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      氟馬替尼耐藥K562細(xì)胞株耐藥機(jī)制的初步探討

      2024-01-17 12:14:52黃繼賢何立風(fēng)李玉權(quán)
      當(dāng)代醫(yī)藥論叢 2023年24期
      關(guān)鍵詞:細(xì)胞株激酶凝膠

      肖 捷,黃繼賢,何立風(fēng),李玉權(quán),何 瑩,喻 亮?

      (1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬粵北人民醫(yī)院體檢中心,廣東 韶關(guān) 512025;2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬粵北人民醫(yī)院血液內(nèi)科,廣東 韶關(guān) 512025 ;3.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬粵北人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心,廣東 韶關(guān) 512025 ;4.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院血液內(nèi)科,廣東 清遠(yuǎn) 511500)

      慢性髓性白血?。–hronic Myeloid Leukemia,CML)是成年人群最常見(jiàn)的白血病之一,是嚴(yán)重依賴于單一基因變異的獲得性克隆性骨髓增殖性腫瘤[1-2]。持續(xù)性激活的酪氨酸激酶途徑導(dǎo)致突變的造血干細(xì)胞與正常的造血干細(xì)胞相比具有增殖優(yōu)勢(shì),并逐漸取代正常造血干細(xì)胞[3]。酪氨酸激酶抑制劑(Tyrosinekinase inhibitors,TKI)的應(yīng)用,已經(jīng)明顯改變了CML 的自然病程,顛覆了既往的傳統(tǒng)治療模式[4]。研究發(fā)現(xiàn),充分合理使用TKI 治療的CML 患者,如能獲得良好的治療反應(yīng),其預(yù)期壽命接近正常人群[5]。然而,20 余年來(lái)的臨床實(shí)踐證明,經(jīng)過(guò)第一代TKI伊馬替尼治療后有近40% 的CML 患者產(chǎn)生耐藥[6],治療反應(yīng)差,導(dǎo)致疾病進(jìn)展,遠(yuǎn)期預(yù)后不佳。甲磺酸氟馬替尼(flumatinib,F(xiàn)L)是我國(guó)近年來(lái)研發(fā)的、擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新一代TKI。相較于一代TKI 伊馬替尼,F(xiàn)L 的臨床試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)其療效更好且安全性接近[7]。因此,本課題組在前期研究成功體外誘導(dǎo)FL 耐藥人CML 細(xì)胞株(K562-RF)的基礎(chǔ)上,對(duì)其耐藥機(jī)制進(jìn)行了初步探討,現(xiàn)報(bào)告如下。

      1 主要儀器和試劑

      1.1 主要儀器

      PowerPac Basic 電泳儀(美國(guó)Bio-Rad 公司);電子分析天平(德國(guó)Sartorius 公司);C170i 型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、Centrifuge 5430 R 和Centrifuge 5910 R 低 溫 離 心 機(jī)(德 國(guó)eppendorf 公 司);MS 3 型 旋渦振蕩器和ROCKER 2D D 搖床(德國(guó)IKA 公司);XB 100 型制冰機(jī)(寧波格蘭特制冷設(shè)備制造有限公司);IX83 型熒光倒置生物顯微鏡(日本Olympus 公司);ECLIPSE Ts2 型倒置顯微鏡(日本Nikon 公司);Multiskan Sky 酶標(biāo)儀和1300 A2 型生物安全柜(美國(guó)ThermoFisher 公司);ALLIANCE Q9 MINI 化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(英國(guó)UVITEC 公司)。

      1.2 主要材料和試劑

      K562 細(xì)胞株從中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)購(gòu)得;FL 由江蘇豪森藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供;1640 培養(yǎng)基和特級(jí)胎牛血清均為美國(guó)Invitrogen公司的產(chǎn)品;phospho-EGFR(Tyr1092)免疫標(biāo)記抗體為碧云天公司的產(chǎn)品;多藥耐藥相關(guān)蛋白4(MRP4)單克隆抗體為Proteintech 公司的產(chǎn)品;GAPDH 兔一抗和二抗均為美國(guó)Cell Signaling Technology (CST)公司的產(chǎn)品。

