi)關(guān)于百香果發(fā)酵酒的研究報道較多，楊玉霞等[11]以百香果全果為原料，經(jīng)過響應面優(yōu)化法確定百香果全果酒最適發(fā)酵條件，LIU R J等[12]采用氣相色譜、電子鼻和感官評價相結(jié)合的方法對百香果酒的揮發(fā)性成分和香氣特征進行研究。

發(fā)酵動力學是研究各種環(huán)境因素與微生物代謝活動之間相互作用隨時間變化的規(guī)律。通過發(fā)酵動力學的研究，可以預先估計發(fā)酵液不同時間內(nèi)物質(zhì)含量，對出現(xiàn)的異常情況進行判斷[13]，對果酒工業(yè)化生產(chǎn)及控制具有現(xiàn)實意義。百香果酒發(fā)酵過程中，酒精的生成與酵母菌生長和底物糖消耗相對應。李雪等[14]研究仙人掌果酒發(fā)酵動力學及抗氧化性，結(jié)果表明，仙人掌果及其發(fā)酵果酒的抗氧化能力都比較高，說明仙人掌果發(fā)酵后仍能保持原有的抗氧化性能。張琪等[15]采用四種模型對沙棘果酒發(fā)酵過程中實驗數(shù)據(jù)進行非線性擬合，建立發(fā)酵動力學模型，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。目前，關(guān)于百香果果汁和百香果全果汁的發(fā)酵動力學及發(fā)酵過程中抗氧化活性變化規(guī)律的研究鮮有報道。

本研究采用Logistic模型、Boltzmann模型、SGompertz模型和DoseResp模型對總糖消耗、酒精生成和酵母菌數(shù)的變化進行非線性擬合，建立發(fā)酵動力學模型，對百香果酒發(fā)酵過程中總酚含量和總黃酮含量進行測定，并采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）法和Fe3+還原能力測定發(fā)酵過程中百香果果汁酒和百香果全果酒的抗氧化能力，分析生物活性成分與抗氧化能力的動態(tài)變化規(guī)律。以期為百香果酒的控制發(fā)酵提供理論基礎(chǔ)，帶動高原特色農(nóng)業(yè)經(jīng)濟發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫皮百香果（可溶性固形物13.6%，總酸35.38 g/L，總糖55.76 g/L）：采樣于云南西雙版納；果酒專用酵母RW：安琪酵母股份有限公司；果膠酶（酶活3萬U/g）：山東隆科特酶制劑有限公司；焦亞硫酸鉀（分析純）：浙江一諾生物科技有限公司；食用純堿：南京甘汁園糖業(yè)有限公司；氫氧化鈉、苯酚、亞硝酸鈉、三氯乙酸（均為分析純）：天津市風船化學試劑科技有限公司。

1.2 儀器與設備

LB32T手持折光儀：廣州市速為電子科技有限公司；A360紫外可見分光光度計：上海翱藝儀器有限公司；HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；WPL-65BE恒溫培養(yǎng)箱：天津市泰斯特儀器有限公司；SF-TDL-4A分析天平：上海菲恰爾有限公司；25×16血球板計數(shù)器：上海市求精生化試劑儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 百香果酒加工工藝流程及操作要點

百香果→預處理→破殼取肉→酶解→過濾→混料→成分調(diào)整→酵母活化→主發(fā)酵→陳釀→百香果成品

預處理：挑選無病蟲害、無霉變、顏色均勻的新鮮成熟百香果，流動清水漂洗2次，備用。

破殼取肉：切開百香果后取出果肉。

酶解：百香果果肉中添加0.22%果膠酶，50 ℃水浴3.5 h。

過濾：雙層紗布過濾得百香果汁。

混料：考慮成本因素及原果汁太濃稠，按料液比1.0∶1.5（g∶g）混料。以果汁及無菌水的比例為1.0∶1.5（g∶g）加水獲得果汁酒原料；以果皮與水料液比為1∶4（g∶g）加水打漿即為果皮漿，以果汁及果皮漿比例為1.0∶1.5（g∶g）加果皮漿獲得全果酒原料。

成分調(diào)整：調(diào)整pH至3.5，果汁酒原料加入蔗糖至糖度為21.5%，全果酒原料加入蔗糖至糖度為20.6%，以利于發(fā)酵，添加4 mg/100 g焦亞硫酸鉀，防止雜菌污染。

