南京地區(qū)草莓根腐病病原菌的分離及鑒定

丁春霞，姚淑偉，劉暢，楊平*，侯北偉**

（1.南京曉莊學(xué)院 食品科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 211171；2.南京金色種業(yè)科技有限公司，江蘇 南京 211200；3.中華全國(guó)供銷合作總社南京野生植物綜合利用研究所，江蘇 南京 211100）

草莓（Fragaria×ananassaDuch.）為薔薇科（Rosaceae）草莓屬（FragariaL.）多年生草本植物，其果肉鮮美，含有特殊的濃郁芳香，富含VC，具有“水果皇后”之稱，深受各國(guó)人民的喜愛(ài)［1］。而草莓根腐病已成為草莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要障礙之一，輕者影響草莓產(chǎn)量和品質(zhì)，嚴(yán)重發(fā)病時(shí)造成草莓園毀滅，給果農(nóng)帶來(lái)巨大損失。草莓根腐病是由多種病原物和環(huán)境相互作用引起的一大類病害的總稱。草莓根腐病在世界各處的草莓種植區(qū)均有發(fā)生，但是其致病菌種類因地區(qū)不同而產(chǎn)生差異。以西澳大利亞州草莓種植園的染病草莓為樣本進(jìn)行病原菌的分離鑒定，發(fā)現(xiàn)其主要病原菌為雙核絲核菌（BinucleateRhizoctonia）［2］。研究發(fā)現(xiàn)引起厄瓜多爾草莓根腐病的主要病原菌為類擬盤多毛孢菌（Neopestalotiopsis mesopotamica）［3］，而引起捷克草莓根腐病的主要病原菌為疫霉菌（Phytophthora）［4］。

國(guó)內(nèi)草莓根腐病致病菌也具有地區(qū)特異性，有研究報(bào)道北京市昌平區(qū)草莓根腐病的致病菌主要為棒形擬盤多毛孢（Pestalotiopsis clavispora）、膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）等［5］，北京市房山區(qū)草莓根腐病的致病菌為立枯絲核菌［6］，而另有報(bào)道北京地區(qū)的草莓根腐病樣品的致病菌是暹羅炭疽菌（Colletotrichum siamense）和尖孢鐮刀菌［7］。山東省作為我國(guó)的草莓生產(chǎn)大省，草莓根腐病致病菌的種類更加多樣復(fù)雜。山東省草莓根腐病病株的毛霉返接草莓能再次引起草莓根腐?。?］，在山東煙臺(tái)草莓根腐病病株曾分離到疫霉菌［9］。江蘇草莓根腐病的致病菌主要為鐮刀菌屬（Fusariumsp.）和炭疽菌屬（Colletotrichumsp.）的真菌［10-12］。在河南省新發(fā)現(xiàn)一種草霉病原菌為鏈格孢菌（Alternariaalternata）［13］。此外，取自陜西長(zhǎng)安區(qū)的草莓根腐病樣品的致病菌是大雙孢土赤殼（Ilyonectria macrodidyma）［14］。

草莓根腐病的病原菌豐富多樣，不同地區(qū)草莓根腐病的致病菌亦有所不同，因此，明確當(dāng)?shù)夭葺≈虏【鷮?duì)于針對(duì)性防治草莓根腐病具有重要意義。本研究擬探究南京溧水草莓基地草莓根腐病的致病菌，為當(dāng)?shù)馗咝Х乐尾葺√峁┛茖W(xué)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

草莓病樣采自江蘇省南京市溧水金色莊園草莓基地，草莓品種為‘紅顏’。致病力檢測(cè)試驗(yàn)所用草莓幼苗為金色莊園提供的匍匐莖上2 ～ 3分生枝的小苗，品種也為‘紅顏’。

所用試劑與器材包括真菌基因組DNA提取試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司），PCR常規(guī)酶（北京全式金生物技術(shù)有限公司），DNA Marker（BBI 生命科學(xué)有限公司），JY-ECP3000 電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司），Tanon 1600 凝膠成像儀（上海天能科技有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病樣采集及病原菌的分離和形態(tài)學(xué)鑒定

