湖州地區(qū)雜草稻遺傳多樣性分析及防治策略初探

趙德琪，谷剛，孟華兵，張齊彥，尚年軍，陳偉，陳雷*

(1.湖州潔田模式生物科技有限公司，浙江 湖州 313000；2.湖州市吳興區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，浙江 湖州 313000；3.稻豐農(nóng)業(yè)有限公司，浙江 湖州 313000；4.湖州市吳興區(qū)東林鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)農(nóng)村辦公室，浙江 湖州 313000)

雜草稻是水稻田間最主要的危害性雜草之一。雜草稻與水稻親緣關(guān)系相近，具有早熟、易落粒、休眠性強(qiáng)和繁殖系數(shù)高等特點(diǎn)，在稻田中與栽培稻爭(zhēng)奪水分、肥料、光照等資源，導(dǎo)致稻米品質(zhì)差，產(chǎn)量低，嚴(yán)重?fù)p害了栽培水稻的產(chǎn)量和質(zhì)量[1]。雜草稻前期生長與普通栽培稻無明顯差異，但后期生長加快，在抽穗揚(yáng)花期通常比栽培稻高大。由于雜草稻和栽培稻在生理生化性狀方面的相似性，利用稻田常用的選擇性除草劑無法做到防除雜草稻的同時(shí)不傷害栽培稻，一般采用后期人工拔除雜草稻植株或割除雜草稻穗子等方法進(jìn)行防控[2]。水稻直播栽培為雜草稻種子萌發(fā)生長創(chuàng)造了有利條件，隨著水稻直播等輕簡化技術(shù)的廣泛應(yīng)用，雜草稻在我國部分地區(qū)發(fā)展迅速，給糧食生產(chǎn)造成嚴(yán)重影響[3]。

水稻為湖州市主要糧食作物，受農(nóng)業(yè)勞動(dòng)力制約和土地流轉(zhuǎn)進(jìn)程影響，栽培模式逐漸由傳統(tǒng)的精耕細(xì)作向輕簡化栽培改變[4]。目前，湖州市水稻直播(含機(jī)直播和無人機(jī)播種)面積超過80%，稻田雜草群落、草害情況與20世紀(jì)末相比發(fā)生了巨大變化，雜草稻已經(jīng)成為主要雜草危害，在部分田塊甚至達(dá)到中度危害水平[5]。

對(duì)雜草稻群體遺傳多樣性的調(diào)查研究，有助于了解湖州地區(qū)的雜草稻來源與種群分布，能幫助農(nóng)戶從源頭控制雜草稻危害的發(fā)生。SSR標(biāo)記具有快速、穩(wěn)定、準(zhǔn)確、且不受環(huán)境因素影響等特點(diǎn)[6]，本研究采用SSR標(biāo)記對(duì)在湖州地區(qū)采集的雜草稻樣品進(jìn)行了遺傳多樣性分析，并開展了雜草稻的表型特征調(diào)查。

乙酰乳酸合成酶(ALS)抑制劑是通過其干擾ALS與底物結(jié)合來抑制植物支鏈氨基酸生物合成的一類除草劑[7]。在水稻的ALS基因上發(fā)生特定的堿基突變，會(huì)使水稻獲得對(duì)ALS抑制劑類除草劑的抗性[8]。利用抗除草劑水稻和相應(yīng)的選擇性除草劑，可以達(dá)到殺死雜草稻卻不影響栽培稻生長的目的，是防治雜草稻的有效手段[9]。因此，本研究進(jìn)一步調(diào)查了湖州地區(qū)雜草稻對(duì)于ALS抑制劑類除草劑的抗性，探索了利用非轉(zhuǎn)基因抗除草劑水稻和ALS類抑制劑結(jié)合，控制湖州地區(qū)雜草稻危害的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料采集

本研究所用雜草稻材料均于2019年9-10月從湖州水稻田間采集，此時(shí)正值水稻和雜草稻成熟期，易于分辨。采集地點(diǎn)遍布湖州市兩區(qū)三縣，主要來源于雜草稻頻發(fā)的吳興區(qū)東林鎮(zhèn)東華村、吳興區(qū)東林鎮(zhèn)保永村、吳興區(qū)八里店鎮(zhèn)紫金橋村、德清縣洛舍鎮(zhèn)陸家灣村、南潯區(qū)菱湖鎮(zhèn)千豐村、長興縣畫溪街道包橋村、長興縣畫溪街道南石橋村、安吉縣梅溪鎮(zhèn)荊灣村。共采集到15個(gè)雜草稻樣品，均具有典型的雜草稻特征，如早熟、易落粒、多數(shù)種皮紅色等，并根據(jù)采集地點(diǎn)進(jìn)行了編號(hào)(圖1)。