酵母活化：取適量果酒酵母，按料液比1∶9（g∶mL）加入無菌水，37 ℃水浴活化25 min。

主發(fā)酵：百香果果汁酒的酵母接種量為0.04%、初始糖度為21.5%、發(fā)酵溫度為28.7 ℃、發(fā)酵時間為6 d；百香果全果酒的酵母接種量為0.03%、初始糖度為20.6%、發(fā)酵溫度為25.5 ℃、發(fā)酵時間為5 d。

陳釀：陳釀即后發(fā)酵，采用虹吸法將酒液吸到另一干凈容器內(nèi)，除去發(fā)酵醪中的酒糟，同時吸到新容器后要盡量加滿，以減少氧氣對酒液的氧化作用，15 ℃低溫后發(fā)酵2個月，即得百香果酒成品。

1.3.2 分析檢測

總糖含量：采用苯酚-硫酸法測定[16]；總酚含量：采用福林-肖卡（Folin-Ciocalteau）比色法測定[13]；酒精度：按照GB 5009.225—2016《酒中乙醇濃度酒精計法》測定；總黃酮含量：采用NaNO2-AlCl3-NaOH分光光度法測定[17]；酵母菌數(shù)量：采用血球計數(shù)板測定[18]。

1.3.3 抗氧化性能測定

DPPH自由基清除率：參考PENKOV D等[19]的方法測定。取0.2mL樣液，加入7.8mLDPPH無水乙醇溶液（8μg/mL），混勻避光反應30 min，在波長517 nm處測定吸光度值。其計算公式如下：

式中：A1為樣液與DPPH無水乙醇溶液的吸光度值；A2為樣液與無水乙醇的吸光度值；A0為蒸餾水與DPPH無水乙醇溶液的吸光度值。

Fe3+還原能力：參考DIANTINI A等[20]的方法測定。取1 mL樣液，加入0.2 mL磷酸鹽緩沖溶液（0.2 mol/L、pH6.6）和0.5 mL1%鐵氰化鉀溶液，混勻，50 ℃條件下水浴20 min，取出后快速冷卻，再加入1 mL10%三氯乙酸溶液，終止反應后取上清液1.5 mL，加入0.2 mL1%三氯化鐵溶液和3 mL蒸餾水，混勻靜置5 min，于波長700 nm處測定吸光度值。吸光度值越大說明還原能力越強。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

所有試驗重復3次，結(jié)果以“平均值±標準差”表示。應用Origin 9.0軟件對基質(zhì)消耗、產(chǎn)物生成、菌體生長情況建立動力學模型。選取合適的模型，進行非線性擬合，相關(guān)系數(shù)R2越大，擬合度越高，選取擬合度最高的模型對其進行定量描述。應用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 百香果果汁酒發(fā)酵過程中總糖含量、酒精度、酵母菌數(shù)量變化趨勢

百香果果汁酒發(fā)酵過程中總糖含量、酒精度、酵母菌數(shù)量變化規(guī)律見圖1。由圖1可知，在酵母菌的生長過程中，0～60 h為對數(shù)生長期，伴隨營養(yǎng)的儲存和初級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，微生物的生長速率與底物利用率成正比，生長曲線可以清晰的描繪出來[21]。60～84 h，酵母菌的生長速率減緩，其原因可能是，底物糖的消耗和產(chǎn)物酒精的積累；發(fā)酵時間為84 h時，酵母菌數(shù)達到最高值（3.35×108CFU/mL）；發(fā)酵時間＞84 h，酵母菌數(shù)量逐漸減少，酵母開始加入衰亡期。當發(fā)酵時間為0～96 h，總糖含量降低；當發(fā)酵時間＞96 h時，總糖含量變化趨勢趨于平穩(wěn)，糖基本被消耗。當發(fā)酵時間在0～60 h范圍內(nèi)的延長，酒精度呈快速上升的趨勢；當發(fā)酵時間＞60 h，酒精度增加趨勢趨于平穩(wěn)，發(fā)酵時間為144 h時，酒精度達最大值，為10.2%vol。結(jié)果表明，在百香果果汁酒發(fā)酵過程中酒精的生成與酵母菌生長和底物糖消耗是相對應的。

圖1 百香果果汁酒發(fā)酵過程中總糖含量、酒精度、酵母菌數(shù)量變化Fig.1 Change of total sugar content, alcohol content and yeast count during passion fruit juice wine fermentation

