近紅外光協(xié)同免疫療法增強(qiáng)抗腫瘤效果研究進(jìn)展

祝紅達(dá)，楊朝波，劉閱，張子林，馬凱，關(guān)業(yè)能

（湖北工業(yè)大學(xué) a.生物工程與食品學(xué)院；b.發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；c.工業(yè)微生物湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430068）

傳統(tǒng)的腫瘤治療方法（手術(shù)、化療和放療）在本質(zhì)上都是局部直接根除腫瘤細(xì)胞和組織，雖有一定的療效但通常難以治愈，特別是化療由于靶向性差造成的副作用嚴(yán)重，還會導(dǎo)致免疫系統(tǒng)功能的降低.近年來腫瘤免疫療法得到極大的發(fā)展，如免疫檢查點(diǎn)抑制劑、細(xì)胞因子、癌癥疫苗等，其通過活化免疫細(xì)胞激活免疫系統(tǒng)達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞的目的［1］.2015 年美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)將免疫檢查點(diǎn)抑制劑用于非小細(xì)胞肺癌的治療，使其成為最耀眼的抗癌明星［2］，但患者的實(shí)際響應(yīng)率偏低，部分患者出現(xiàn)較嚴(yán)重的免疫相關(guān)不良事件（irAEs）［3］.為了降低免疫療法的副作用，許多研究試圖用多種方法聯(lián)合免疫療法用于腫瘤的治療，其中光療特別是近紅外光（650～1700 nm）由于其優(yōu)異的光物理學(xué)參數(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的診斷與治療方面被廣泛關(guān)注.首先，近紅外光以非電離方式進(jìn)行輻射，不會對組織造成明顯的傷害及遺傳毒性［4］；其次，用于近紅外的設(shè)備與輻射設(shè)備相比要便宜得多［5］；最后，近紅外激光在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已有數(shù)十年的發(fā)展，其安全性和方法理論有一定的保障［6］，這些優(yōu)勢給予近紅外光以巨大的臨床應(yīng)用潛能.近紅外光聯(lián)合免疫療法策略不僅增強(qiáng)了原發(fā)腫瘤細(xì)胞的凋亡，遠(yuǎn)端腫瘤和腫瘤轉(zhuǎn)移也被明顯抑制［7］.本文對近年來近紅外光協(xié)同免疫療法增強(qiáng)抗腫瘤的設(shè)計(jì)策略、應(yīng)用、現(xiàn)存問題及未來展望進(jìn)行綜述.

1 近紅外光協(xié)同免疫療法的設(shè)計(jì)策略

1.1 光熱療法協(xié)同免疫治療

光熱治療（PTT）是基于能夠?qū)⒐饽苻D(zhuǎn)換為熱能的光熱轉(zhuǎn)化劑的一種治療方法，其靶向腫瘤細(xì)胞后，在近紅外光的照射下光熱轉(zhuǎn)化劑吸收光子能量使其從基態(tài)單重態(tài)轉(zhuǎn)化為激發(fā)單重態(tài)，激發(fā)的光熱試劑通過與周圍分子之間的碰撞返回基態(tài)，動能的增加會導(dǎo)致腫瘤部位周圍微環(huán)境溫度升高而消融腫瘤細(xì)胞［8］，造成腫瘤細(xì)胞的DNA 及蛋白質(zhì)等的不可逆損壞而抑制腫瘤細(xì)胞的生長［9］；同時(shí)腫瘤細(xì)胞凋亡產(chǎn)生免疫原性細(xì)胞死亡（ICD），釋放損傷相關(guān)的分子模式（DAMPs）［10］，刺激樹突狀細(xì)胞（DC）的成熟并激活殺傷性的免疫細(xì)胞、提高相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平［11］（圖1）.目前研究較多的光熱轉(zhuǎn)化劑有CuS［12］、金納米粒子［13］、有機(jī)聚合物［14］及小分子染料［15］等.

圖1 光熱治療協(xié)同免疫治療的原則概述［11］Fig.1 Overview of the principles of photothermal therapy combined with immunotherapy［11］

佐劑的加入可以改善免疫細(xì)胞的功能［16］，因此PTT與免疫佐劑的聯(lián)合使用成了近年來治療遠(yuǎn)端腫瘤的研究熱點(diǎn).Guo 等［11］設(shè)計(jì)了基于殼聚糖包裹的可生物降解中空CuS納米顆粒包載免疫佐劑寡聚脫氧核苷酸（CpG），該納米粒子治療平臺結(jié)合了PTT和免疫治療，光熱消融誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞死亡抑制腫瘤的生長，而免疫佐劑則增強(qiáng)宿主的抗腫瘤免疫.結(jié)果表明聯(lián)合光熱免疫治療比免疫治療或單獨(dú)光熱治療對初次治療和遠(yuǎn)端未治療的腫瘤更有效.