采集具有根腐癥狀的發(fā)病植株作為病害樣品。用自來(lái)水多次沖洗病株表面后，將病健交界處切成1 cm × 2 cm的小塊。用消毒后的鑷子夾取置于70%乙醇溶液中浸制30 s，轉(zhuǎn)至超凈工作臺(tái)中，無(wú)菌水沖洗3次，置于2% NaClO溶液中浸泡3 min，無(wú)菌水沖洗3次后，置于消毒后的濾紙上。將病害組織切成厚度約0.3 cm的薄片，每皿4片接于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基上28℃條件下培養(yǎng)2 ～ 5 d。觀察并挑取不同形態(tài)的菌株分離培養(yǎng)，多次分離純化培養(yǎng)后保存?zhèn)溆谩?/p>

在PDA培養(yǎng)基上觀察菌株生長(zhǎng)情況（菌絲特征、菌落顏色、基物顏色、是否產(chǎn)生孢子和菌核），通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察菌絲形態(tài)、分隔狀態(tài)等，根據(jù)以上信息對(duì)菌株進(jìn)行初步分類。

1.2.2 病原菌的致病性鑒定

以金色莊園提供的草莓匍匐莖上2 ～ 3分生枝的小苗為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行返接試驗(yàn)，草莓苗在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境進(jìn)行適應(yīng)生長(zhǎng)，7 d后選取長(zhǎng)勢(shì)良好、生長(zhǎng)狀況一致的草莓幼苗，用75%乙醇消毒后的刀片對(duì)草莓幼苗進(jìn)行傷根處理，通過(guò)灌根接種法分別在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組接入50 mL的馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基和等量孢子濃度為1 × 107CFU/mL的病原菌懸浮液，每盆兩株草莓，每個(gè)處理重復(fù)3次。培育7 d后，采用相同方法再次接種，植物生長(zhǎng)培養(yǎng)箱溫度保持在27 ± 2℃。接種后每天觀察草莓幼苗病害發(fā)生情況并做好記錄。

1.2.3 分子鑒定

收集分離純化培養(yǎng)后的病原體菌絲，將40 mg菌絲體移入無(wú)菌的1.5 mL離心管中，用CTAB法提取基因組DNA。將提取到的基因組DNA用1%（w/v）瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳驗(yàn)證。使用真菌通用引物ITS1和ITS4進(jìn)行rDNA-ITS序列擴(kuò)增（表1），引物由北京擎科生物科技有限公司合成。25 μL反應(yīng)體系為2 × Taq Master Mix（ Dye Plus） 12.5 μL、引物ITS1和ITS4各1 μL、DNA模板1 μL、ddH2O 9.5 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)熱5 min，95℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)，最后72℃保持10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送擎科生物科技有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在美國(guó)國(guó)家生物信息技術(shù)中心（NCBI）（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）進(jìn)行Blast比對(duì)，下載與該序列同源性較高的已知菌株的序列，用Mega 7.0軟件以鄰接法構(gòu)建單基因系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株的分類地位。

表1 本實(shí)驗(yàn)用到的引物Table 1 The primers used in this experiment

本研究同時(shí)選用ACT、GAPDH、TUB2、CHS基因，對(duì)菌株開展多基因聯(lián)合分子鑒定，引物序列如表1所示，由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.2.4 菌種保存

將經(jīng)過(guò)驗(yàn)證鑒定為草莓根腐病病原菌的菌株在NA培養(yǎng)基上進(jìn)行平板劃線分離培養(yǎng)，28℃恒溫培養(yǎng)36 h后得到單菌落，挑取單菌落置于25 mL NB培養(yǎng)液中，于28℃條件下以180 r/min的速度恒溫震蕩培養(yǎng)12 h，用分光光度計(jì)測(cè)定OD 600值為1.0 ～ 1.2的菌懸液作為試驗(yàn)菌液。用配置好的80%丙三醇和試驗(yàn)菌液按1 ∶ 1比例加入冷凍管內(nèi)，混勻，-20℃冷凍短期保存，-80℃冷凍長(zhǎng)期保存。所有菌種均保存在南京曉莊學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離結(jié)果與形態(tài)觀察

針對(duì)草莓根腐病問(wèn)題，于南京市溧水區(qū)的草莓種植基地采集患根腐病的草莓植株，草莓的發(fā)病癥狀主要為：發(fā)病初期草莓植株的葉片整片發(fā)黃枯萎，發(fā)病后期植株葉片邊緣呈萎蔫狀甚至壞死，根莖處變褐發(fā)黑，根莖部表皮腐爛，根部（剖開后）有間斷性病斑（圖1）。