2.2 百香果果汁酒發(fā)酵動力學模型的建立

2.2.1 百香果果汁酒底物消耗動力學模型

總糖消耗擬合方程及其相關(guān)系數(shù)見表1。Boltzmann模型及DoseResp模型下總糖消耗擬合曲線見圖2。

表1 總糖消耗擬合方程及其相關(guān)系數(shù)Table 1 Fitting equation of total sugar consumption and its correlation coefficient

圖2 Boltzmann模型（A）及DoseResp模型（B）下總糖消耗擬合曲線Fig.2 Fitting curve of total sugar consumption under Boltzmann model (A) and DoseResp model (B)

由表1可知，3個模型相關(guān)系數(shù)R2均＞0.99，Boltzmann和DoseResp模型相關(guān)系數(shù)一致，均高于Logistic模型，說明這2種模型均能較好地反映百香果果汁酒發(fā)酵過程總糖含量的變化。由圖2可知，發(fā)酵時間為0～96 h時，總糖消耗較快，表明百香果果汁酒主發(fā)酵即將結(jié)束；發(fā)酵時間＞96 h，總糖消耗趨于穩(wěn)定。Boltzmann和DoseResp模型下的總糖含量實測值和預測值基本吻合，說明該模型能較好地描述百香果果汁酒發(fā)酵過程中總糖的消耗過程。結(jié)論與李雪等[14]關(guān)于仙人掌果酒底物消耗趨勢一致。

2.2.2 百香果果汁酒產(chǎn)物生成動力學模型

酒精生成擬合方程及其相關(guān)系數(shù)見表2。由表2可知，DoseResp模型擬合相關(guān)系數(shù)R2較高（0.998 41），可以較好地描述百香果果汁酒發(fā)酵過程中酒精生成的變化過程。DoseResp模型下酒精生成擬合曲線見圖3。由圖3可知，發(fā)酵時間為0～96 h，酵母菌快速生長繁殖，酒精生成速率加快；當發(fā)酵時間＞96 h，酵母菌進入衰亡期，活力逐漸減弱[22]，酒精度變化趨于穩(wěn)定，發(fā)酵時間為144 h時，酒精度為10.2%vol。

表2 酒精生成擬合方程及其相關(guān)系數(shù)Table 2 Fitting equation of alcohol generation and its correlation coefficient

圖3 DoseResp模型下酒精生成擬合曲線Fig.3 Fitting curve of alcohol generation under DoseResp model

2.2.3 百香果果汁酒菌體生長動力學模型

由圖1可知，酵母菌在84 h后開始進入衰亡期，因此對0～84 h范圍內(nèi)的酵母菌生長情況進行非線性曲線擬合，酵母菌數(shù)量擬合方程及其相關(guān)系數(shù)見表3。由表3可知，對比3個模型的擬合度，DoseResp模型擬合相關(guān)系數(shù)最高，相關(guān)系數(shù)R2為0.997 96。因此，選擇DoseResp模型來擬合百香果果汁酒發(fā)酵過程中的酵母菌數(shù)量變化過程。DoseResp模型下酵母菌生長擬合曲線見圖4。由圖4可知，發(fā)酵時間為0～84 h，酵母菌數(shù)逐漸增加，發(fā)酵時間為84 h時，酵母菌數(shù)達到最高值，為3.35×108CFU/mL。

表3 酵母菌數(shù)量擬合方程及其相關(guān)系數(shù)Table 3 Fitting equation of yeast number and its correlation coefficient

圖4 DoseResp模型下酵母菌生長擬合曲線Fig.4 Fitting curve of yeast growth under DoseResp model

2.3 百香果全果酒發(fā)酵過程中總糖含量、酒精度、酵母菌數(shù)量變化趨勢

百香果全果酒發(fā)酵過程中總糖含量、酒精度、酵母菌數(shù)量變化規(guī)律見圖5。由圖5可知，發(fā)酵時間為0～24 h，酵母菌數(shù)量從0.84×108CFU/mL增長至1.17×108CFU/mL；發(fā)酵時間為24～72 h，酵母菌快速增長，總糖含量快速下降；發(fā)酵時間為72 h時，酵母數(shù)量達到最高值3.29×108CFU/mL；當發(fā)酵時間＞72 h，酵母菌數(shù)量逐漸減少。發(fā)酵時間為0～72 h，總糖含量快速下降，酒精度快速上升；當發(fā)酵時間＞72 h，總糖含量及酒精度變化趨于平穩(wěn)。酒精是酵母菌厭氧發(fā)酵消耗糖類代謝而生成的產(chǎn)物，隨著發(fā)酵時間的延長酒精度呈現(xiàn)上升的趨勢。結(jié)果表明，在百香果全果酒發(fā)酵過程中，酒精的生成與酵母菌生長和總糖消耗是相對應的。

