醫(yī)用自交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠預(yù)防盆腔術(shù)后粘連的作用
——白兔子宮角模型研究

樂 章，王云云，宋文俊，陳永昌，舒曉正?，吳 燕

（1.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013 ；2.常州百瑞吉生物醫(yī)藥股份有限公司，江蘇 常州 213125）

術(shù)后粘連是當(dāng)前盆腔手術(shù)后最為常見的并發(fā)癥，是受損傷器官與周圍組織之間的異常纖維化連接；形成的常見原因有創(chuàng)傷、感染、缺血和異物反應(yīng)等；嚴(yán)重的盆腔粘連會導(dǎo)致疼痛、不孕、腸粘連、慢性炎癥等后果，因此積極預(yù)防盆腔手術(shù)后粘連具有積極意義[1-8]。

醫(yī)用自交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠是常州百瑞吉生物醫(yī)藥股份有限公司研發(fā)的一種新型交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠，臨床試驗(yàn)表明該產(chǎn)品具有良好的預(yù)防盆腔術(shù)后粘連的效果[9]；但尚缺乏實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)的支持。因此，本文采用標(biāo)準(zhǔn)的白兔子宮角模型（Uterine Horn Model），評價(jià)醫(yī)用自交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠預(yù)防盆腔術(shù)后粘連的有效性及安全性，進(jìn)一步為醫(yī)用自交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠的臨床應(yīng)用提供可靠的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

采用清潔級新西蘭白兔24 只，體重2.0 ～3.0（2.49±0.26）kg，購自山東青島今墨堂百福泰生物技術(shù)有限公司 (山東省膠南市大崮山)。兔子到達(dá)后分籠，在室溫20 ℃左右、相對濕度為30% ～70%、光/ 暗周期為12 h/ 12 h 的環(huán)境中飼養(yǎng)。飼喂所用的兔子專用飼料購自協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限公司（南京市江寧區(qū)谷里工業(yè)園聚緣路11 號）。由有經(jīng)驗(yàn)的動物護(hù)理人員每天進(jìn)行護(hù)理監(jiān)測。在經(jīng)過3 天的環(huán)境適應(yīng)期后，讓兔子禁食過夜，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑與儀器

醫(yī)用自交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠（自交聯(lián)凝膠）（商品名：海瑞吉?）為常州百瑞吉生物醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品；0.1% 美蘭溶液購自常德比克曼生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動物造模和分組處理 參照J(rèn)ohn DB 等人的方法[10]，建立白兔子宮角模型（Uterine Horn Model）：白兔于手術(shù)當(dāng)天稱重，肌內(nèi)注射3% 戊巴比妥鈉（3 mg/kg）進(jìn)行麻醉。手術(shù)區(qū)域去毛，涂敷1%碘伏進(jìn)行消毒。在無菌室中進(jìn)行手術(shù)操作。麻醉后的白兔仰臥位固定于專用手術(shù)臺，以1% 碘伏再次消毒后，用無菌洞巾覆蓋手術(shù)區(qū)域。切開皮膚，沿腹白線打開腹腔，暴露雙側(cè)子宮和輸卵管，定位子宮角。測量并記錄每側(cè)子宮角的直徑，只有子宮角直徑≥3 mm以上的白兔可繼續(xù)用于實(shí)驗(yàn)。使用10 號手術(shù)刀刀片，自子宮角處開始，在輸卵管方向1 cm 和子宮體方向4 cm 的范圍內(nèi)，反復(fù)刮擦20 次左右，至漿膜面出現(xiàn)肉眼可見點(diǎn)狀出血為止。進(jìn)行子宮和輸卵管刮傷的操作者對于每只動物將接受的處理均不知情，以避免由主觀因素引起的損傷程度不同對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。然后，將刮傷的子宮和輸卵管放回到原來的自然解剖部位。組織刮傷后，動物被隨機(jī)進(jìn)行以下分組/ 處理：（1）PBS 對照組，術(shù)后每側(cè)損傷處噴淋無菌PBS 溶液2.5 mL，6 只；（2）自交聯(lián)凝膠5 mL 組，每側(cè)損傷處涂敷2.5 mL 自交聯(lián)凝膠，6 只；（3）自交聯(lián)凝膠10 mL 組，每側(cè)損傷處涂敷2.5 mL 自交聯(lián)凝膠，然后在關(guān)閉腹壁切口前，用注射器將5 mL 自交聯(lián)凝膠（實(shí)驗(yàn)樣品）從切口的尾端處注入腹腔，6 只；最后，使用4 號慕絲線連續(xù)縫合肌層和皮膚。另外，還設(shè)有假手術(shù)對照組（6 只），該組白兔只做腹部切開和縫合，不做其他處理。術(shù)后每只白兔均肌內(nèi)注射頭孢曲松（0.1 mg/kg），24 h 后再次注射。白兔蘇醒后回籠正常飼養(yǎng)，每天觀察記錄精神狀態(tài)和進(jìn)食、飲水等一般情況，并檢查手術(shù)切口愈合情況。該研究整個(gè)過程符合《赫爾辛基宣言》的原則。

