利用指紋圖譜和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)牽牛子抗炎Q-marker

李娟，彭洪兵，向玉林，劉雪年，孫媛，詹志來

（1 湖北中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，武漢 430065；2 中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心/道地藥材國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，北京 100007）

牽牛子，又名黑丑、白丑、二丑等，為旋花科植物裂葉牽牛Pharbitisnil（L.）Choisy或圓葉牽牛Pharbitis purpurea（L.）Voigt 的干燥成熟種子，始載于《名醫(yī)別錄》.其味苦性寒，有毒，具有瀉水通便、消痰滌飲、殺蟲攻積的功效［1］.牽牛子主要含有酚酸類、樹脂苷類、木脂素類、萜類、脂肪油類等化學(xué)成分.據(jù)報(bào)道，樹脂苷類是牽牛子瀉下作用的主要活性成分，但是該類成分結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，研究起來較為困難.目前中國藥典對(duì)其質(zhì)量控制的方法主要為醇浸出物測(cè)定，該方法并不能較好地控制牽牛子的質(zhì)量.

中藥質(zhì)量標(biāo)志物是劉昌孝院士于2016 年針對(duì)中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與質(zhì)量控制提出的概念［2-3］.同時(shí)，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能從系統(tǒng)層面揭示中藥對(duì)機(jī)體調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)作用機(jī)制，反映出有效成分與靶點(diǎn)蛋白之間的作用關(guān)系，具有系統(tǒng)性與整體性的特點(diǎn)［4］.由于目前網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)缺乏規(guī)范的技術(shù)引領(lǐng)，分析結(jié)果存在諸多問題，數(shù)據(jù)采集不規(guī)范，預(yù)測(cè)結(jié)果差異大，缺乏驗(yàn)證等等，因而本文根據(jù)《網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)評(píng)價(jià)方法指南》按照規(guī)范操作預(yù)測(cè)牽牛子質(zhì)量標(biāo)志物［5］.本研究通過牽牛子指紋圖譜、主要成分測(cè)定和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相結(jié)合的方法分析預(yù)測(cè)牽牛子的抗炎Q-marker，并通過分子對(duì)接和抗炎活性驗(yàn)證，為全面控制牽牛子的質(zhì)量，進(jìn)一步研究牽牛子的作用機(jī)制提供參考.

1 儀器與材料

高效液相色譜儀（1260 Infinity II，美國安捷倫）；色譜柱（Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 2.1 ×50 mm，1.8-Micron）；電子分析天平（BP211D，德國Satorius）；超聲清洗器（KUDOS SK250H，上?？茖?dǎo)）.

新綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C（成都瑞芬）；綠原酸（中國食品藥品檢定研究所）；異槲皮苷（上海麥克林）；咖啡酸（成都德思特）.超純水；甲醇（上海麥克林，色譜純）；其余試劑為分析純.DMEM 高糖培養(yǎng)基（北京索萊寶）；胎牛血清（FBS，四季青）；二甲基亞砜（DMSO，國藥集團(tuán)）、四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT，上海麥克林）；一氧化氮檢測(cè)試劑盒（碧云天）.小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7 由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室饋贈(zèng).牽牛子共16批收集于各地藥材市場(chǎng)或企業(yè)，藥材來源信息見表1，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)陳科力教授鑒定為旋花科植物裂葉牽牛Pharbitisnil（L.）Choisy 或圓葉牽牛Pharbitispurpurea（L.）Voigt的干燥成熟種子.

表1 16批牽牛子藥材樣品來源信息Tab.1 Source information of 16 batches of Pharbitidis Semen medicinal materials

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件

流動(dòng)相：0.1%甲酸溶液（A）-甲醇（B）；梯度洗脫0～2 min，10%～30% B；2～10 min，30%～65% B；10～14 min，65%～80% B；14～15 min，80%～100%B；15～17 min，100%～10% B.柱 溫25 ℃；流 速0.25 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)296 nm；進(jìn)樣量1 μL.