PAN 等［17］選用抗原卵清蛋白（OVA）包裹小分子染料吲哚菁綠（ICG）構(gòu)建OVA-ICG 納米疫苗并評價(jià)在動物實(shí)驗(yàn)中腫瘤光熱免疫治療效果［18］.結(jié)果顯示該納米疫苗具有抗原載藥率高（80.8%）、產(chǎn)率高（＞90%）、近紅外吸收和熒光強(qiáng)、重復(fù)性好、穩(wěn)定性好、生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)；在標(biāo)記/跟蹤DC方面較靈敏，能夠協(xié)同光熱免疫治療腫瘤并有效地預(yù)防腫瘤.該策略為大規(guī)模、重復(fù)制備高抗原負(fù)載率的多功能納米疫苗用于腫瘤治療提供了一種較為簡便可靠的方法.

除免疫佐劑外，針對免疫檢查點(diǎn)抑制劑如PD-L1和抗CTLA4 抗體也可以極大地增強(qiáng)PTT 介導(dǎo)免疫反應(yīng)［19-20］.原位自體癌癥疫苗（inCVAX）［21］由于抗原來自癌細(xì)胞本身，喪失了增值活性，保留了免疫原性，這使得其在聯(lián)合PTT 時(shí)對不同的癌癥均有療效［22］.將免疫佐劑和免疫檢查點(diǎn)抑制劑合用于PTT治療可綜合各自的優(yōu)勢而產(chǎn)生協(xié)同作用［18］.

1.2 光動力療法協(xié)同免疫治療

光動力治療（PDT）被認(rèn)為是癌癥的一種替代療法.光敏劑在光照條件下吸收光子變?yōu)榧ぐl(fā)電子態(tài)，能量發(fā)射為熒光、熱和/或其他形式的光物理能量，如產(chǎn)生自由基及其離子并將能量傳遞給腫瘤細(xì)胞部位的氧氣而產(chǎn)生具有細(xì)胞毒性的活性氧（ROS），特別是高活性的單線態(tài)氧（1O2）達(dá)到抗腫瘤目的［8］，這樣的特征使得其在癌癥的治療中發(fā)揮著重要的作用.在腫瘤部位PDT 介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞對免疫的響應(yīng)如圖2 所示［23］：首先在近紅外光的照射下產(chǎn)生大量的ROS 導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，而凋亡的腫瘤細(xì)胞會募集單核細(xì)胞等具有清除功能的細(xì)胞同時(shí)誘導(dǎo)部分細(xì)胞因子的釋放，將單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM），而TAM 對小分子藥物、尺寸較大的顆粒等有一定的吞噬作用，這使得光敏劑在TAM 中富集成為可能［24］，在PDT 作用下，光敏劑將腫瘤部位的氧氣轉(zhuǎn)化為可以殺滅癌細(xì)胞的單線態(tài)氧（1O2），死亡的癌細(xì)胞作為抗原刺激免疫細(xì)胞的活化激活免疫反應(yīng).

圖2 光動力療法介導(dǎo)的免疫反應(yīng)［23］Fig.2 photodynamic therapy mediated immune response［23］

將疫苗［25］、免疫檢查點(diǎn)抑制劑［26］、IDO 酶抑制劑［27］、酸性神經(jīng)酰胺酶抑制劑［28］等用于抗腫瘤研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，在PDT 作用下可以明顯激活免疫系統(tǒng)增強(qiáng)抗腫瘤活性.XU 等［29］設(shè)計(jì)一種基于上轉(zhuǎn)換納米顆粒（UCNPs）的多功能納米粒子UCNP-Ce6-R837，不僅可以用于近紅外誘導(dǎo)的PDT 直接殺傷腫瘤細(xì)胞，還可以通過觸發(fā)樹突狀細(xì)胞的成熟和細(xì)胞因子的分泌刺激免疫應(yīng)答.這種基于UCNP-Ce6-R837 的PDT 結(jié)合臨床批準(zhǔn)的CTLA4 免疫檢查點(diǎn)阻斷療法抑制調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Treg）的活性，能夠有效地消除原發(fā)腫瘤，在免疫反應(yīng)的作用下有效抑制遠(yuǎn)端腫瘤；此外該光動納米粒子能誘導(dǎo)記憶T 細(xì)胞的成熟產(chǎn)生長期免疫記憶效應(yīng)進(jìn)而有效防止腫瘤的復(fù)發(fā).該研究證明了以UCNP 為基礎(chǔ)的PDT 與腫瘤免疫治療相結(jié)合在消除原發(fā)腫瘤、抑制遠(yuǎn)處腫瘤、防止腫瘤復(fù)發(fā)方面具有顯著的協(xié)同治療效果.

