防風(fēng)總色原酮苷元提取工藝優(yōu)化及其抗炎活性研究

陳浩，李艷露，韓佳宏，宋佳琪，韓梅，蔡恩博，楊利民

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 中藥材學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118）

防風(fēng)為傘形科植物防風(fēng)［Saposhnikovia divaricata（Turcz.） Schisck.］的干燥根，具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎等藥理作用［1-2］。產(chǎn)地主要分布在內(nèi)蒙古、吉林、黑龍江、遼寧等省。

色原酮類化合物被認(rèn)為是防風(fēng)中最重要的活性成分［3］。研究表明，色原酮苷元的活性顯著優(yōu)于其原生苷，如升麻素的藥理活性強(qiáng)于升麻素苷［4-5］。但苷元類成分在防風(fēng)中含量較低［6］，限制了該類成分與防風(fēng)藥材的發(fā)展。過往研究的重點(diǎn)在于防風(fēng)總色原酮的提取，本研究在其基礎(chǔ)上，加入并考察了酶解過程。以升麻素和5-O-甲基維斯阿米醇總提取率為指標(biāo)［7］，優(yōu)化防風(fēng)總色原酮苷元提取工藝，并初步考察其抗炎活性，為防風(fēng)研究提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料、儀器與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

防風(fēng)采自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)藥植園，經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院韓梅教授鑒定為3年生傘形科植物防風(fēng)［Saposhnikovia divaricata（Turcz.） Schisck.］的干燥根。

小鼠單核巨噬細(xì)胞（RAW 264.7）購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 儀器

Agilent Model 631高效液相色譜系統(tǒng)（安捷倫科技有限公司），SC-3610型低速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司），微量移液器（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司），BSA224S型電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司），KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市儀器有限公司），THZ-92A-A氣浴恒溫振蕩器（青島明博環(huán)保科技有限公司），RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）。

1.3 試劑

纖維二糖酶（寧夏夏盛實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司），升麻素標(biāo)準(zhǔn)品、升麻素苷標(biāo)準(zhǔn)品、5-O-甲基維斯阿米醇苷標(biāo)準(zhǔn)品及5-O-甲基維斯阿米醇標(biāo)準(zhǔn)品（上海源葉生物科技有限公司）；一氧化氮試劑盒（普洛麥格試劑有限公司），色譜級(jí)甲醇（中國(guó)上海費(fèi)雪科技有限公司），分析級(jí)無(wú)水乙醇（北京化工廠）；二甲基亞砜、高糖培養(yǎng)基（索萊寶生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 HPLC測(cè)定防風(fēng)色原酮苷元含量

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、5-O-甲基維斯阿米醇對(duì)照品適量，甲醇定容，配置成2 mg/mL儲(chǔ)備液，于4℃保存，備用。

2.1.2 供試品溶液的制備

將干燥的防風(fēng)粉碎，過60目篩。恒重后，精確稱取樣品粉末約0.500 g，置于150 mL三角瓶中，加入一定量的纖維二糖酶，精密量取并加入30 mL水，稱重，一定溫度下恒溫氣浴震蕩反應(yīng)一定時(shí)間，冷至室溫，補(bǔ)足重量，再精確量取并加入30 mL無(wú)水乙醇，稱重，靜置過夜，35℃超聲1 h，冷至室溫，補(bǔ)足重量，離心后取上清液備用。

2.1.3 參比供試品溶液的制備

按照“2.1.2”項(xiàng)下條件，不加入纖維二糖酶，制備參比供試品溶液。

2.1.4 色譜條件

色譜柱：Agilent C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相：甲醇（B）-水（A），梯度洗脫程序?yàn)? ～ 5 min，40% ～ 45% B；5 ～ 10 min，45% ～ 60% B；10 ～ 15 min，60% ～ 80% B；15 ～ 20 min，80% ～ 95% B；20 ～30 min，95% ～ 40% B；流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量10 μL［8］。

2.1.5 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，置于1 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，制得混合對(duì)照品溶液A ～ G，濃度分別為：升麻素苷（25 ～0.390 6 μg/mL）、升麻素（25 ～ 0.390 6 μg/mL）、5-O-甲基維斯阿米醇苷（50 ～ 0.781 3 μg/mL）、5-O-甲基維斯阿米醇（25 ～ 0.390 6 μg/mL）。分別進(jìn)樣10 μL，按“2.1.4”項(xiàng)下中色譜條件進(jìn)行HPLC分析，以進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算線性關(guān)系方程。

2.1.6 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取“2.1.5”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液B，按“2.1.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，連續(xù)進(jìn)樣6次。計(jì)算升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷及5-O-甲基維斯阿米醇峰面積的RSD。

2.1.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批供試品粉末，平行6份。按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.4”項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣檢測(cè)。計(jì)算升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷及5-O-甲基維斯阿米醇的提取率及RSD。

2.1.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一批供試品溶液，按“2.1.4”項(xiàng)下色譜條件在0、4、8、12、16、20、24 h分別進(jìn)樣測(cè)定。計(jì)算升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷及5-O-甲基維斯阿米醇峰面積的RSD。