2.2 樣品溶液的制備

稱取不同批次牽牛子Q1～Q16 樣品粉末（過四號(hào)篩）1.0092、1.0096、1.0020、1.0065、1.0073、1.0096、1.0076、1.0023、1.0074、1.0041、1.0071、1.0017、1.0061、1.0054、1.0064、1.0011 g，置于100 mL錐形瓶中，加入25 mL 的70%甲醇，稱重，超聲處理1 h（40 kHz，240 W），自然放置冷卻后稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足損失的重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得.

2.3 方法學(xué)考察

稱取牽牛子樣品（Q2），按照2.2 方法制備樣品，按照2.1的色譜條件進(jìn)樣.

精密度試驗(yàn)：連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算得到各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面的RSD.

穩(wěn)定性試驗(yàn)：分別在0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣，計(jì)算得到各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD.

重復(fù)性試驗(yàn)：平行制備6份樣品進(jìn)樣，計(jì)算得到各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD.

加樣回收實(shí)驗(yàn)：牽牛子（Q2）6份樣品，分別加入7種標(biāo)準(zhǔn)品，結(jié)果代入回歸方程計(jì)算出7種化合物的回收率和RSD.

2.4 指紋圖譜的建立

取牽牛子供試品一共16 批，按照2.2 方法制備樣品溶液，按照2.1 的色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣檢測(cè)，并采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012 版）”進(jìn)行相似度評(píng)價(jià).

分別以對(duì)照?qǐng)D譜S1 為參照，對(duì)16 批牽牛子黑白丑供試品進(jìn)行相似度評(píng)價(jià).

2.5 主成分分析

利用SPSS 21.0軟件進(jìn)行主成分分析.

2.6 偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）

以VIP＞1 為篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選出影響牽牛子藥材成分差異的標(biāo)志性成分.

2.7 多成分含量測(cè)定

2.7.1 線性關(guān)系考察試驗(yàn)

取新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、異槲皮苷、異綠原酸C 對(duì)照品1.10、2.02、2.66、1.52、1.21 mg，用甲醇溶解，配成混合對(duì)照品母液，將混合對(duì)照品母液逐級(jí)稀釋成5 個(gè)濃度，按照2.1 項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜峰信息，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（橫坐標(biāo)為各對(duì)照品的濃度，縱坐標(biāo)為峰面積值）.

2.7.2 含量測(cè)定

按照2.2 方法制備16 批牽牛子供試品溶液，按照2.1 色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖信息，將新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、異槲皮苷和異綠原酸C 的峰面積數(shù)據(jù)代入上述線性方程，計(jì)算出藥材中的成分含量.

2.8 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.8.1 牽牛子化合物的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)［6］

檢索Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）、中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）中咖啡酸、新綠原酸、綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、異槲皮苷7 個(gè)化合物，預(yù)測(cè)化合物作用的靶點(diǎn)；以probability＞0.1 為條件，篩選出靶點(diǎn)信息.搜索Uniprot 數(shù)據(jù)庫（http：//www.uniprot.org/），將預(yù)測(cè)出的靶點(diǎn)蛋白名稱輸入后，找到對(duì)應(yīng)的基因名.然后整理各數(shù)據(jù)庫篩選出的靶點(diǎn)蛋白，將重復(fù)靶點(diǎn)除去.

2.8.2 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)分析

利用STRING 11.0 軟件（https：//string-db.org/cgi/input.pl），輸入 82 個(gè)選中的靶點(diǎn)，選擇人（homo sapiens），點(diǎn)擊確認(rèn)，最高置信度選擇＞0.9，隱藏網(wǎng)絡(luò)中的單一節(jié)點(diǎn)，其他參數(shù)設(shè)置不變，得到 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖.再利用Cytoscape 3.7.2 軟件選取藥物作用靶點(diǎn)，共得到 32個(gè)相關(guān)靶點(diǎn).

2.8.3 功能富集分析與通路分析

利用David 6.8 數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/），輸入選中的32個(gè)靶點(diǎn)蛋白，物種選擇為人，選擇P值＜0.05、FDR＜0.05，進(jìn)行 GO 功能和KEGG 通路富集分析.