圖5 百香果全果酒發(fā)酵過程中總糖含量、酒精度、酵母菌數(shù)量變化Fig.5 Change of total sugar content, alcohol content and yeast count during passion fruit whole fruit wine fermentation

2.4 百香果全果酒發(fā)酵動力學模型的建立

2.4.1 百香果全果酒底物消耗動力學模型

總糖消耗擬合方程及其相關(guān)系數(shù)見表4。由表4可知，Logistic模型擬合相關(guān)系數(shù)最高，R2為0.999 41，故選用Logistic模型擬合總糖消耗曲線結(jié)果見圖6。由圖6可知，在百香果全果酒發(fā)酵過程中，總糖含量測定值和模型預測值基本吻合。發(fā)酵時間為0～84 h，總糖含量快速下降；當發(fā)酵時間＞84 h，總糖含量變化趨于平穩(wěn)，與酵母菌生長和酒精生成相互對應。

表4 總糖消耗擬合方程及其相關(guān)系數(shù)Table 4 Fitting equation of total sugar consumption and its correlation coefficient

圖6 Logistic模型下總糖消耗擬合曲線Fig.6 Fitting curve of total sugar consumption under Logistic model

2.4.2 百香果全果酒產(chǎn)物生成動力學模型

酒精生成擬合方程及其相關(guān)系數(shù)見表5。由表5可知，DoseResp模型能較好地描述百香果全果酒發(fā)酵過程中酒精生成的動態(tài)變化，其相關(guān)系數(shù)為0.998 82。DoseResp模型下酒精生成擬合曲線見圖7。由圖7可知，發(fā)酵時間為0～72 h，酒精度逐漸增加；當發(fā)酵時間＞72 h，酒精度變化趨于平穩(wěn)；發(fā)酵時間為120 h，酒精度達最高值，為9.8%vol。百香果全果酒發(fā)酵過程中酒精生成動力學模型的預測值和實測值的相對誤差較小，表明該模型能較好地反映隨發(fā)酵時間酒精度的變化情況。

表5 酒精生成擬合方程及其相關(guān)系數(shù)Table 5 Fitting equation of alcohol generation and its correlation coefficient

圖7 DoseResp模型下酒精生成擬合曲線Fig.7 Fitting curve of alcohol generation under DoseResp model

2.4.3 百香果全果酒菌體生長動力學模型

由圖5可知，酵母菌在24～60 h呈對數(shù)生長期，故對0～72 h時期的酵母菌體生長情況進行非線性擬合。酵母菌數(shù)量擬合方程及其相關(guān)系數(shù)見表6。由表6可知，DoseResp模型擬合相關(guān)系數(shù)最高，R2為0.999 54，故選用DoseResp模型對百香果全果酒發(fā)酵過程酵母生長情況進行描述。DoseResp模型下酵母菌生長擬合曲線見圖8。由圖8可知，酵母菌在0～24 h增長緩慢；當發(fā)酵時間為24～60 h，酵母菌快速增長；當發(fā)酵時間＞72 h，酵母菌數(shù)變化趨于平緩。

表6 酵母菌數(shù)量擬合方程及其相關(guān)系數(shù)Table 6 Fitting equation of yeast number and its correlation coefficient

圖8 DoseResp模型下酵母菌生長擬合曲線Fig.8 Fitting curve of yeast growth under DoseResp model

2.5 百香果果汁酒及全果酒發(fā)酵動力學對比分析

百香果果汁酒和全果酒酒精度分別為10.2%vol、9.8%vol。未發(fā)酵時，果汁酒、全果酒中酵母菌數(shù)量分別為0.62×108CFU/mL、0.84×108CFU/mL，說明百香果果皮中含有少量的天然酵母。發(fā)酵時間為0～24 h，果汁酒總糖消耗量比全果酒多，因為果汁酒體系中酵母快速生長，而全果酒體系中酵母菌數(shù)量增長緩慢，這是由于紫皮百香果果皮中含有豐富的木犀草素、芹菜素、白楊素、槲皮素等為苷元的黃酮碳苷和氧苷類物質(zhì)，其中牧荊素、木犀草素和槲皮素等苷元類黃酮具有消化酶抑制能力，在一定程度上抑制了酵母的活性[23]。發(fā)酵時間＞24 h，果汁酒、全果酒體系中酵母菌數(shù)分別在84 h、72 h時達到最高值，酵母菌數(shù)量多則消耗更多的糖分[24]。在一定程度上加快發(fā)酵速率，但果汁酒體系中總糖含量較高，因此全果酒發(fā)酵周期較果汁酒短，果汁酒酒精度較全果酒略高。