      1.3 方法

      1.3.1 耐藥細(xì)胞株的建立、保存和復(fù)蘇 K562-RF 細(xì)胞由本課題組前期通過(guò)低濃度FL 與K562 細(xì)胞共培養(yǎng)獲得,傳代時(shí)逐漸增加FL 的濃度,最終誘導(dǎo)出耐藥濃度為53 nmol/L 的K562-RF 細(xì)胞,置于液氮罐中長(zhǎng)期保存。在Western blot 試驗(yàn)前半個(gè)月,取出液氮凍存罐中的K562 和K562-RF 細(xì)胞,在水浴箱中復(fù)蘇后再次進(jìn)行培養(yǎng)、傳代和備用。

      1.3.2 Western blot 試驗(yàn)分析細(xì)胞中相關(guān)蛋白的表達(dá)

      1.3.2.1 提取蛋白質(zhì) 取二甲基亞砜(DMSO)和藥物處理后的K562 細(xì)胞與K562-RF 細(xì)胞,以RIPA 裂解液進(jìn)行冰浴裂解,離心后提取蛋白質(zhì),通過(guò)BCA 法使用酶標(biāo)儀檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度,取等量蛋白加入上樣緩沖液100 ℃金屬浴5 min 使蛋白變性后,立即置于冰浴中冷卻,并于半小時(shí)內(nèi)上樣。

      1.3.2.2 電泳凝膠的制備 依據(jù)蛋白分子量的分離范圍制備不同濃度的SDS- 聚丙烯酰胺凝膠,灌膠后制備10% 濃縮膠,轉(zhuǎn)移至電泳槽上樣后進(jìn)行電泳。

      1.3.2.3 Western blot 試驗(yàn) 電泳完成后卸下凝膠板,切膠后將裁剪好的PVDF 膜蓋于凝膠上,蓋上轉(zhuǎn)膜板,置于轉(zhuǎn)膜槽漂洗后進(jìn)行一抗封閉,孵育過(guò)夜,完成后進(jìn)行二抗室溫孵育1 h,取出PVDF 膜,加ECL 顯色液后使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行成像,曝光時(shí)間依據(jù)蛋白發(fā)光的靈敏度設(shè)定,獲取顯影圖像后保存。

      1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

      研究中所得的數(shù)據(jù)通過(guò)Graphpad Prism 9.3 軟件進(jìn)行作圖和分析,采用SPSS 18 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的分析,組間比較采用t檢驗(yàn)。

      2 結(jié)果

      Western blot 試驗(yàn)結(jié)果顯示(圖1,A),經(jīng)氟馬替尼處理后,K562 細(xì)胞中人磷酸化表皮生長(zhǎng)因子受體(p-EGFR)的表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)(圖1,C),而K562-RF 細(xì)胞中p-EGFR 的表達(dá)水平雖有下降但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(圖1,D)。研究結(jié)果顯示,在正常培養(yǎng)環(huán)境中,K562 細(xì)胞中MRP4 蛋白表達(dá)較低,而K562-RF 細(xì)胞中MRP4 蛋白表達(dá)水平與K562 細(xì)胞相比顯著增加(P<0.01)(圖1,B),氟馬替尼處理后,K562 細(xì)胞中MRP4 蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01),而K562-RF 細(xì)胞中MRP4 表達(dá)則明顯下降(P<0.05)(圖1,D)。

      圖1 K562 和K562-RF 細(xì)胞中p-EGFR 蛋白與MRP4 的表達(dá)