2.8.4 構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)［7］

將篩選得到的7 個(gè)成分、32 個(gè)靶點(diǎn)和6 條通路數(shù)據(jù)整理完成后導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件，構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖.

2.9 分子對(duì)接驗(yàn)證分析與可視化

根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)成分與靶點(diǎn)之間的連接度選擇異綠原酸C（連接度最大）作為分子對(duì)接配體展示，核心靶點(diǎn)MMP1、MMP2、MMP13、AKR1B1、AKR1B10 作為受體，在Pubchem 數(shù)據(jù)庫下載配體的3D結(jié)構(gòu)圖，在RSCB PDB 數(shù)據(jù)庫下載受體的蛋白3D結(jié)構(gòu)圖.利用AutoDockTools1.5.6軟件對(duì)受體和配體進(jìn)行去水、加氫等處理，將配體與受體進(jìn)行分子對(duì)接計(jì)算，導(dǎo)出配體與受體之間的結(jié)合能.

2.10 牽牛子標(biāo)志物的抗炎活性驗(yàn)證

2.1 0.1 細(xì)胞培養(yǎng)

RAW264.7 細(xì)胞于37 ℃、5% CO2環(huán)境下，在含有10% FBS 和 1%雙抗的高糖 DMEM 培養(yǎng)液中培養(yǎng).當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%時(shí)，進(jìn)行傳代并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn).

2.1 0.2 MTT 法檢測(cè) RAW264.7 細(xì)胞存活率

取對(duì)數(shù)期 RAW264.7 細(xì)胞，以 1 × 104個(gè)/ 孔密度接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h 后，吸出培養(yǎng)液，加入用DMEM 培養(yǎng)液配制的各濃度藥物 100 μL，使?fàn)颗Ｗ痈鲉误w化合物的濃度分別為50、100、200、400 μM，牽牛子提取物的濃度為50、25、12.5、6.25 μg/mL，每個(gè)濃度設(shè)置 6 個(gè)復(fù)孔.24 h 后棄去含藥培養(yǎng)液，每孔加入含 5 mg/mL MTT 的高糖 DMEM 培養(yǎng)液 100 μL 并繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，吸出培養(yǎng)液，每孔加入100 μL DMSO，震蕩10 min 后用酶標(biāo)儀于 490 nm 波長(zhǎng)測(cè)定各孔的吸光度（OD）值.

2.1 0.3 Griess法檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞NO分泌量

將RAW264.7 細(xì)胞以 2 × 105個(gè)/ 孔的密度接種于24 孔板中，培養(yǎng)24 h 后棄去舊培養(yǎng)液，分別加入用DMEM 培養(yǎng)液配制的各濃度藥物（根據(jù) MTT 細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)選擇濃度），并設(shè)置空白組與模型組（LPS 組），每組3 個(gè)復(fù)孔.藥物作用于細(xì)胞 2 h 后，除空白組外，其余各組加入LPS使其終質(zhì)量濃度為 0.5 μg/mL.繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，使用NO 檢測(cè)試劑盒按照 Griess 法進(jìn)行檢測(cè).

3 結(jié)果與分析

3.1 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)：結(jié)果共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD 為0.05%～0.43%、相對(duì)峰面積RSD 為0.61%～2.72%，表明儀器精密度良好.

穩(wěn)定性試驗(yàn)：結(jié)果共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD 為0.01%～0.50%、相對(duì)峰面積RSD 為0.21%～4.01%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好.

重復(fù)性試驗(yàn)：結(jié)果共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD 為0.06%～0.90%、相對(duì)峰面積RSD 為0.51%～3.90%，表明該方法重復(fù)性良好.

加樣回收實(shí)驗(yàn)：結(jié)果代入回歸方程計(jì)算出7 種化合物的回收率為104.96%、96.85%、101.67%、97.25%、102.60%、97.24%、98.15%.RSD 分別為2.62%、2.47%、2.67%、2.80%、2.87%、2.97%、2.74%.表明回收效果好.