在臨床應(yīng)用方面，PDT 從1970 年開始用于臨床治療，因其良好的重現(xiàn)性、選擇性、低毒性以及微創(chuàng)等特點(diǎn)而被FDA 批準(zhǔn)用于晚期的癌癥患者［30］，推薦用于不能手術(shù)的癌癥患者［31］.

1.3 光化學(xué)療法協(xié)同免疫治療

在低能量的近紅外光作用下硅酞菁衍生物IRDye700DX（IR700）發(fā)生光致反應(yīng)，能引起細(xì)胞膜的應(yīng)激反應(yīng)，使跨膜靶蛋白損傷而降低細(xì)胞膜的完整性導(dǎo)致細(xì)胞死亡［32］.NAGAYA 等［33］構(gòu)建基于近紅外光免疫治療（NIR-PIT）的復(fù)合體（APC）IR700，其在690 nm 近紅外光的激活下可增強(qiáng)抗腫瘤的治療.采用近紅外光直接照射腫瘤細(xì)胞使其膨脹致細(xì)胞膜破裂，觸發(fā)ICD 進(jìn)而激活熱休克蛋白70 和90（HSP70/90）等應(yīng)激物及死亡信號鈣網(wǎng)蛋白（CRT）、腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）和高遷移率族蛋白B1（HMGB1）［34］，這些物質(zhì)協(xié)同促進(jìn)DC 的成熟，隨后在DC 的提呈作用下激發(fā)免疫反應(yīng)［35］，誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞的增值殺死腫瘤細(xì)胞（圖3）.復(fù)合體中光活性的染料IR700 可與多種抗體結(jié)合，其本身無毒性且易通過尿液排出體外［34］.復(fù)合物中抗體的靶向性使得NIR-PIT 具有很強(qiáng)的選擇性，這也是該方法與傳統(tǒng)腫瘤治療方法的最大不同點(diǎn)，不會對正常的非靶向細(xì)胞造成明顯的副作用［36］.

圖3 NIR-PIT誘導(dǎo)的免疫原性細(xì)胞死亡激活免疫反應(yīng)［35］Fig.3 NIR-PIT induced immunogenic cell death activates the immune response［35］

近紅外光免疫治療已經(jīng)在靶向于EGFR、HER2、GPC3 等腫瘤治療方面成功應(yīng)用［33］.NAGAY 等［37］描述了NIR-PIT 的有效性，將靶向表達(dá)間皮素的A431/H9 細(xì)胞的人源化抗體（hYP218）偶聯(lián)到光吸收劑IR700上并與細(xì)胞共同孵育.體外實(shí)驗(yàn)表明hYP218-IR700 有細(xì)胞特異性殺傷作用.荷瘤小鼠動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明hYP218-IR700 具有較高的腫瘤聚集率和較高的腫瘤背景比（TBR），近紅外光照射組的腫瘤生長受到明顯的抑制.

1.4 近紅外熒光成像協(xié)同免疫治療

如1.2 所述，光敏物質(zhì)在近紅外光照條件下吸收光子變?yōu)榧ぐl(fā)電子態(tài)后能夠?qū)⒛芰堪l(fā)射為熒光或磷光，這使得近紅外成像可以和多種光譜、多種治療方法聯(lián)合使用對復(fù)雜的免疫系統(tǒng)成像［38］.與可見光相比，近紅外光特別是第二近紅外（NIR-II）具有更高的信號背景比（SBR）、更高的靈敏度以及成像的高分辨率等［39］，這些特性賦予近紅外光以優(yōu)異的成像能力.因此采用合適的熒光團(tuán)標(biāo)記抗體［40］，疫苗［41］，免疫細(xì)胞（T細(xì)胞［42］，B細(xì)胞［43］，巨噬細(xì)胞［38］，DC 細(xì)胞［44］，NK 細(xì)胞［45］）制備成探針，再利用近紅外熒光成像可以實(shí)現(xiàn)免疫相關(guān)生物分子的實(shí)時(shí)監(jiān)控［46］，可以確定它們的生物分布及表達(dá)水平從而評估治療效果，為治療過程的安全性提供保障.

