單一及復(fù)合喹諾酮類抗生素脅迫下留蘭香萌發(fā)生長的響應(yīng)及耐受性分析

關(guān)鍵詞：喹諾酮類抗生素；留蘭香；響應(yīng)；耐受性；隸屬函數(shù)

中圖分類號：S682.19；X592；X173 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1672-2043（2024）12-2876-13 doi：10.11654/jaes.2024-0537

抗生素可用于臨床上治療相關(guān)疾病，也可作為生長促進(jìn)劑添加至飼料中。喹諾酮類（Quinolones，QNs）抗生素是臨床上使用的第二大類抗菌藥物，同時(shí)也是常用獸用抗生素之一，其中環(huán)丙沙星（Cipro?floxacin，CIP）、諾氟沙星（Norfloxacin，NOR）和氧氟沙星（Ofloxacin，OFL）是最常用的3種。生物體攝入的QNs抗生素中有高達(dá)70%不能被代謝而排出體外[1]，并隨醫(yī)療及城市生活污水、制藥企業(yè)和農(nóng)牧業(yè)廢水等排放至自然水體中。在世界各國的污水廠中，QNs抗生素也是檢出頻率前五的污染物之一。CIP、OFL、NOR 在各國污水廠中的檢出頻率較高，同時(shí)也是淡水及海洋環(huán)境最常檢出的QNs抗生素[2]。非洲地區(qū)廢水中QNs 抗生素的檢測濃度達(dá)50 μg·L^-1，我國渤海萊州半島、貴州和大連等地檢測到其濃度達(dá)μg·L^-1數(shù)量級，大多數(shù)土壤和沉積物環(huán)境介質(zhì)中的含量為μg·kg^-1數(shù)量級，其中，OFL、CIP 和NOR 在水體和沉積物中最常被檢測到[3-4]。QNs抗生素對生態(tài)環(huán)境的潛在危害[5]已成為環(huán)境領(lǐng)域廣泛關(guān)注的熱點(diǎn)問題。

QNs抗生素對植物種子萌發(fā)和幼苗生長具有顯著的毒性效應(yīng)。采用恒溫保濕培養(yǎng)法研究抗生素對油菜（Brassica campestris）萌發(fā)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，濃度為12.5、25、50、100、200 mg·L^-1的NOR處理均抑制了油菜種子萌發(fā)，200 mg·L^-1處理時(shí)種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢相較于對照組均下降了13%，根長抑制率達(dá)60%[6]。實(shí)驗(yàn)證明CIP 濃度超過1 mg·L^-1 時(shí)，黑麥草（Loliumperenne）種子的發(fā)芽率低于對照組，發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)相對于對照組分別下降50%和30%[7]。類似地，在0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0 mg·L^-1 OFL脅迫紫花苜蓿（Medicago sativa）種子萌發(fā)的毒性試驗(yàn)中，處理組的發(fā)芽率均低于對照組[8]。QNs 抗生素進(jìn)入農(nóng)田系統(tǒng)后，也會影響農(nóng)作物的生長和繁殖。研究表明，0～2mg·L^-1 CIP脅迫下，玉米（Zea mays）的H2O2水平和抗氧化酶活性顯著提高，形態(tài)生理改變，種子產(chǎn)量降低[9]。2 mg·L^-1的OFL處理能夠抑制洋蔥（Allium fistu?losum）的光合作用，破壞葉細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，使葉片黃化[10]。韭菜（Allium tuberosum）在NOR 含量為10mg·kg^-1和100 mg·kg^-1的土壤中培養(yǎng)時(shí)，其葉片中細(xì)胞形狀相對于對照組都發(fā)生了明顯變化，類囊體在低密度區(qū)域膨脹，淀粉粒數(shù)量明顯增加，葉片和根中富集的抗生素含量可達(dá)0.88 mg·kg^-1和0.22 mg·kg^-1[11]。QNs抗生素單一及復(fù)合脅迫的毒性也不同，CIP、恩諾沙星、左氧氟沙星及其復(fù)合物對小麥（Triticum aesti?vum）的短期（20 d）毒性研究發(fā)現(xiàn)，高濃度抗生素復(fù)合物（100 mg·L^-1和300 mg·L^-1）相較于單一脅迫，會顯著提高脂質(zhì)過氧化物含量及抗氧化酶活性，抑制小麥幼苗的生長[12]。可見，QNs抗生素能抑制植物種子的萌發(fā)和幼苗生長，且單一及復(fù)合抗生素對植物的毒性效應(yīng)存在差異。QNs抗生素在農(nóng)村生活污水處理廠進(jìn)水中的檢出濃度普遍較高（可達(dá)65 μg·L^-1）[13]。對我國各地區(qū)的水、土壤和沉積物中抗生素進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，QNs抗生素的檢測濃度可達(dá)數(shù)十微克每升或每千克[14]，且環(huán)境中QNs抗生素的存在形式并非某一特定種類，而往往是多種抗生素復(fù)合存在，隨著QNs抗生素的大量使用，有必要開展mg·L^-1數(shù)量級水平的QNs抗生素單一及復(fù)合污染的生態(tài)毒性研究。