2.1.9 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

取已測(cè)定的防風(fēng)樣品6份，每份0.250 g，精密稱定，分別精密加對(duì)照品溶液適量，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，分別計(jì)算升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷及5-O-甲基維斯阿米醇的平均加樣回收率及RSD。

2.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

按“2.1.2”項(xiàng)下條件，考察加酶量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)：5%、10%、20%、50%、80%、100%）、酶解反應(yīng)時(shí)間（10、20、30、60、90、120 min）、酶解反應(yīng)溫度（20、30、40、50、60、70℃）對(duì)防風(fēng)總色原酮苷元提取率的影響。以升麻素與5-O-甲基維斯阿米醇總提取量代表防風(fēng)中總色原酮苷元含量，按下列公式計(jì)算提取率：

苷元提取率 = 供試品苷元濃度 × 定容體積 ×稀釋倍數(shù)/供試品取樣量

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以加酶量（X1）、反應(yīng)時(shí)間（X2）、反應(yīng)溫度（X3）為響應(yīng)因子，以升麻素和5-O-甲基維斯阿米醇總提取率為響應(yīng)值（Y），通過Design Expert V 12.0軟件安排試驗(yàn)。

2.4 最佳提取工藝的確定與驗(yàn)證

為了驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，修正最佳提取參數(shù)：加酶量90%、反應(yīng)時(shí)間60 min、反應(yīng)溫度56℃，應(yīng)用最佳提取工藝進(jìn)行提取，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，并計(jì)算得率。

2.5 防風(fēng)總色原酮體外抗炎活性評(píng)價(jià)

2.5.1 細(xì)胞活力測(cè)定

按最佳提取參數(shù)，提取防風(fēng)總色原酮苷元（升麻素含量：2.497 mg/g、5-O-甲基維斯阿米醇含量：1.991 mg/g）。參考文獻(xiàn)方法［9］，濃縮提取液，加水分散，通過D101型大孔樹脂柱，依次用水、50%乙醇洗脫，收集50%乙醇洗脫流份，回收溶劑，冷凍干燥，即得防風(fēng)色原酮苷元部位（樣品1）。

不加酶提取防風(fēng)總色原酮苷元（升麻素含量：1.349 mg/g、5-O-甲基維斯阿米醇含量： 0.031 mg/g）。按上述方法，即得參比防風(fēng)色原酮部位（樣品2）。

分別精密稱取上述樣品粉末適量，用DMSO溶解，加入完全培養(yǎng)基（DMEM高糖培養(yǎng)基 ∶ 胎牛血清 ∶ 青霉素-鏈霉素 = 10 ∶ 1 ∶ 0.1）稀釋配制成0、6.25、12.5、25、50、100 mg/L溶液，DMSO的終濃度不超過0.1%［9］。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7接種到96孔板上，每孔1.5 × 104個(gè)細(xì)胞，設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，在二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24 h。棄去舊培養(yǎng)基，替換為含不同濃度樣品的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，根據(jù)CCK-8制造商的方案，進(jìn)行細(xì)胞活力測(cè)定［10-11］。

2.5.2 一氧化氮含量測(cè)定（NO）

分別精密稱取樣品粉末適量，用DMSO溶解，加入完全培養(yǎng)基稀釋配制成5、25、50、100 mg/L溶液，DMSO的終濃度不超過0.1%。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7接種到96孔板上，每孔1.5 × 104個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h，鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)正常；設(shè)置空白組、LPS組、給藥組，每組6個(gè)復(fù)孔，在CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24 h。棄去舊培養(yǎng)基，給藥組每孔加入不同濃度受試藥物，同時(shí)加入1 μg LPS。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，離心取上清，分組處理，Griess法檢測(cè)，根據(jù)說明書制得的標(biāo)曲計(jì)算得到不同組中產(chǎn)生NO的量［12］。并計(jì)算二者NO抑制率IC5（0Half maximal inhibitory concentration）。

2.7 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 26統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，GraphPad Prism 9.0 作圖，數(shù)據(jù)資料采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜ 0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 HPLC方法學(xué)考察

3.1.1 線性關(guān)系考察結(jié)果

按“2.1.4”項(xiàng)下中色譜條件進(jìn)行HPLC分析，以進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算線性關(guān)系方程，見表1；混合對(duì)照品溶液（A）、參比供試品溶液（B：未加酶提取樣品）及供試品溶液（C：最佳工藝下提取樣品）中升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷及5-O-甲基維斯阿米醇的高效液相色譜圖，見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of standard reference and sample

表1 回歸方程和相關(guān)系數(shù)Tab.1 Regression equation and correlation coefficient

3.1.2 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷及5-O-甲基維斯阿米醇峰面積的RSD分別為0.83%、1.56%、1.34%、1.66%，表明儀器精密度良好。

3.1.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷及5-O-甲基維斯阿米醇提取率的RSD分別為1.86%、1.91%、1.97%、1.92%，表明方法重復(fù)性良好。