3.2 指紋圖譜的建立

3.2.1 指紋圖譜分析

16 批牽牛子藥材指紋圖譜和混合對(duì)照品色譜圖分別見圖1和圖2.

圖1 16批牽牛子藥材指紋圖譜Fig.1 Fingerprints of 16 batches of Pharbitidis Semen

圖2 混合對(duì)照品色譜圖Fig.2 Chromatogram of mixed reference substance

3.2.2 相似度評(píng)價(jià)

結(jié)果顯示部分樣品相似度小于0.6（表2）.由此可見，牽牛子樣品雖然來源復(fù)雜，但7個(gè)共有成分在16批樣品中均穩(wěn)定存在.

表2 16批牽牛子供試品與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度Tab.2 Similarity of 16 batches of Pharbitidis Semen test substance and control chromatogram

3.3 主成分分析

前3 個(gè)主成分（2、5、3 號(hào)峰）包含了7 個(gè)共有成分的91.177%的信息（表3）.說明這3 個(gè)成分能夠概括共有峰總數(shù)據(jù)的絕大部分信息.碎石圖見圖3.

圖3 牽牛子主成分分析碎石圖Fig.3 Pharbitidis Semen principal component analysis gravel diagram

表3 牽牛子供試品主成分特征值及累計(jì)方差貢獻(xiàn)率Tab.3 Principal component eigenvalues and cumulative variance contribution rate of Pharbitidis Semen test products

3.4 偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）

一共標(biāo)記出3個(gè)貢獻(xiàn)較大的成分，依次為2、5、3號(hào)色譜峰，分別為化合物綠原酸、異綠原酸A和咖啡酸，與主成分分析結(jié)果一致（圖4）.

圖4 牽牛子樣品PLS-DA 模型中 7 個(gè)色譜峰的 VIPFig.4 VIP of seven chromatographic peaks in the PLS-DA model of the Pharbitidis Semen sample

3.5 多成分含量測(cè)定

線性關(guān)系考察試驗(yàn)結(jié)果表明，5 種成分在一定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果見表4.

表4 牽牛子5種成分的線性關(guān)系Tab.4 Linear relationship of the five components of Pharbitidis Semen

藥材中的5種成分含量測(cè)定結(jié)果見表5.

表5 牽牛子中5種成分含量測(cè)定結(jié)果（n=3）Tab.5 Determination results of five components in Pharbitidis Semen（n=3）

3.6 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

3.6.1 牽牛子化合物的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

最終得到與7個(gè)化合物相關(guān)的82個(gè)靶點(diǎn)蛋白.

3.6.2 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)分析

PPI 網(wǎng)絡(luò)圖（圖5）和 32個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)（圖6）.

圖5 PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.5 PPI network diagram

圖6 牽牛子“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)Fig.6 “Component-target-pathway” network of Pharbitidis Semen

3.6.3 功能富集分析與通路分析

GO分析結(jié)果提示BP顯著富集在炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、細(xì)胞外基質(zhì)拆卸、MAP 激酶活性的正調(diào)控、平滑肌細(xì)胞增殖的正向調(diào)控、膠原分解代謝過程、以及對(duì)糖皮質(zhì)激素、脂多糖、缺氧的反應(yīng)等過程，其中炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)功能和調(diào)節(jié)平滑肌收縮的功能可能分別與牽牛子消痰滌飲、瀉水通便的功效有關(guān)；MF主要富集在內(nèi)肽酶活性、酶結(jié)合功能；CC 主要富集在質(zhì)膜.具體信息見表6.富集到的6 條通路，為雌激素信號(hào)通路、癌癥途徑、TNF信號(hào)通路、膀胱癌、癌癥的蛋白聚糖、血清素能突觸，表明這6個(gè)通路可能是32 個(gè)靶點(diǎn)干預(yù)疾病的主要途徑（表7）.其中TNF信號(hào)通路和膀胱癌信號(hào)通路可能分別與牽牛子抗菌消炎、利尿的作用有關(guān).牽牛子有刺激子宮的藥理作用［8］，對(duì)離體兔腸及離體大鼠子宮有興奮作用，這可能與雌激素信號(hào)通路有關(guān).