留蘭香（Mentha spicata L.）為隸屬于唇形科薄荷屬的多年生芳香草本植物，廣泛用于室內(nèi)觀賞和城市綠化，具有極高的藥用、食用及經(jīng)濟(jì)價(jià)值[15]。留蘭香原產(chǎn)非洲西北部群島和歐洲南部區(qū)域，在我國主要栽培于江蘇、安徽、四川、貴州等地區(qū)[16]。留蘭香喜濕潤，其生長初期和中期對水分的需求量較大[17]，因此，灌溉用水及土壤中的QNs抗生素會影響其正常生長。污染物進(jìn)入環(huán)境后，不僅能影響植物正常生長，還會嚴(yán)重影響芳香草本植物的產(chǎn)量和品質(zhì)[18-19]，因此，評估QNs抗生素的生態(tài)毒性，對留蘭香生態(tài)種植的順利開展具有指導(dǎo)意義。目前，對留蘭香的生態(tài)毒性研究主要圍繞溫度、水分等自然因素，以及鹽脅迫對留蘭香植株生長及品質(zhì)的影響[20-21]，也有研究表明土霉素能夠影響留蘭香莖的生長、降低葉綠素的含量[22]，但QNs抗生素單一及復(fù)合脅迫對留蘭香種子萌發(fā)及幼苗生長的影響及植物耐受情況尚不明確。因此，有必要就抗生素對留蘭香的生態(tài)毒性效應(yīng)做進(jìn)一步研究。綜上，本文研究典型QNs抗生素CIP、NOR、OFL對留蘭香種子萌發(fā)指標(biāo)和生長特性的影響，旨在為抗生素的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用發(fā)育正常的留蘭香（Mentha spicata L.）種子（千粒質(zhì)量約為0.08 g）由宿遷綠芃種業(yè)科技有限公司提供，于2023年10月采自甘肅酒泉，暫存于冰箱中4 ℃低溫保存。CIP、NOR和OFL來自上海麥克林生化科技股份有限公司，純度為99%。

1.2 種子萌發(fā)試驗(yàn)

挑選大小均一且飽滿的留蘭香種子，經(jīng)75% 乙醇消毒15 min后，用無菌水清洗3～5次去除乙醇，取出并吸干其多余的水分，備用。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)中留蘭香種子對QNs抗生素的耐受濃度并結(jié)合文獻(xiàn)[23-25]，配制CIP、NOR、OFL單一及三者等質(zhì)量復(fù)合溶液，濃度為0.1、1、5、10、20 mg·L^-1，以無菌蒸餾水為對照（CK）。參考國際種子檢測協(xié)會（ISTA）的種子監(jiān)測標(biāo)準(zhǔn)，采用保溫保濕培育法進(jìn)行試驗(yàn)。取墊有2層濾紙的直徑9 cm培養(yǎng)皿，用鑷子將50粒留蘭香種子均勻地排列在培養(yǎng)皿中，分別加入5 mL不同濃度的CIP、NOR、OFL及復(fù)合溶液，每個(gè)處理重復(fù)3次，將培養(yǎng)皿置于恒溫培養(yǎng)箱，設(shè)置溫度為（25±1）℃、光周期為12 h光照/12 h黑暗，光照強(qiáng)度為2 000 lx。發(fā)芽期間每隔2 d更換一次濾紙、沖洗培養(yǎng)皿，隨機(jī)改變留蘭香種子在培養(yǎng)皿中的位置，并添加抗生素溶液保持濕潤[26-28]，及時(shí)剔除霉變的種子，觀察并記錄其發(fā)芽情況（以胚根長于種子1/2作為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)）。CIP、NOR和OFL在培養(yǎng)過程中可能發(fā)生光降解，考慮實(shí)際抗生素濃度變化對種子萌發(fā)的影響，用250 mL錐形瓶盛裝試驗(yàn)濃度的抗生素溶液置于培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)中添加的溶液為同時(shí)放入培養(yǎng)箱內(nèi)錐形瓶中的抗生素溶液。