1.3.2 大體情況觀察 在術(shù)后飼養(yǎng)過程中，觀察各組白兔存活、腹部切口愈合、有無并發(fā)癥、飲食和體重等情況。在術(shù)后2 周（±1 天），通過吸入CO2處死白兔，稱量并記錄體重。打開腹腔，觀察主要臟器的位置和外觀，以及有無腹腔積液和殘留實(shí)驗(yàn)樣品等大體情況。

1.3.3 測定子宮輸卵管粘連長度 暴露子宮和輸卵管，確定子宮輸卵管自身或與周圍臟器的粘連，拍照留存。隨即使用游標(biāo)卡尺測量每處粘連的長度，對粘連部位和長度進(jìn)行詳細(xì)記錄；將兩側(cè)子宮輸卵管粘連長度相加，作為該只動物的術(shù)后粘連長度。在操作中，粘連長度的測量者對于所測動物的實(shí)驗(yàn)分組不知情。

1.3.4 比較輸卵管通暢程度 粘連測量結(jié)束后，在每側(cè)距子宮角1 cm 的子宮體處，用注射器朝向遠(yuǎn)端將0.1%美蘭溶液注入子宮體腔內(nèi)，觀察美蘭溶液進(jìn)入輸卵管及從其遠(yuǎn)端流出的情況；參照周曉娜等[11]的方法，對輸卵管的通暢程度進(jìn)行評分（評分標(biāo)準(zhǔn)見表1），確定該實(shí)驗(yàn)動物的輸卵管通暢指數(shù)。

表1 輸卵管通暢程度評分標(biāo)準(zhǔn)

1.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用ANOVA post hoc test 方法（Fisher’s protected least significant difference），對各組動物子宮輸卵管粘連長度和輸卵管通暢指數(shù)進(jìn)行比較，P＜0.05 被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察

在整個(gè)術(shù)后觀察過程中，各組白兔均正常存活，腹部切口愈合正常；沒有任何一只白兔出現(xiàn)并發(fā)癥；各組白兔的飲食和體重均正常。處死白兔后，大體觀察情況總結(jié)如表2。

2.2 子宮和輸卵管術(shù)后粘連

開腹后，所見典型的子宮體粘連情況如圖1A 所示。其中，假手術(shù)對照組無粘連；與假手術(shù)對照組相比，PBS 對照組的粘連長度[（17.93±10.89）mm]更大（P＜0.001）；5 mL 自交聯(lián)凝膠組的粘連長度[（4.17±6.46）mm] 和10 mL 自交聯(lián)凝膠組的粘連長度[（1.50±2.51）mm] 與PBS 對照組相比，均有顯著減?。ň鶠镻＜0.01）；10 mL 自交聯(lián)凝膠組的粘連長度比5 mL 自交聯(lián)凝膠組稍小，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖1B）。

2.3 術(shù)后輸卵管通暢程度

通過在輸卵管子宮端注射美蘭溶液評估輸卵管通暢情況（圖2A），各組術(shù)后輸卵管通暢指數(shù)的判斷如圖2B 所示。其中， PBS 對照組的通暢指數(shù)（0.67±0.52）最低，表明術(shù)后輸卵管阻塞明顯；與PBS 對照組相比，5 mL 和10 mL 自交聯(lián)凝膠組的通暢指數(shù)（均為1.67±0.52）均顯著增加（均為P＜0.05），表明自交聯(lián)凝膠的使用能有效防止術(shù)后輸卵管的阻塞。假手術(shù)對照組的通暢指數(shù)（1.83±0.41）稍高于5 mL 和10 mL自交聯(lián)凝膠組，但沒有顯著差異（均為P＞0.05）。