圖1 草莓根腐病發(fā)病癥狀Fig 1 Symptom of strawberry root rot

從草莓染病植株中共分離到真菌20株（NJLS1 ～NJLS20），通過(guò)菌落形態(tài)初步分為3個(gè)形態(tài)種，菌株形態(tài)如圖2所示，形態(tài)特征描述如表2所示。NJLS1等6個(gè)菌株長(zhǎng)勢(shì)較快，正面菌絲白色，呈羊毛狀，背面呈淺棕色；NJLS2等9個(gè)菌株正面菌絲不長(zhǎng)，呈白色地毯狀，較密集，菌落背面散布黑點(diǎn)；這2個(gè)類型菌株在PDA培養(yǎng)基上28°C恒溫培養(yǎng)4 ～5 d都可長(zhǎng)滿平板。而NJLS9等5個(gè)菌株菌落呈淡紫色，絨毛狀，28°C恒溫培養(yǎng)4 ～ 5 d僅可長(zhǎng)滿半個(gè)平板。

圖2 菌株生物形態(tài)學(xué)的特征Fig 2 The characteristics of biological morphology of the strains

表2 病原菌形態(tài)特征描述Table 2 The morphological characteristics of the pathogens

2.2 病原菌致病性測(cè)定

將篩選到的20種真菌進(jìn)行返接試驗(yàn)，每種菌株2個(gè)接菌量處理，每個(gè)處理重復(fù)3次。草莓植株接入編號(hào)為NJLS2、NJLS6、NJLS7的菌株7 d后，其葉片表現(xiàn)出發(fā)病癥狀；14 d時(shí)，纖維狀的根部腐爛很明顯，剖開根部后發(fā)現(xiàn)在根莖交界處可見(jiàn)褐色的病變，這與田間病害的癥狀一致（見(jiàn)圖3）。對(duì)照組生長(zhǎng)正常，沒(méi)有表現(xiàn)出任何癥狀，接種其他分離菌的草莓植株在本實(shí)驗(yàn)中也沒(méi)有發(fā)生病害（圖4），可以確定NJLS2、NJLS6、NJLS7菌株侵染草莓后可引起草莓根腐病。

圖3 草莓植株接種病原菌后發(fā)病癥狀Fig. 3 Symptoms of strawberry plants inoculated with pathogen

圖4 其余真菌接種草莓14天癥狀Fig. 4 Symptoms of strawberry inoculated with the other fungi for 14 d

2.3 病原菌分子生物學(xué)鑒定

2.3.1 ITS初步鑒定

以ITS1、ITS4為引物、以20個(gè)菌株的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果表明20個(gè)條帶的長(zhǎng)度符合預(yù)期（圖5）。8 μL膠回收提取產(chǎn)物于離心管中送至擎科生物公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果上傳至NCBI進(jìn)行Blast分析，結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)ITS序列初步鑒定，可以將分離得到的20株真菌分為3個(gè)屬，分別是：鐮刀菌屬6株、炭疽菌屬9株、木霉屬（Trichodermasp.）5株，具體的初步鑒定結(jié)果見(jiàn)表4。其中侵染試驗(yàn)中草莓植株表現(xiàn)出發(fā)病癥狀的3個(gè)菌株NJLS2、NJLS6、NJLS7均屬于炭疽菌屬。

圖5 20株菌株的PCR產(chǎn)物電泳條帶圖Fig. 5 The gel electrophoresis picture of PCR amplication products of 20 strains

表4 菌株的ITS初步鑒定結(jié)果Table 4 Preliminary identification results of strains used ITS

2.3.2 多基因聯(lián)合分子鑒定

本研究選取ACT、GAPDH、TUB2、CHS基因及ITS片段對(duì)初步鑒定為炭疽菌的3個(gè)菌株（NJLS2、NJLS6、NJLS7）進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度均在100 ～ 1 000 bp之間，條帶大小符合預(yù)期，膠回收后將擴(kuò)增產(chǎn)物送測(cè)序。從GenBank上下載已知菌株對(duì)應(yīng)的基因序列，將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blast剪切以后，以ITS、ACT、GAPDH、TUB2、CHS的排列順序串聯(lián)序列，并利用Mega軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。如圖6所示，NJLS2、NJLS6、NJLS7與暹羅炭疽菌的同源性為100，結(jié)合菌落形態(tài)和ITS序列比對(duì)結(jié)果，確定NJLS2、NJLS6、NJLS7這三株致病菌為暹羅炭疽菌。

圖6 基于多基因序列的草莓根腐病病原菌系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 6 Phylogenetic tree of strawberry root rot pathogens based on polygene sequence