      3 討論

      CML 的耐藥機(jī)制包括BCR-ABL1 依賴性和非BCR-ABL1 依賴性兩種情況。CML 患者發(fā)生BCRABL1 激酶區(qū)突變?nèi)允悄壳耙阎@得性TKI 耐藥的主要機(jī)制。而關(guān)于BCR-ABL1 激酶區(qū)突變導(dǎo)致耐藥的原因尚不清楚[8]。TKI 的治療效果取決于藥物與其分子靶點(diǎn)的接近程度。在藥物靶向BCR-ABL1 的過(guò)程中,足夠的TKI 藥物濃度進(jìn)入CML 細(xì)胞內(nèi)部對(duì)于達(dá)到治療效果是至關(guān)重要的。藥物穿過(guò)細(xì)胞膜的運(yùn)動(dòng)主要由藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)[9]。TKI 在細(xì)胞中流入和藥物流出之間的平衡對(duì)TKI 抑制BCR-ABL1 起到?jīng)Q定性的作用,這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的變化可以解釋TKI 攝取無(wú)效和/ 或TKI 從細(xì)胞中過(guò)度排出引起的耐藥現(xiàn)象[10]。大多數(shù)藥物自由擴(kuò)散穿過(guò)細(xì)胞膜的能力較低,因?yàn)樗鼈兊倪\(yùn)動(dòng)不依賴于ATP,而是由溶質(zhì)載體(SLC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)。ATP 結(jié)合盒(ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)代謝物、化療藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)[11]。這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的過(guò)度表達(dá)可降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度,影響其有效性[12]。我們的研究發(fā)現(xiàn),K562-RF 細(xì)胞在正常培養(yǎng)環(huán)境下MRP4 表達(dá)較未耐藥細(xì)胞K562 顯著增強(qiáng),而氟馬替尼處理后K562-RF細(xì)胞的MRP4 表達(dá)明顯減弱,但K562 細(xì)胞的表達(dá)卻顯著增強(qiáng),提示MRP4 與氟馬替尼耐藥CML 細(xì)胞株的耐藥機(jī)制可能有關(guān)。

      表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)發(fā)生磷酸化,繼而導(dǎo)致下游信號(hào)通路的激活,也可能與FL 耐藥CML 細(xì)胞株的耐藥機(jī)制有關(guān)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞的有絲分裂由多個(gè)蛋白激酶家族調(diào)控[13],在復(fù)雜的調(diào)控中一些激酶的過(guò)度表達(dá)、激活或突變會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)失控甚至轉(zhuǎn)化為腫瘤[14]。在比較K562 與K562-RF 細(xì)胞中不同信號(hào)通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)水平過(guò)程中,我們發(fā)現(xiàn)氟馬替尼處理后的K562 細(xì)胞p-EGFR 表達(dá)顯著下降,而K562-RF 細(xì)胞的p-EGFR 表達(dá)下降不明顯,提示p-EGFR 與氟馬替尼耐藥CML 細(xì)胞株的耐藥機(jī)制可能有關(guān)。作為重要的生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶,EGFR 可以使細(xì)胞內(nèi)外部進(jìn)行通訊,從而決定有絲分裂的開(kāi)始[15]。同時(shí),EGFR 的激活也會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子STAT3 的磷酸化。p-STAT3 能夠進(jìn)入細(xì)胞核,調(diào)節(jié)特定基因的表達(dá),從而影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活。p-STAT3 的過(guò)度激活已被發(fā)現(xiàn)與腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化、耐藥和逃逸凋亡等現(xiàn)象相關(guān)。這些現(xiàn)象提示在FL 壓力下,細(xì)胞通過(guò)增強(qiáng)EGFR 的磷酸化水平來(lái)適應(yīng)并抵抗藥物的影響。這種耐藥性的產(chǎn)生可能與這些蛋白在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中的關(guān)鍵作用有關(guān)。

      綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)K562-RF 細(xì)胞中的耐藥相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MRP4 和p-EGFR 表達(dá)水平升高,與FL耐藥可能相關(guān)。雖然本研究對(duì)氟馬替尼耐藥CML 細(xì)胞株的耐藥機(jī)制進(jìn)行了初步探討,但仍有許多工作需要完成才能闡明其耐藥機(jī)制。在下一步的研究中,我們將進(jìn)一步探討相關(guān)激酶信號(hào)通路的表達(dá)情況,探討和分析CML 耐藥的可能機(jī)制,探索CML 抗腫瘤治療的潛在新靶點(diǎn)。

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