圖2 各組術(shù)后輸卵管通暢情況

3 討論

盆腔術(shù)后粘連的誘因是損傷使腹膜纖維蛋白溶解系統(tǒng)活性受到抑制，先是導(dǎo)致早期纖維蛋白的粘連，隨后纖維母細(xì)胞進(jìn)入和小血管的產(chǎn)生導(dǎo)致了含有血管的永久性粘連[1-8]。盆腔術(shù)后粘連可引起女性不孕、腸粘連/梗阻、慢性腹痛/盆腔痛等多種并發(fā)癥，并增加盆腹腔再次手術(shù)的操作難度[5,7]。此外，粘連相關(guān)的疾病也給醫(yī)療衛(wèi)生資源帶來相當(dāng)大的負(fù)擔(dān)[12-13]。因此，非常有必要積極預(yù)防盆腹腔術(shù)后粘連的發(fā)生[5,7]。

透明質(zhì)酸因具有良好的生物相容性以及促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)的特點(diǎn)，是預(yù)防手術(shù)后粘連的理想原材料，但存在著在作用部位存留時(shí)間較短的缺點(diǎn)，粘連預(yù)防效果不佳[10,13-15]。而交聯(lián)的透明質(zhì)酸凝膠可以有效降低其流動性，從而延長其存留時(shí)間，顯著增強(qiáng)防粘連的作用[9-10,13,15-16]。醫(yī)用自交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠是常州百瑞吉生物醫(yī)藥股份有限公司研發(fā)的一種新型交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠，在一項(xiàng)涉及7 個(gè)醫(yī)療單位和216 例進(jìn)行婦科腹腔鏡手術(shù)患者的臨床研究中，該產(chǎn)品被證明具有良好的預(yù)防盆腔術(shù)后粘連的效果[9]。本研究通過白兔子宮角模型來探究醫(yī)用自交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠對術(shù)后盆腔粘連的預(yù)防作用，以進(jìn)一步為證明其預(yù)防盆腔術(shù)后粘連的效應(yīng)提供實(shí)驗(yàn)室研究依據(jù)。

本研究結(jié)果首先顯示白兔的受損子宮體和輸卵管發(fā)生了明顯的粘連，表明模型建立成功，證明了研究方法的可靠性。結(jié)果進(jìn)一步顯示，PBS 對照組的粘連長度最大，醫(yī)用自交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠組的粘連長度顯著減小，證實(shí)了該產(chǎn)品可以有效地預(yù)防/ 減輕盆腔術(shù)后粘連。同時(shí)，結(jié)果顯示PBS 對照組的輸卵管通暢程度最低，表明子宮角模型建立成功后輸卵管出現(xiàn)嚴(yán)重堵塞；而各醫(yī)用自交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠組的通暢指數(shù)與PBS 對照組相比均顯著提高，表明該產(chǎn)品在預(yù)防/減輕術(shù)后盆腔粘連的同時(shí)，還具有預(yù)防術(shù)后輸卵管堵塞的作用。輸卵管堵塞同樣是盆腔術(shù)后常見并發(fā)癥，并且是導(dǎo)致不孕的重要原因[17]。因此，醫(yī)用自交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠這一效應(yīng)具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。另外，結(jié)果還顯示實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)動物盆腹腔內(nèi)無實(shí)驗(yàn)樣品殘余和腹腔積液，表明醫(yī)用自交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠具有良好的生物相容性和安全性。

綜上，本文的白兔子宮角模型研究證實(shí)常州百瑞吉生物醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)的醫(yī)用自交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉凝膠對于子宮組織及輸卵管具有保護(hù)作用，可以有效預(yù)防/ 減輕子宮角模型出現(xiàn)的子宮、輸卵管粘連以及輸卵管堵塞。這為該產(chǎn)品的臨床應(yīng)用和推廣提供了堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)室研究數(shù)據(jù)支撐。