3 結(jié)論與討論

由于ITS的種間差異較大，通?？梢酝ㄟ^(guò)ITS序列確定真菌的分類地位，但是在構(gòu)建親緣關(guān)系較近菌種的系統(tǒng)發(fā)育樹時(shí)ITS具有一定的局限性，可能出現(xiàn)由于某些關(guān)鍵進(jìn)化節(jié)點(diǎn)支持率低導(dǎo)致鑒定結(jié)果不一致的情況。近幾年的研究表明，由于ITS保守性較高，不能夠?qū)⑻烤揖鷮僬婢鷾?zhǔn)確鑒定到種，因此可采用多基因拼接序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。目前對(duì)炭疽菌屬鑒定的主要基因位點(diǎn)有ACT、CHS、GAPDH、TUB2［15］?；诖?，本研究采用上述4個(gè)基因序列對(duì)分離到的炭疽菌進(jìn)行多基因聯(lián)合鑒定，結(jié)果顯示本試驗(yàn)中引起草莓根腐病的3株菌株均為暹羅炭疽菌。

本試驗(yàn)從草莓根腐病植株共分離到20株真菌，通過(guò)返接試驗(yàn)進(jìn)行致病性測(cè)定篩選到了3株有致病性的菌株：NJLS2、NJLS6、NJLS7。通過(guò)形態(tài)學(xué)和ITS序列初步將20株真菌分為3類，其中鐮刀菌屬6株，炭疽菌屬9株，木霉屬5株。根據(jù)ITS、ACT、GAPDH、TUB2、CHS多基因聯(lián)合測(cè)序結(jié)果，結(jié)合病原菌形態(tài)學(xué)特征鑒定發(fā)現(xiàn)引起溧水區(qū)草莓根腐病的是暹羅炭疽菌。張方博［16］在北京市昌平區(qū)、大興區(qū)及呼和浩特市進(jìn)行草莓病害的調(diào)查，最終確定膠胞炭疽菌復(fù)合種中暹羅刺盤孢菌和尖孢鐮刀菌為草莓根腐病的主要致病菌；王鈴朝等［17］在青島萊西地區(qū)確定了6種草莓根腐病的致病真菌，其中膠孢炭疽菌、尖孢鐮刀菌是優(yōu)勢(shì)致病菌；王慧瑜［18］等研究表明引起鄭州地區(qū)草莓根腐病的致病菌為雙核絲核菌。綜合多個(gè)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)的病原菌存在差異，但在這些調(diào)查中炭疽菌屬均是主要病原菌，這與本試驗(yàn)病原菌分離的結(jié)果是一致的。

本試驗(yàn)從草莓根腐病病株共分離得到3個(gè)屬的20個(gè)菌株，其中6個(gè)隸屬鐮刀菌屬，9個(gè)隸屬炭疽菌屬。鐮刀菌屬和炭疽菌屬菌株都能引起草莓根腐病，但是本試驗(yàn)致病性測(cè)定中，只有炭疽菌屬中3株菌株返接后使草莓致病，其余病原菌接入后草莓植株均正常生長(zhǎng)，可能由于不同菌株的致病力存在差異。蓋曉彤等［19］從云南省分離到227株煙草根腐病的致病菌，經(jīng)鑒定均為尖孢鐮刀菌，而通過(guò)致病力測(cè)定發(fā)現(xiàn)有12株不具有致病性。王昶等［20］從甘肅5個(gè)不同生態(tài)區(qū)的藜麥上分離到5株病原菌，分析發(fā)現(xiàn)不同菌株之間的致病力存在顯著差異，甘肅臨夏二陰區(qū)菌株的致病力為90.00（病情指數(shù)），甘肅天祝區(qū)菌株的致病力僅為44.67。

江蘇草莓根腐病的致病菌主要為鐮刀菌屬和炭疽菌屬的真菌［10-12］。本試驗(yàn)對(duì)南京市溧水區(qū)的草莓根腐病病株進(jìn)行樣品采集、病原菌的分離和致病性測(cè)定，最終明確致病菌為暹羅炭疽菌，這是暹羅炭疽菌在南京地區(qū)草莓病害研究中的首次報(bào)道。后續(xù)試驗(yàn)將圍繞炭疽菌的生物學(xué)特性、寄主范圍、侵染機(jī)制和致病機(jī)理展開研究，為南京市溧水地區(qū)有效防治草莓根腐病以及選育抗病品種提供理論依據(jù)。