1.3 分析方法

1.3.1 種子萌發(fā)指標(biāo)的測定

在留蘭香萌發(fā)試驗(yàn)中，將種子放入人工培養(yǎng)箱后的24 h為試驗(yàn)第1天，以連續(xù)3 d種子發(fā)芽數(shù)不再增加視為發(fā)芽結(jié)束（本試驗(yàn)為發(fā)芽14 d結(jié)束），根據(jù)每天發(fā)芽的種子數(shù)，計(jì)算種子的發(fā)芽百分比。計(jì)算培養(yǎng)結(jié)束時(shí)的日平均發(fā)芽率、平均發(fā)芽時(shí)間、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)等。日發(fā)芽種子數(shù)達(dá)到最高峰時(shí)作為發(fā)芽勢計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)[29]，CIP和NOR處理時(shí)以種子萌發(fā)的第4天、OFL和復(fù)合處理時(shí)以第5天的種子發(fā)芽百分比為發(fā)芽勢（GP）。

式中：n 指全部正常發(fā)芽的種子數(shù)；N 指供試種子總數(shù)；Gt 指第t 天發(fā)芽的種子數(shù)；Dt 指相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)；RL 指胚根長；Gd 指總發(fā)芽天數(shù)。

脅迫指數(shù)為正值，表示處理組指標(biāo)值小于對照組，該指標(biāo)被抑制，反之表示對該指標(biāo)起促進(jìn)作用，其絕對值大小反映影響程度?？伤苄灾笖?shù)反映植物對生境的適應(yīng)能力，數(shù)值越大，表明適應(yīng)能力越強(qiáng)[30-31]。

1.3.2 幼苗形態(tài)指標(biāo)的測定

培養(yǎng)完成后取出萌發(fā)后的幼苗，用濾紙吸干其表面水分，用直尺測定胚根長和胚芽長，稱量其鮮質(zhì)量，計(jì)算胚根長、胚芽長和鮮質(zhì)量的抑制率。構(gòu)建CIP、NOR、OFL和復(fù)合物的濃度與種子胚根長、胚芽長和鮮質(zhì)量的抑制率的回歸方程，當(dāng)指標(biāo)的抑制率為50%時(shí)，對應(yīng)的抗生素濃度即為該種抗生素對胚根長、胚芽長和鮮質(zhì)量的半數(shù)抑制濃度（IC₅₀）。

胚根長（RL）、胚芽長（GL）、鮮質(zhì)量（FW）抑制率=（對照組-處理組）/對照組×100% （9）

1.3.3 留蘭香對QNs抗生素耐受性的評價(jià)

根據(jù)模糊數(shù)學(xué)原理，利用隸屬函數(shù)法對留蘭香試驗(yàn)種子萌發(fā)和幼苗形態(tài)指標(biāo)進(jìn)行計(jì)算并排序，綜合評價(jià)QNs抗生素脅迫下種子的耐受性情況[26]。利用公式（10）和公式（11）[32-33]分別計(jì)算留蘭香各指標(biāo)（發(fā)芽勢、日平均發(fā)芽率、平均發(fā)芽時(shí)間、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、胚根長、胚芽長和鮮質(zhì)量）在CIP、NOR和OFL單一及復(fù)合脅迫下的具體隸屬函數(shù)值μ（Xij），根據(jù)測定指標(biāo)的隸屬函數(shù)值，計(jì)算該濃度下所有指數(shù)的平均隸屬函數(shù)值（AMF）。AMF 值越大表示種子在萌發(fā)期對QNs抗生素的綜合耐受性越強(qiáng)，反之更弱。按灰色系統(tǒng)理論要求[34]，將留蘭香種子對抗生素的綜合耐受性和不同QNs抗生素脅迫下8個(gè)指標(biāo)視為一個(gè)整體，即灰色系統(tǒng)。將綜合耐受性指數(shù)作為參考數(shù)列（母序列），各指標(biāo)原始數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理后的值作為比較數(shù)列（子序列），建立灰色系統(tǒng)，計(jì)算各指標(biāo)與其綜合耐受性指數(shù)的關(guān)聯(lián)度并排序（關(guān)聯(lián)序），指標(biāo)的關(guān)聯(lián)度值越大，即表示該指標(biāo)與綜合耐受性的關(guān)聯(lián)密切程度越高[35]。平均隸屬函數(shù)值和灰色關(guān)聯(lián)度計(jì)算公式如下：