WAN 等［47］將熒光團(tuán)（IR-BGP6）通過共價(jià)結(jié)合的方式結(jié)合到程序性細(xì)胞死亡配體-1 單克隆抗體（PD-L1 mAb）上制備成探針（anti-PD-L1-BGP6），分析了不同細(xì)胞系內(nèi)PD-L1 的表達(dá)水平，實(shí)現(xiàn)了非侵入性的體內(nèi)分子成像.腫瘤與正常組織信號背景比高達(dá)≈9.5，與在組織內(nèi)非特異性蓄積的NIR-II 熒光團(tuán)相比，IR-BGP6 標(biāo)記的PD-L1 顯著提高分子成像性能，并且該熒光團(tuán)能夠在腎臟快速排泄（在注射后10 h 內(nèi)一般91%通過尿排出）不會引起蓄積毒性.

1.5 多種光療協(xié)同免疫的復(fù)合療法

多種光療協(xié)同免疫的復(fù)合療法是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，一方面是復(fù)合療法在發(fā)揮療效的同時(shí)也能大大降低對正常組織的傷害，另一方面得益于納米技術(shù)和材料科學(xué)的飛速發(fā)展，基于納米材料的光療可能達(dá)到最佳的治療效果.單一的光照治療方式可能無法完全殺死腫瘤細(xì)胞而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，多種光療協(xié)同作用下可以產(chǎn)生足夠的抗原物質(zhì)［48］，再輔以免疫治療可以進(jìn)一步增強(qiáng)抗腫瘤活性同時(shí)防止復(fù)發(fā).多種光療協(xié)同治療可以在完全消融癌細(xì)胞的前提下使PTT更溫和地升溫而避免對正常組織的損傷，降低PDT 光敏劑可能帶來的毒副作用，可視化治療過程控制治療效果及避免對正常細(xì)胞的損害.HAN 等［49］開發(fā)了一種超低強(qiáng)度近紅外光同步激活的協(xié)同Chemo/PTT/PDT 納米平臺，該納米平臺由高發(fā)射上轉(zhuǎn)換（UC）核、二氫卟吩e6（Ce6）光敏劑和抗癌藥物鹽酸阿霉素（DOX）共負(fù)載于介孔二氧化硅（MS）殼中組成，聚乙二醇修飾的石墨烯（PGO）作為光熱試劑和智能開關(guān)促進(jìn)藥物的釋放.低于皮膚最大允許照射功率（0.33 W/cm2）的808 nm 超低強(qiáng)度近紅外光照射（0.25 W/cm2）下的輕度高熱可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞不可逆性死亡，并最大量地促進(jìn)化療藥物的釋放；來自UC 的660 nm 光激活Ce6 產(chǎn)生PDT 的活性氧，540 nm 光可以用于可視化處理過程；動物體內(nèi)外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)表明，超低強(qiáng)度近紅外光同步激活的Chemo/PTT/PDT 納米平臺具有顯著的療效，并且光損傷最小.

2 近紅外光協(xié)同免疫療法在不同腫瘤中的應(yīng)用研究

近紅外光協(xié)同免疫療法是非常有前景的治療方法，近紅外光可以直接及間接激活免疫系統(tǒng)，可同時(shí)進(jìn)行成像監(jiān)測治療效果、評估在治療過程中產(chǎn)生的不良反應(yīng)，因此在腫瘤治療方面具有很大的臨床應(yīng)用潛力.近紅外光協(xié)同免疫治療的研究中幾乎都涉及納米材料，這些納米材料雖然表現(xiàn)出強(qiáng)大的功能和有效性，但其長期毒性及體內(nèi)蓄積目前仍然不是很明確，因此在臨床轉(zhuǎn)化方面還有大量的工作需要做，值得鼓勵的是目前已有獲批臨床研究的項(xiàng)目.

采用FDA 批準(zhǔn)的Erbitux?（Cetuximab）抗體與光吸收劑IR700 的結(jié)合物（RM1929/ ASP1929）構(gòu)建NIR-PIT 治療平臺用于復(fù)發(fā)性頭頸癌患者的治療，目前已成功地通過了Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)，為了克服近紅外光在組織中有限穿透深度，在腫瘤組織內(nèi)插入了圓柱形擴(kuò)散光纖，增強(qiáng)光線在整個腫瘤中的傳遞.選用RM1929最大可行劑量640 mg/m2，注射給藥24 h后用使用690 nm 近紅外光50 J/cm2照射表面病變或100 J/cm2照射間位病變.結(jié)果顯示：治療有較好的腫瘤抑制效果，盡管在治療部位周圍觀察到出血和疼痛，但未觀察到劑量限制性毒性或光敏性，是一種安全的治療方法（NCT02422979）.