該圖基于浙江省地理信息公共平臺(tái)網(wǎng)站下載的審圖號(hào)為浙S(2023)28號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)地圖制作，底圖無修改。圖1 雜草稻種子采集地分布圖Fig.1 Distribution of weedy rice seed collection sites

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 遺傳多樣性分析

15個(gè)雜草稻樣品的自交F1代幼苗按照20 cm×20 cm的間距插秧種植于田間，每個(gè)雜草稻樣品種植4行8列共32株，組成15個(gè)小區(qū)。在生長過程中按照《水稻DUS測(cè)試指南》中規(guī)定的性狀描述方法對(duì)表型性狀進(jìn)行記錄。采集各株系葉片，使用CTAB法提取DNA。參照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1433-2014《水稻品種鑒定技術(shù)規(guī)程 SSR標(biāo)記法》中推薦的48對(duì)引物，對(duì)這15個(gè)株系進(jìn)行特異性擴(kuò)增，并進(jìn)行遺傳多樣性分析。PCR反應(yīng)體系為：10×TaqPCR Buffer 1.0 μL，dNTPs 0.1 μL，AccurateTaqDNA Polymerase 0.1 μL，上下游引物各0.1 μL，DNA模板0.1 μL，加水補(bǔ)至10 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，然后95 ℃變性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共計(jì)35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物在聚丙烯酰胺凝膠中電泳90～120 min后進(jìn)行銀染操作，在凝膠成像儀上觀察擴(kuò)增結(jié)果。

1.2.2ALS基因序列分析

取雜草稻葉片，CTAB法提取DNA，在NCBI網(wǎng)站搜索ALS基因的cDNA序列(登錄號(hào)：AB049822)，利用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)如下引物：ALSF，5′-CCATCCGAGCCACACATCGCCTC-3′；ALSR，5′-ACAAACATCATAGGCATACCACTC-3′。

通過PCR擴(kuò)增ALS基因。PCR擴(kuò)增體系為：DNA模板1 μL，10×Buffer 5 μL，25 mmol·L-1MgSO42 μL，2 mmol·L-1dNTPs 5 μL，10 μmol·L-1Primer 各1.5 μL，1 U·μL-1KOD-Plus 1 μL，加水至50 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性2 min，然后94 ℃變性10 s、58 ℃退火30 s、68 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)過1.5%(V/m)瓊脂糖凝膠電泳分離，目的條帶用DNA凝膠回收試劑盒純化后送公司測(cè)序。

1.2.3 除草劑噴施試驗(yàn)

將15個(gè)雜草稻樣品及潔田稻001共同種植于盆中，待水稻植株長至三葉一心期進(jìn)行莖葉噴霧，使用甲咪唑煙酸作為噴施藥劑，噴施劑量為108 g·hm-2，噴霧量為450 L·hm-2。于施藥后15 d觀察并統(tǒng)計(jì)植株生長狀態(tài)及死亡情況。

1.2.4 落粒性調(diào)查

為了高效且準(zhǔn)確地對(duì)比各雜草稻的落粒性，使用數(shù)字測(cè)力計(jì)(ELK-10，伊萊科電氣)對(duì)水稻穗-粒分離力(BTS)進(jìn)行測(cè)量。測(cè)量方法為將數(shù)字測(cè)力計(jì)水平固定在桌面上，用測(cè)力計(jì)上的夾子夾住穗的基部，再用鑷子夾住谷粒，使測(cè)力計(jì)、穗子、谷粒在同一直線上，拉動(dòng)谷粒致其從穗上分離，記錄分離力。在完熟期取樣，每小區(qū)隨機(jī)選取4個(gè)單株，每株隨機(jī)取3個(gè)穗子，每穗均勻選取6個(gè)一次支梗，每支梗隨機(jī)測(cè)量3粒種子的分離力，記錄分離力數(shù)據(jù)，并進(jìn)行計(jì)算分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型性狀調(diào)查結(jié)果與分析