2.6 百香果酒發(fā)酵過程中抗氧化活性物質(zhì)與抗氧化能力的變化

百香果酒發(fā)酵過程中抗氧化活性物質(zhì)與抗氧化能力的變化見表7。

表7 百香果酒發(fā)酵過程中抗氧化活性物質(zhì)與抗氧化能力的變化Table 7 Changes of antioxidant active substances and antioxidant ability during passion fruit wine fermentation

由表7可知，隨著發(fā)酵的進行，果汁酒和全果酒中總酚和總黃酮含量、DPPH自由基清除率和Fe3+還原能力均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，呈峰型變化。果汁酒中總酚和總黃酮含量均在24 h時達到最高值，分別為9.31 μg/mL、7.38 μg/mL，DPPH自由基清除率和Fe3+還原能力在48 h時達到最高值。由于發(fā)酵前期產(chǎn)生的酒精有利于酚類物質(zhì)和花色苷的溶出[25]，黃酮化合物易溶于乙醇，而DPPH自由基清除能力的變化主要與多酚類物質(zhì)含量的變化有關(guān)[26]。發(fā)酵時間延長，總酚及總黃酮含量、DPPH自由基清除率和Fe3+還原能力開始下降，下降的原因可能是體系中糖減少，酵母的代謝產(chǎn)物與酚類、黃酮類物質(zhì)發(fā)生反應，生成衍生物，造成抗氧化活性物質(zhì)減少[14]，影響DPPH自由基清除率和Fe2+還原能力。

全果酒中總酚和總黃酮含量均在24 h時達到最高值，分別為18.89 μg/mL、10.97 μg/mL，DPPH自由基清除率和Fe3+還原能力在48 h時達到最高值。0～24 h時，酚類和黃酮化合物受酒精增加及微生物發(fā)酵的作用下含量不斷增加[27]。發(fā)酵時間＞24 h，可能是黃酮化合物不穩(wěn)定，發(fā)生自身分解及氧化導致黃酮含量下降[28]，從而影響抗氧化能力。

未發(fā)酵和發(fā)酵結(jié)束后的果汁酒、全果酒中總酚和總黃酮含量、Fe3+還原能力差異顯著（P＜0.05），DPPH自由基清除率不顯著（P＞0.05），可能由于在發(fā)酵過程中酵母菌大量生長繁殖、物質(zhì)代謝轉(zhuǎn)化造成了抗氧化成分的損失，導致抗氧化活性物質(zhì)含量下降[29]。全果酒的總酚和總黃酮含量、DPPH自由基清除率和Fe3+還原能力均高于果汁酒，由于紫百香果皮中含有大量多糖、黃酮及酚類等營養(yǎng)物質(zhì)[30]，全果酒抗氧化能力高于果汁酒。

3 結(jié)論

采用Boltzmann模型、DoseResp模型、Logistic模型能較好地對果汁酒和全果酒發(fā)酵過程中總糖消耗、酒精生成和酵母菌生長數(shù)據(jù)進行非線性擬合，擬合系數(shù)R2均＞0.99，表明所選擬合模型能較好地模擬發(fā)酵過程及描述其發(fā)酵動力學特征。隨著發(fā)酵的進行，果汁酒和全果酒中總酚和總黃酮含量、DPPH自由基清除能力和Fe3+還原能力均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，發(fā)酵過程中抗氧化性呈峰型變化。經(jīng)過發(fā)酵后得到的果汁酒和全果酒保留了較高的抗氧化性能，全果酒抗氧化性能優(yōu)于果汁酒。通過對百香果酒發(fā)酵動力學及抗氧化活性的研究，探索最佳工藝技術(shù)及參數(shù)條件，為百香果酒的規(guī)模化生產(chǎn)提供一定的技術(shù)基礎(chǔ)。