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016 對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，SPSS 27 進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）和Pearson 相關(guān)性分析，利用LSD法進(jìn)行多重比較，用Origin 2021擬合回歸曲線、作圖。使用SmartPLS 4.1對QNs抗生素對留蘭香萌發(fā)期指標(biāo)的影響建立偏最小二乘結(jié)構(gòu)方程模型（PLS-SEM）。

2 結(jié)果與分析

CIP、NOR和OFL單一及復(fù)合脅迫下留蘭香培養(yǎng)14 d后的生長狀況如圖1所示，各處理組中幼苗的生長情況差異明顯：OFL及復(fù)合脅迫下生長良好，幼根更粗；CIP和NOR處理組幼苗葉片面積小，葉發(fā)黃，幼根細(xì)，長勢不良。

2.1 單一及復(fù)合QNs抗生素對留蘭香種子發(fā)芽的影響

CIP、NOR和OFL單一及復(fù)合脅迫對留蘭香種子萌發(fā)的影響如圖2所示。各處理組中，留蘭香均在第2天發(fā)芽，說明單一及復(fù)合脅迫未改變種子初始萌發(fā)時(shí)間。QNs抗生素也不影響留蘭香萌發(fā)結(jié)束時(shí)間，第12天后留蘭香種子發(fā)芽數(shù)基本不再增加，但日發(fā)芽種子數(shù)達(dá)到最高峰的時(shí)間不同。CIP和NOR處理時(shí)第4天發(fā)芽種子數(shù)最多，OFL和復(fù)合處理時(shí)第5天的種子發(fā)芽數(shù)最多。

2.2 單一及復(fù)合QNs抗生素對留蘭香種子萌發(fā)指標(biāo)的影響

由表1可知，高濃度的CIP和OFL能夠顯著抑制留蘭香種子的日平均發(fā)芽率（Plt;0.01），20 mg·L^-1處理時(shí)脅迫指數(shù)分別為0.21和0.31；但10～20 mg·L^-1 NOR和復(fù)合處理對日平均發(fā)芽率的抑制作用不顯著。所有萌發(fā)指標(biāo)中，平均發(fā)芽時(shí)間的可塑性指數(shù)變化最大（0.040～0.642），即留蘭香的平均發(fā)芽時(shí)間對不同QNs的響應(yīng)不同。0.1 mg·L^-1 QNs處理時(shí)均能縮短平均發(fā)芽時(shí)間，20 mg·L^-1 CIP和OFL能顯著縮短平均發(fā)芽時(shí)間，而20 mg·L^-1 NOR和復(fù)合處理則顯著延長平均發(fā)芽時(shí)間（Plt;0.05）。高濃度QNs抗生素對留蘭香發(fā)芽勢的影響不同，0.1 mg·L^-1 CIP能顯著提高留蘭香發(fā)芽勢（脅迫指數(shù)為-0.55，Plt;0.01），20 mg·L^-1 NOR 和OFL處理極顯著降低發(fā)芽勢（脅迫指數(shù)均為0.59，Plt;0.01），但20 mg·L^-1 CIP和復(fù)合處理時(shí)的發(fā)芽勢高于CK組。

低濃度的CIP和NOR處理能顯著提高留蘭香的發(fā)芽指數(shù)，0.1 mg·L^-1處理時(shí)發(fā)芽指數(shù)最高（脅迫指數(shù)分別為-0.17和-0.20，Plt;0.01）；20 mg·L^-1脅迫下，除OFL顯著降低留蘭香發(fā)芽指數(shù)（脅迫指數(shù)為0.38）外，其他處理對留蘭香發(fā)芽指數(shù)均無顯著抑制作用。留蘭香的所有萌發(fā)指標(biāo)中，活力指數(shù)的可塑性指數(shù)變化最小（范圍為0.732～0.863），說明留蘭香的活力指數(shù)對QNs 的耐受性差別不大。活力指數(shù)隨著CIP 和NOR濃度的增加先升后降，0.1 mg·L^-1處理時(shí)發(fā)芽指數(shù)最高（脅迫指數(shù)分別為-0.32和-0.36，Plt;0.01）；OFL和復(fù)合處理時(shí)，活力指數(shù)隨濃度的增加而逐漸降低，20 mg·L^-1處理時(shí)活力指數(shù)的抑制程度最高（脅迫指數(shù)分別為0.86和0.73）。通過計(jì)算留蘭香萌發(fā)指標(biāo)的可塑性指數(shù)比較各萌發(fā)指標(biāo)的可塑性程度，萌發(fā)可塑性指數(shù)大小為OFLgt;CIPgt;復(fù)合gt;NOR。