在植株的生長周期內(nèi)分別采集了15個(gè)雜草稻株系的株葉型、株高、粒型、粒長、粒寬等數(shù)據(jù)，使用《水稻DUS測(cè)試指南》中規(guī)定的性狀描述方式對(duì)表型性狀進(jìn)行測(cè)定(表1)，并記錄了各株系的株葉形態(tài)影像(圖2)。對(duì)比結(jié)果表明，湖州地區(qū)雜草稻表型多樣化程度高，15個(gè)雜草稻樣品表型差異顯著。在株葉形態(tài)方面，從緊湊株形到松散株形均有分布；株高相差大，最高的株系株高111.46 cm，最矮的株系僅高89.92 cm，株高相差21.54 cm；播始?xì)v期從72～92 d，最高相差20 d；植株芒長方面，存在長芒、短芒和無芒株系的區(qū)別；在籽粒方面，種皮均為紅色，籽粒形態(tài)表現(xiàn)相近，但在粒長、粒寬上有細(xì)微的差異。

表1 雜草稻的表型數(shù)據(jù)Table 1 Phenotypic data of weedy rice

圖2 雜草稻單株的株葉形態(tài)Fig.2 Leaf morphology of weedy rice plants

使用數(shù)字測(cè)力計(jì)對(duì)雜草稻和對(duì)照潔田稻001、武運(yùn)粳的穗-粒分離力(BTS)進(jìn)行測(cè)量，每個(gè)雜草稻小區(qū)共檢測(cè)12穗，每穗檢測(cè)18粒谷粒的穗-粒分離力，求平均數(shù)得到每個(gè)小區(qū)的平均拉力值(表1)。其中，以潔田稻001為秈稻栽培稻對(duì)照，以武運(yùn)粳為粳稻栽培稻對(duì)照。結(jié)果顯示，湖州地區(qū)的雜草稻穗-粒分離力平均值分布在0.28～0.79 N，均小于栽培稻潔田稻001的1.18 N和武運(yùn)粳的1.68 N。15個(gè)雜草稻株系的平均穗-粒分離力為0.63 N，僅為潔田稻001的53.7%和武運(yùn)粳的37.7%。采用Kruskal-Wallis test進(jìn)行差異顯著性分析，發(fā)現(xiàn)武運(yùn)粳、潔田稻001和15個(gè)雜草稻單株的穗-粒分離力數(shù)據(jù)存在顯著差異(P<0.05)。充分體現(xiàn)了雜草稻落粒性強(qiáng)于栽培稻的特點(diǎn)。

2.2 SSR多態(tài)性分析

將電泳結(jié)果統(tǒng)計(jì)為0-1矩陣，使用Dataformater進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換[10]，再使用Popgen32軟件進(jìn)行分析，得到多態(tài)性分析結(jié)果(表2)。有41對(duì)引物的產(chǎn)物具有多態(tài)性，占總數(shù)的85.4%。在具有多態(tài)性的41對(duì)引物中，共檢測(cè)出104個(gè)等位位點(diǎn)，平均等位基因數(shù)量為2.312 5。呈現(xiàn)單態(tài)位點(diǎn)的引物有7個(gè)，分別是RM443、RM267、RM339、RM17、RM176、RM316和RM7102。多態(tài)性最豐富的引物為RM481，有5個(gè)等位位點(diǎn)(圖3)。多態(tài)信息量(PIC)平均值為0.313 8，最高值0.581 1(引物RM481)，最低值0.110 3(引物RM19)。其中，多態(tài)性高(PIC值>0.5)的引物有2個(gè)(RM219和RM481)；多態(tài)性中等(0.5>PIC>0.25)的引物有23個(gè)；平均PIC值為0.313 8，呈現(xiàn)中等多態(tài)性。平均等位基因數(shù)量為2.312 5，平均有效等位基因數(shù)量為1.577 2，二者差值為0.735 3；等位基因數(shù)量(Na)與有效等位基因數(shù)量(Ne)差值最大的引物是RM208，差值為2.469 4，等位基因分布最為不均；差值最小的引物是RM590，差值為0.008 8，等位基因分布最為均勻。Shannon信息指數(shù)(I)表示群體遺傳多態(tài)度，是一種基于信息理論的測(cè)量指數(shù)，數(shù)值越大，表明遺傳多態(tài)度越高。本研究中I的平均值為0.515 4，最高值1.229 3(引物RM481)，最低值0(引物RM443、RM267、RM339、RM17、RM176、RM316和RM7102)。

表2 SSR引物多態(tài)性分析結(jié)果Table 2 SSR primer polymorphism analysis

M為DNA Marker B 100～600 bp。圖3 RM481標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Amplification results of RM481 marker