在肝癌、肺癌、乳腺癌等的臨床前研究中，光熱或光動聯(lián)合免疫治療都表現(xiàn)出令人滿意的抗腫瘤效果.HANAOKA 等［50］用光敏劑IR700 偶聯(lián)抗GPC3人源性重鏈抗體（HN3）分別在體外和體內(nèi)對荷瘤小鼠進(jìn)行光免疫治療（PIT），結(jié)果表明IR700-HN3和IR700-YP7（免疫球蛋白）介導(dǎo)下的NIR-PIT 在體外和體內(nèi)均可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡，而IR700-HN3 表現(xiàn)更強(qiáng)抗腫瘤效果.LI 等［51］構(gòu)建具有熒光成像能力的近紅外/pH 雙響應(yīng)納米復(fù)合物CE7Q/CQ/SV（由兩種銫基納米材料CE7Q 和CQ 混合后負(fù)載SV），將分子靶向藥物厄洛替尼（Er）、生存素 shRNA 表達(dá)質(zhì)粒（SV）和光熱劑七甲基菁染料（Cy7）整合在一個平臺上，用于近紅外（NIR）熒光成像和對攜帶表皮生長因子受體（EGFR）突變的非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的三聯(lián)治療.所得CE7Q/CQ/S 具有良好的光熱效應(yīng)、良好的DNA 結(jié)合能力和pH/NIR 雙響應(yīng)釋放行為，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，生存素基因表達(dá)下調(diào)和光熱效應(yīng)可與Er協(xié)同作用，在Er敏感或Er耐藥的EGFR突變的非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）細(xì)胞中均有滿意的抗腫瘤效果，該復(fù)合治療納米平臺有望成為治療非小細(xì)胞肺癌的候選藥物.

肺轉(zhuǎn)移在腫瘤細(xì)胞的生長過程中是較為常見的現(xiàn)象，單一光療很難達(dá)到完全抑制的效果.LI等［52］構(gòu)建了一種由半導(dǎo)體聚合物納米顆粒（SPN）核心和由單線態(tài)氧（1O2）可切割連接物連接的免疫檢查點(diǎn)抑制劑（NLG919）組成的納米平臺（OSPs）用于乳腺癌的治療.OSPs在近紅外激光照射下能夠同時(shí)產(chǎn)生熱量和氧氣進(jìn)行聯(lián)合光療，在消融腫瘤的同時(shí)產(chǎn)生腫瘤相關(guān)抗原；近紅外照射可觸發(fā)1O2-可裂解接頭的裂解，觸發(fā)免疫刺激劑從OSPs遠(yuǎn)程釋放調(diào)節(jié)免疫抑制的腫瘤微環(huán)境，最終導(dǎo)致了小鼠異種移植瘤模型中原發(fā)/遠(yuǎn)處腫瘤的生長和肺轉(zhuǎn)移的抑制.

3 總結(jié)與展望

近紅外光協(xié)同免疫療法可增強(qiáng)抗腫瘤效果、降低各自單獨(dú)使用時(shí)所引起的不良反應(yīng)，具有很大的臨床應(yīng)用潛能，但發(fā)展過程中還有一些瓶頸問題需要解決.首先，在利用近紅外光協(xié)同免疫治療的過程中會構(gòu)建或使用一些具有高光活性、靶向性、可生物降解等優(yōu)勢的納米載體，雖被證實(shí)有效但多限于體外實(shí)驗(yàn)或動物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，況且由于個體差異及體內(nèi)復(fù)雜多變的生物環(huán)境使得納米材料在人體內(nèi)的作用難以預(yù)測，臨床轉(zhuǎn)化方面還有大量的工作要做；其次，對于在使用PTT治療腫瘤時(shí)所產(chǎn)生的溫度以多少較為合適目前尚沒有明確的定論，過低可能無法有效消融腫瘤細(xì)胞，過高又可能對正常組織造成傷害，還需要大量的研究去探索適宜的溫度范圍；再者，與可見光相比近紅外光尤其是NIR-II在組織穿透方面有了極大的提高，在淺表層的腫瘤細(xì)胞殺傷方面有一定的療效，但是在深層腫瘤細(xì)胞的損害方面依然達(dá)不到理想結(jié)果，因此近紅外光的作用下協(xié)同免疫療法用于臨床仍然有很長的路要走.若能將一些先進(jìn)的技術(shù)如抗干擾能力強(qiáng)傳輸路徑遠(yuǎn)的光纖技術(shù)用于增強(qiáng)近紅外光的穿透深度，將可能對深層腫瘤達(dá)到治愈的效果.