2.3 單一及復(fù)合QNs抗生素對留蘭香幼苗生長的影響

CIP和NOR對留蘭香胚根長和胚芽長的影響如圖3A 和圖3B 所示，0.1 mg·L^-1處理均能促進(jìn)留蘭香種子胚根的生長；較于CK 組，1～20 mg·L^-1處理均能顯著抑制留蘭香種子胚根的生長（Plt;0.05），且濃度越高抑制作用越強(qiáng)。試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)OFL和復(fù)合處理均能抑制留蘭香胚根的生長，且濃度越高抑制作用越大，20 mg·L^-1 OFL和復(fù)合脅迫下胚根長較CK組分別下降了78%和73%（圖3C和圖3D）。不同濃度的QNs抗生素對留蘭香胚芽的作用不同。5 mg·L^-1 CIP極顯著促進(jìn)胚芽的生長（Plt;0.01），而其他濃度的CIP對留蘭香種子胚芽的生長均無顯著作用（Pgt;0.05）；NOR對留蘭香種子胚芽呈低促高抑的效應(yīng)，0.1 mg·L^-1 NOR促進(jìn)留蘭香種子胚芽的生長，隨濃度升高對胚芽的抑制作用增強(qiáng)；0.1～10 mg·L^-1 復(fù)合處理時(shí)能促進(jìn)留蘭香種子胚芽的生長，而20 mg·L^-1 處理抑制了留蘭香種子胚芽的生長。0.1～5 mg·L^-1 OFL能抑制留蘭香種子胚芽的生長，而10～20 mg·L^-1 處理能促進(jìn)留蘭香種子胚芽的生長。

如圖4所示，相較于CK組，0.1 mg·L^-1 CIP和復(fù)合處理對留蘭香鮮質(zhì)量無顯著抑制作用，而高濃度處理時(shí)能抑制留蘭香鮮質(zhì)量，20 mg·L^-1處理時(shí)鮮質(zhì)量較CK極顯著降低（Plt;0.01）。NOR和OFL處理時(shí)鮮質(zhì)量整體呈增加趨勢，且處理濃度分別為0.1 mg·L^-1和10mg·L^-1時(shí)鮮質(zhì)量最大。

留蘭香各形態(tài)指標(biāo)對QNs抗生素的敏感度不同，通過QNs抗生素脅迫留蘭香種子胚根、胚芽和鮮質(zhì)量的生長抑制率擬合回歸方程計(jì)算IC50（表2）。QNs抗生素濃度對胚根長抑制率回歸方程的相關(guān)系數(shù)（R²）均大于0.9，相關(guān)性好，IC₅₀值大小排序?yàn)镺FLNORgt;復(fù)合gt;CIP。胚芽長和鮮質(zhì)量的IC₅₀值較大，無法通過回歸方程計(jì)算，胚根長可作為QNs抗生素對留蘭香生態(tài)毒性的敏感指標(biāo)。留蘭香萌發(fā)期各形態(tài)指標(biāo)的可塑性指數(shù)大小為復(fù)合（1.449）gt;OFL（1.374）gt;NOR（1.124）gt;CIP（0.849）。萌發(fā)期各指標(biāo)的累計(jì)可塑性指數(shù)大小為OFL（4.448）gt;復(fù)合（3.468）gt;CIP（3.071）gt;NOR（3.038）。

2.4 留蘭香不同指標(biāo)與濃度間及各指標(biāo)間的相關(guān)性和PLS-SEM分析

如圖5所示，留蘭香種子的活力指數(shù)、胚根長與QNs抗生素濃度極顯著負(fù)相關(guān)（Plt;0.01），線性關(guān)系良好（| r |gt;0.6）。除CIP處理外，其他處理的胚芽長與濃度顯著相關(guān)（Plt;0.05）。OFL處理下與濃度相關(guān)的指標(biāo)最多，該處理下發(fā)芽指數(shù)、胚根長與濃度極顯著負(fù)相關(guān)（Plt;0.01），胚芽長與濃度顯著正相關(guān)（Plt;0.05）。各處理組中日平均發(fā)芽率與平均發(fā)芽時(shí)間均呈極顯著正相關(guān)（Plt;0.01）。