2.3 遺傳相似度與聚類分析

使用NTSYS軟件對(duì)SSR結(jié)果進(jìn)行計(jì)算，得到遺傳相似系數(shù)矩陣(表3)和聚類分析圖(圖4)。分析可知，本次搜集的15個(gè)雜草稻單株的平均遺傳相似系數(shù)為0.714 5；最大的遺傳相似系數(shù)為1，分別是編號(hào)為W1、W2、W3和W4，W12和W14，W11、W13和W15的雜草稻，可以認(rèn)為上述各單株組合是同一品種。最小的遺傳相似系數(shù)為0.387 8，在編號(hào)為W7與W10的雜草稻之間產(chǎn)生，表明這2個(gè)單株遺傳距離最遠(yuǎn)。此外，以遺傳相似系數(shù)平均值0.714 5為基數(shù)對(duì)這15個(gè)雜草稻單株進(jìn)行分類，可得到5個(gè)類群(圖4)。分別為Ⅰ(W1、W2、W3、W4、W5、W11、W13、W15)；Ⅱ(W8)；Ⅲ(W9、W10、W12、W14)；Ⅳ(W6)；Ⅴ

表3 雜草稻遺傳相似系數(shù)矩陣Table 3 Matrix of genetic similarity coefficient of weedy rice

聚類分析圖由Ntsys軟件計(jì)算得出，遺傳相似系數(shù)越接近1則表示遺傳相似度越高，越接近0則表示遺傳相似度越低。圖4 15個(gè)雜草稻株系聚類分析圖Fig.4 Cluster analysis of 15 weedy rice lines

(W7)。其中Ⅰ組中，8個(gè)雜草稻單株分別來自東華村(W1、W2、W3、W4、W5)、包橋村(W11)、荊灣村(W13、W15)，它們之間的最大相似系數(shù)為1，最小相似系數(shù)為0.959 2。第Ⅲ組中，4個(gè)雜草稻單株分別來自紫金橋村(W9)、千豐村(W10)、南石橋村(W12)、荊灣村(W14)，它們之間的相似系數(shù)最大值為1，最小值為0.729 2。

2.4 ALS抑制劑類除草劑抗性分析

水稻ALS基因編碼乙酰乳酸合成酶，我們測(cè)序檢測(cè)了15個(gè)雜草稻樣品以及常規(guī)秈稻潔田稻001(深圳潔田模式生物科技有限公司提供)的ALS基因序列。以武運(yùn)粳ALS基因型為粳稻野生型，蜀恢498ALS基因型為秈稻野生型，將潔田稻001基因型設(shè)為抗性型。ALS基因型對(duì)比發(fā)現(xiàn)，15個(gè)雜草稻ALS基因均與秈稻野生型比較相近，推測(cè)這15個(gè)雜草稻株系都存在秈稻血緣。在15個(gè)雜草稻株系的ALS基因上存在2種SNP突變類型，我們將其設(shè)為雜草稻Ⅰ型，其中包括編號(hào)為W9、W10、W12、W15的雜草稻；雜草稻Ⅱ型包括編號(hào)為W1、W2、W3、W4、W5、W6、W7、W8、W11、W13、W14的雜草稻(圖5)。與已知在水稻中能產(chǎn)生抗性突變的氨基酸位點(diǎn)(OsALS，Gly95，Ala96，Ala129，Pro171，Ala179，Arg315，Asp350，Trp548，Ser627，Gly628)[9]進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明，這32個(gè)SNP位點(diǎn)中僅抗性型(潔田稻001基因型)在第1 642、1 643位堿基發(fā)生突變會(huì)產(chǎn)生抗性。這2個(gè)堿基的替換導(dǎo)致水稻乙酰乳酸合成酶第548位點(diǎn)氨基酸由色氨酸突變?yōu)榧琢虬彼?W548M)，該突變使水稻具有對(duì)咪唑啉酮類除草劑的抗性[9]。而粳稻與秈稻野生型、雜草稻Ⅰ型和雜草稻Ⅱ型均未見對(duì)咪唑啉酮類除草劑具有抗性的SNP位點(diǎn)。

圖5 已知位點(diǎn)核苷酸序列對(duì)比Fig.5 Comparison of nucleotide sequences at known sites

以潔田稻001作為陽性對(duì)照，武運(yùn)粳作為陰性對(duì)照，使用甲咪唑煙酸對(duì)對(duì)照和15個(gè)雜草稻株系進(jìn)行莖葉噴施后發(fā)現(xiàn)，大部分雜草稻在7 d后均產(chǎn)生藥害，出現(xiàn)心葉發(fā)黃、扭曲等癥狀，在25 d后，所有雜草稻植株死亡。僅潔田稻001生長狀況不受影響(圖6)。