表6 基因生物學(xué)過程Tab.6 Gene biology process

表7 主要作用靶點(diǎn)的通路富集分析Tab.7 Pathway enrichment analysis of main targets

3.6.4 構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)

以成分、靶點(diǎn)、通路之間的連接度為參考（圖6），發(fā)現(xiàn)異綠原酸B 和異綠原酸C 的連接度較高，可能是發(fā)揮作用的主要成分；MMP1、MMP2、MMP13、AKR1B1、AKR1B10相關(guān)的成分通路相對(duì)較多，這5個(gè)靶點(diǎn)蛋白可能是牽牛子發(fā)揮作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)；6 條信號(hào)通路的連接度相差不大，都有可能是牽牛子的潛在Q-marker關(guān)鍵信號(hào)通路.

3.7 分子對(duì)接驗(yàn)證分析與可視化

異綠原酸C與MMP1、MMP2、MMP13、AKR1B1、AKR1B10 的結(jié)合能依次為-8.6、-5.5、-9.8、-9.6、-8.5 kcal/mol，結(jié)合能越小，配體與受體之間越容易結(jié)合.5個(gè)配體與化合物結(jié)合能均較小，表明化合物與關(guān)鍵靶點(diǎn)之間有較強(qiáng)的結(jié)合活性，并運(yùn)用Pymol3.2軟件進(jìn)行可視化處理，結(jié)果見圖7.

圖7 靶點(diǎn)與異綠原酸C分子對(duì)接圖Fig.7 The docking diagram of the target and isochlorogenic acid C molecule

抗炎Q-Marker 異綠原酸C 與MMP2、MMP13 的結(jié)合能分別為-9.8 kcal/mol 和-9.6 kcal/mol，遠(yuǎn)低于-4.0 kcal/mol［9］，這說明配體有較強(qiáng)的生物活性.

3.8 牽牛子標(biāo)志物的抗炎活性驗(yàn)證

3.8.1 MTT 法檢測(cè) RAW264.7 細(xì)胞存活率

結(jié)果表明，25 μg/mL 以下的牽牛子提取物和7個(gè)單體成分在各濃度下細(xì)胞存活率均大于85%，表明提取物和7 個(gè)單體成分無明顯的細(xì)胞毒副作用（圖8）.

圖8 牽牛子提取物和各單體對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率的影響Fig.8 Effects of Pharbitidis Semen extract and each monomer on the viability of RAW264.7 cells

3.8.2 Griess法檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞NO分泌量

結(jié)果表明，牽牛子提取物（25 μg/mL）可顯著抑制LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞產(chǎn)生NO，抑制率達(dá)到269%（圖9）.濃度為100 μM 時(shí)，牽牛子各單體均可抑制LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞產(chǎn)生NO，其中咖啡酸、異綠原酸B的抑制效果較好，均大于50%.

圖9 牽牛子提取物和各單體對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO的影響Fig.9 Effects of Pharbitidis Semen extract and each monomer on NO production in LPS-induced RAW264.7 cells