PLS-SEM探究QNs抗生素對留蘭香種子的潛在變量（萌發(fā)指標(biāo)和幼苗形態(tài)指標(biāo)）影響發(fā)現(xiàn)，QNs抗生素濃度對留蘭香種子萌發(fā)和幼苗生長有顯著負(fù)效應(yīng)，且對萌發(fā)的抑制程度大于幼苗生長，萌發(fā)指標(biāo)與形態(tài)指標(biāo)呈極顯著正相關(guān)（Plt;0.01）（圖6）。該模型共線性指數(shù)（VIF）均小于10，不存在共線性問題，區(qū)別效度（Discriminant validity）中HTMT 指數(shù)均小于0.90，模型擬合程度較好，結(jié)果可信。

2.5 QNs 抗生素脅迫下留蘭香的耐受性及各指標(biāo)與耐受性的關(guān)聯(lián)度分析

指標(biāo)的平均隸屬函數(shù)值可綜合評價(jià)留蘭香萌發(fā)期對QNs 抗生素耐受性大?。ū?），0.1 mg·L^-1 CIP、0.1 mg·L^-1 NOR、CK組OFL和5 mg·L^-1復(fù)合處理時(shí)指標(biāo)的平均隸屬函數(shù)值最大，耐受性最高；綜合各平均隸屬函數(shù)值，比較不同QNs抗生素的綜合處理耐受性大小為OFLgt;復(fù)合gt;CIPgt;NOR。隸屬函數(shù)方法評價(jià)結(jié)果與可塑性指數(shù)法評價(jià)結(jié)果一致，進(jìn)一步解釋了圖1各處理組生長情況的差異，QNs抗生素對留蘭香的毒性為OFLlt;復(fù)合

利用灰色關(guān)聯(lián)度分析法研究各指標(biāo)與對QNs抗生素綜合耐受度的關(guān)聯(lián)程度，各QNs抗生素處理組的指標(biāo)與綜合耐受關(guān)聯(lián)度大小順序不同，關(guān)聯(lián)度最高的5個(gè)指標(biāo)的關(guān)聯(lián)度值均大于0.68（圖7A）。綜合各指標(biāo)QNs抗生素耐受性關(guān)聯(lián)度的主成分分析可知，留蘭香對QNs抗生素綜合耐受性的影響主要與日平均發(fā)芽率、活力指數(shù)、胚根長、鮮質(zhì)量和胚芽長密切相關(guān)（圖7B）。鑒于前人對種子萌發(fā)過程中耐受性的評價(jià)方法，可將發(fā)芽率、胚根長、鮮質(zhì)量和胚芽長作為抗生素耐受性評價(jià)的關(guān)鍵指標(biāo)。

3 討論

3.1 QNs 抗生素濃度對留蘭香種子萌發(fā)和幼苗生長的影響

抗生素對種子萌發(fā)的影響存在“低濃度下促進(jìn)和高濃度下抑制”的雙重效應(yīng)[36-37]。植物種子在萌發(fā)過程中受到污染物的影響時(shí)，其可通過自身代謝，防止、降低或修復(fù)由逆境造成的傷害[38]。本研究發(fā)現(xiàn)，低濃度CIP和NOR處理促進(jìn)發(fā)芽，此時(shí)留蘭香種子的萌發(fā)及形態(tài)指標(biāo)的響應(yīng)變化，有助于其對QNs抗生素耐受性的提高，這與其他類抗生素脅迫植物種子萌發(fā)的結(jié)果一致[39-40]。造成低濃度促進(jìn)現(xiàn)象的原因可能是低濃度的污染脅迫可提高胚的生理活性，促進(jìn)萌發(fā)[41]；也可能是因?yàn)橹参锎藭r(shí)產(chǎn)生的γ-氨基丁酸（GABA）可增強(qiáng)α-淀粉酶活性，加速可溶性糖和其他營養(yǎng)物質(zhì)的產(chǎn)生，為種子萌發(fā)提供能量，增強(qiáng)種子活力，為后續(xù)幼苗的生長奠定基礎(chǔ)[42]。