圖6 除草劑噴施結(jié)果Fig.6 Herbicide spray results

3 討論與總結(jié)

雜草稻對(duì)栽培稻，尤其是對(duì)直播稻的危害，在湖州地區(qū)正在逐年加劇。僅在長興縣，2012-2017年，雜草稻便隨著機(jī)械作業(yè)傳播至全縣所有鄉(xiāng)鎮(zhèn)，總體呈現(xiàn)偏重發(fā)生態(tài)勢(shì)(4.8萬～7.2萬株·hm-2)[11]，有研究[12]表明，當(dāng)雜草稻達(dá)到6萬株·hm-2時(shí)，栽培稻將減產(chǎn)20%，這對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)將是一個(gè)巨大的威脅，而研究雜草稻的發(fā)生有助于找尋解決辦法。關(guān)于雜草稻危害是如何發(fā)生的，前人[13]提出了3個(gè)主要途徑，1)隨著作物的馴化，野生植株適應(yīng)棲息地的環(huán)境；2)栽培品種與當(dāng)?shù)亟壱吧仓觌s交產(chǎn)生；3)栽培品種之間相互雜交產(chǎn)生。正是因?yàn)槠浒l(fā)生途徑較多，導(dǎo)致了各地的雜草稻遺傳多樣性豐富。

表型分析顯示，湖州地區(qū)雜草稻從株葉形態(tài)、株高、播始?xì)v期、芒長度和穗粒分離力多方面展示了豐富的表型性狀，體現(xiàn)了較高的表型多樣性。SSR多態(tài)性分析結(jié)果表明，從湖州地區(qū)采集的雜草稻樣品遺傳多態(tài)性處于中等水平。聚類分析結(jié)果顯示，同一雜草稻株系可能會(huì)跨區(qū)域傳播，例如東華村、包橋村、荊灣村等不同區(qū)縣的雜草稻單株最小相似系數(shù)高達(dá)0.959 2，可以認(rèn)為其遺傳背景高度相似，屬于同一聚類，與寧國云等[11]提出的農(nóng)業(yè)機(jī)械跨區(qū)作業(yè)傳播雜草稻種子的情況較為相似；而同一區(qū)縣的同一個(gè)村中，也會(huì)存在不同來源雜草稻，例如荊灣村的雜草稻，既有Ⅰ型類群的(W13、W15)，也有Ⅲ型類群的(W14)，表明湖州地區(qū)雜草稻來源復(fù)雜，遺傳多樣性豐富。

針對(duì)湖州雜草稻的落粒性檢測(cè)表明，湖州地區(qū)的雜草稻落粒性較強(qiáng)，與對(duì)照品種存在顯著差異，15個(gè)雜草稻株系的平均穗-粒分離力為0.632 8 N，僅為秈稻品種潔田稻001的53.7%和粳稻品種武運(yùn)粳的37.7%。較強(qiáng)的落粒性導(dǎo)致稻谷容易從枝梗上脫落，形成落田谷，導(dǎo)致雜草稻種子的進(jìn)一步泛濫，造成產(chǎn)量的降低和稻米的品質(zhì)下降[14-15]。

傳統(tǒng)雜草稻防除包括人工拔除、播前深翻地、實(shí)施水旱輪作、誘殺雜草稻種子等方法[16]。但是，隨著規(guī)?；瑱C(jī)械化種植的普及推廣，尋求一種適合規(guī)模化，簡單化的防治方法尤為重要。培育抗除草劑水稻品種，使其具有對(duì)特定除草劑的抗性，再與特定除草劑配合使用，即可有效防除雜草稻等近緣雜草。有研究[12]表明，采用抗ALS抑制劑類除草劑的水稻品種防除雜草稻之后，對(duì)比常規(guī)化學(xué)除草產(chǎn)量提高8.54%。通過種植潔田稻001等抗除草劑水稻能有效防除雜草稻，降低雜草稻對(duì)栽培稻的危害，并且在防治雜草稻的同時(shí)，對(duì)該除草劑殺草譜中的雜草亦能起到良好的防除效果，達(dá)到節(jié)本增效的目的。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，應(yīng)當(dāng)采用傳統(tǒng)育種與分子育種相結(jié)合的方法，著手選育抗除草劑新品種，同時(shí)開發(fā)新的除草劑抗性類型，做到品種的有序更新和除草劑的輪換使用，最大限度控制雜草稻危害。