4 討論

本研究通過UPLC 建立了牽牛子的指紋圖譜，指認(rèn)了牽牛子中7 個(gè)共有成分，通過主成分和偏最小二乘法判別分析等找出3 個(gè)主要成分綠原酸、咖啡酸和異綠原酸A.綠原酸具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、降血脂、降血糖和免疫調(diào)節(jié)等多方面的生物活性［10］，有利尿補(bǔ)腎的功效［11］，能顯著增加腸胃蠕動(dòng)，促進(jìn)胃液分泌.研究發(fā)現(xiàn)綠原酸是通過調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶/ ERK/c-Jun 氨基末端激酶信號(hào)通路來降低組織的炎癥反應(yīng)［12］.咖啡酸具有抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗菌等多種藥理作用［13］，可以抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、蠟狀芽孢桿菌、單核細(xì)胞增生利斯特菌的生長(zhǎng)，具有一定的毒性，可能與牽牛子殺蟲功效有關(guān).咖啡酸等小分子酚酸類成分的自氧化過程中會(huì)產(chǎn)生含1，4-苯并二噁烷結(jié)構(gòu)的化合物，此類化合物具有很好的抗炎活性［12］.綠原酸和咖啡酸中的兒茶酚基團(tuán)可以清除細(xì)胞內(nèi)活性氧，通過抑制人腸上皮細(xì)胞中PKDNF-κB 信號(hào)來抑制H2O2誘導(dǎo)的IL-8 的產(chǎn)生，從而抑制嚴(yán)重的細(xì)胞損傷和炎癥性腸道疾病.新綠原酸為綠原酸的同分異構(gòu)體，具有抗炎、抗氧化、增強(qiáng)免疫等作用.楊海星［14］研究發(fā)現(xiàn)，新綠原酸對(duì)由LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞具有明顯抗炎作用，其機(jī)制可能與下調(diào)P-NF-κbp65 有關(guān).異綠原酸A、B、C 是金銀花中有機(jī)酸類天然活性成分，在其他植物中也廣泛存在［15-18］.異槲皮苷為黃酮醇苷類化合物，具有抗炎、抗病毒、降血壓等多種藥理活性，能在抗Cd2+誘導(dǎo)的腎臟和肝臟毒性中發(fā)揮重要作用.異槲皮苷能夠抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶，起到抗高血壓的功效，并且具有利尿和保鉀的功能［16］.綜上，7 種化合物具有抗菌消炎、利尿通便等功效，與牽牛子的傳統(tǒng)功效相似，可作為牽牛子的潛在抗炎Q-marker.

結(jié)合牽牛子的功效，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析篩選出與7個(gè)化學(xué)成分相關(guān)的32個(gè)靶點(diǎn)、6條通路.分子對(duì)接分析驗(yàn)證其中異綠原酸C 具有很好的生物活性，由于7 個(gè)化合物均做分子對(duì)接驗(yàn)證，數(shù)據(jù)繁多，而7 個(gè)化合物結(jié)構(gòu)相似，與受體的結(jié)合能也應(yīng)該相似，本文未一一驗(yàn)證.抗炎活性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證牽牛子提取物以及7種化合物均可抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO，具有很好的抗炎效果，可能是通過上述6 條通路相互作用于32 個(gè)蛋白靶點(diǎn)起作用，進(jìn)一步說明這7種化合物可作為牽牛子的抗炎Q-marker.

Q-marker 的“五原則”的特點(diǎn)包含特有性、有效性、可測(cè)性、傳遞與溯源性、和處方配伍，反映了中藥的安全性和有效性，有利于中藥質(zhì)量溯源體系建設(shè)和全程質(zhì)量控制［17］.雖然文獻(xiàn)報(bào)道牽牛子苷為牽牛子瀉下和殺蟲等的有效成分，但研究發(fā)現(xiàn)樹脂糖苷類化合物牽牛子苷檢測(cè)難度大，不具備可測(cè)性，并不適合作為Q-marker.同時(shí)由于樣品本身來源復(fù)雜，指紋圖譜分析發(fā)現(xiàn)調(diào)查的16批牽牛子樣品相似度較低，指紋圖譜也不太適合用于牽牛子的質(zhì)量控制.但結(jié)合含量測(cè)定和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果，本研究篩選出的7 個(gè)成分在牽牛子各批次樣品中穩(wěn)定存在，在生品和炮制品中均能檢測(cè)出［18］，并具有相關(guān)的藥理活性.因而，本研究篩選出的7個(gè)化合物雖不是牽牛子中的特有成分，但也滿足化學(xué)性質(zhì)與藥理作用也與牽牛子的傳統(tǒng)藥性和功效基本一致的條件，且含量較高、穩(wěn)定，檢測(cè)識(shí)別方法簡(jiǎn)單快捷，具備有效性、可測(cè)性、可傳遞性等特點(diǎn)，適合作為牽牛子的抗炎Q-marker.