當(dāng)抗生素濃度在植物種子體內(nèi)的積累超出其生理耐受性時(shí)，高濃度的抗生素會抑制淀粉酶、蛋白酶的活性[43]，同時(shí)抑制種子內(nèi)儲藏的淀粉和蛋白質(zhì)的分解，使活性氧清除系統(tǒng)被破壞，保護(hù)酶系統(tǒng)失衡，抑制胚芽和胚根的生長，使幼苗生長受到抑制[33]。

3.2 QNs 抗生素種類對留蘭香種子萌發(fā)及幼苗生長的影響

不同種類QNs抗生素對留蘭香種子萌發(fā)和幼苗生長的影響也不同。種皮在種子萌發(fā)過程中對QNs抗生素的阻礙程度的差異，與QNs抗生素理化性質(zhì)有關(guān)。有研究表明，脂水分配系數(shù)（lg Kow）可能是影響抗生素植物毒性的最重要因素，其次是相對分子質(zhì)量（Molecular mass，MW）[44-45]。本研究表明，3種QNs抗生素對留蘭香的毒性大小為NORgt;CIPgt;OFL，這與閆嘉寧等[46]關(guān)于NOR、CIP和OFL對蛋白核小球藻的毒性研究結(jié)果一致。QNs抗生素的毒性與各自的lg Kow正相關(guān)，而與MW 負(fù)相關(guān)。NOR 結(jié)構(gòu)中含有脂肪鏈烴（疏水性官能團(tuán)乙基），比CIP和OFL具有更高的疏水性和吸附系數(shù)[2]，從而增加了與植物根細(xì)胞的接觸機(jī)會，因此在培養(yǎng)過程中可能更易吸附在根上，抑制根的生長。研究表明，親水性有機(jī)外源物（lg K_ow 1～4）很容易被根部吸收并轉(zhuǎn)運(yùn)[47]，而QNs 抗生素的lg K_ow通常小于1，很難在植物組織中轉(zhuǎn)運(yùn)[48]。種皮在種子的萌發(fā)過程中發(fā)揮著重要的保護(hù)作用，可避免抗生素脅迫對種子發(fā)芽產(chǎn)生的不利影響，留蘭香種子的種皮對QNs抗生素阻礙作用的差異導(dǎo)致QNs抗生素毒性的不同。QNs抗生素脅迫下萌發(fā)及形態(tài)指標(biāo)的可塑性指數(shù)增加，可能是植物通過各指標(biāo)水平提高達(dá)到補(bǔ)償?shù)淖饔茫跃S持自身正常生長，提高對QNs抗生素的耐受程度。本研究初步探索了QNs抗生素單一及復(fù)合形式對留蘭香種子萌發(fā)的毒性效應(yīng)，結(jié)果顯示復(fù)合處理的生態(tài)毒性介于單一脅迫之間。3種抗生素的毒性相互作用類型與變化趨勢和抗生素混合體系組分濃度比、濃度范圍和種類有關(guān)[46]。

4 結(jié)論

（1）環(huán)丙沙星（CIP）、諾氟沙星（NOR）脅迫對留蘭香的日平均發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、胚根長等指標(biāo)存在低促高抑的雙重效應(yīng)，喹諾酮類抗生素對萌發(fā)指標(biāo)影響程度大于幼苗形態(tài)指標(biāo)；胚根長的半數(shù)抑制濃度小于胚芽長和鮮質(zhì)量，可作為對留蘭香生態(tài)毒性的敏感指標(biāo)。

（2）各指標(biāo)與喹諾酮類抗生素濃度的相關(guān)程度不同，活力指數(shù)和胚根長與濃度極顯著負(fù)相關(guān)（Plt;0.01），氧氟沙星（OFL）脅迫下與濃度相關(guān)的指標(biāo)最多。

（3）留蘭香對喹諾酮類抗生素的耐受性大小為OFLgt;復(fù)合gt;CIPgt;NOR。留蘭香5 項(xiàng)指標(biāo)與耐受性密切相關(guān)，關(guān)聯(lián)度大小為日平均發(fā)芽率gt;活力指數(shù)gt;胚根長gt;鮮質(zhì)量gt;胚芽長，發(fā)芽率、胚根長、鮮質(zhì)量和胚芽長可作為留蘭香對抗生素耐受性評價(jià)的關(guān)鍵指標(biāo)。