3.1.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷及5-O-甲基維斯阿米醇峰面積的RSD分別為1.44%、1.93%、0.99%、1.48%，表明方法穩(wěn)定性良好。

3.1.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷及5-O-甲基維斯阿米醇的平均加樣回收率分別為100.04%、100.19%、102.26%、98.70%，RSD分別為2.51%、2.50%、1.65%、2.26%。

3.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖2可知，加酶量從0 ～ 50%時(shí)，提取率顯著增加，加酶量從50% ～ 80%時(shí)，提取率增長(zhǎng)速率逐漸緩慢，加酶量80%時(shí)提取率最大，為4.504 mg/g，繼續(xù)增加酶用量提取率逐漸降低，但變化不大。因此，最適加酶量在50% ～ 100%范圍內(nèi)。由圖3可知，酶解反應(yīng)時(shí)間從0 ～ 60 min時(shí)，提取率顯著升高，在60 min時(shí)達(dá)到最大，為4.393 mg/g，60 min后提取率變化不大，時(shí)間過長(zhǎng)不適合工業(yè)化生產(chǎn)。因此，最適反應(yīng)時(shí)間在30 ～ 90 min。由圖4可知，酶解反應(yīng)溫度在0 ～ 50℃時(shí)，提取率顯著升高，反應(yīng)溫度在50℃時(shí)，提取率達(dá)到最大，為4.532 mg/g，50℃之后，提取率隨溫度變化不大。因此，最適酶解反應(yīng)溫度在40 ～ 60℃。

圖2 不同加酶量對(duì)總色原酮苷元提取率的影響Fig.2 Effects of different enzyme dosage on extraction rate of total chromogen aglycones

圖3 不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)總色原酮苷元提取率的影響Fig.3 Effects of different reaction times on extraction rate of total chromogen aglycones

圖4 不同反應(yīng)溫度對(duì)總色原酮苷元提取率的影響Fig.4 Effects of different reaction temperatures on extraction rate of total chromogen aglycones

3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

3.3.1 Central-Composite試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以加酶量（X1）、反應(yīng)時(shí)間（X2）、反應(yīng)溫度（X3）為響應(yīng)因子，以升麻素和5-O-甲基維斯阿米醇總提取率為響應(yīng)值（Y），通過Design Expert V 12.0軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，各個(gè)因素的水平據(jù)單因素的結(jié)果而定，根據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)的原則，每個(gè)因素設(shè)5組水平，通過不同物理參數(shù)來篩選各因素最優(yōu)組合條件。試驗(yàn)因素與水平見表2。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表2 因素與水平Tab.2 Factors and levels

表3 Central Composite響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.3 Central Composite response surface test design and results

3.3.2 模型建立與方差分析

將表3所得數(shù)據(jù)通過Design Expert 12.0軟件進(jìn)行多元擬合，以防風(fēng)總色原酮苷元提取率Y為響應(yīng)值、以加酶量X1、反應(yīng)溫度X2、反應(yīng)時(shí)間X3為自變量，建立多元二次方程：

由表4展示的方差結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步分析，實(shí)驗(yàn)過程中的各個(gè)因素與響應(yīng)目標(biāo)值之間存在著復(fù)雜的交互影響關(guān)系，可以看出一次項(xiàng)因子X1，X2、X3影響顯著，X22、X3

表4 方差分析結(jié)果Tab.4 Results of ANOVA

2影響顯著，交互項(xiàng)中X2X3交互影響顯著，而其它項(xiàng)不顯著。通過P值比較發(fā)現(xiàn)單因素對(duì)模型的影響順序?yàn)榉磻?yīng)溫度=反應(yīng)時(shí)間＞加酶量。根據(jù)模型的確定系數(shù)R2= 0.9658可知，模型的可靠性較好。由該模型的確定系數(shù)P= 0.423可以看出，該模型的失擬檢驗(yàn)是極其不顯著的，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明了與之相對(duì)應(yīng)的多項(xiàng)式進(jìn)行擬合推測(cè)出來的理論數(shù)值之間有極強(qiáng)的相關(guān)性。該模型預(yù)測(cè)在參數(shù)允許的范圍內(nèi)是可靠和可重復(fù)的。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來看，該模型適用于防風(fēng)總色原酮苷元的提取結(jié)果的分析和預(yù)測(cè)。

3.3.3 響應(yīng)面分析

以加酶量、酶解反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度為自變量，構(gòu)建響應(yīng)面圖，考察它們對(duì)防風(fēng)總色原酮苷元提取率的綜合影響，得出最佳提取條件。在二項(xiàng)式擬合模型的基礎(chǔ)上，采用Design Expert V12.0軟件做出相應(yīng)的曲面圖，結(jié)果見圖5。根據(jù)已建立的數(shù)學(xué)模型和響應(yīng)曲面形狀，分析加酶量、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度對(duì)防風(fēng)中總色原酮苷元提取率的影響，從圖中可以直觀的看出各因素對(duì)響應(yīng)值的影響，反應(yīng)溫度（X3） = 反應(yīng)時(shí)間（X2） ＞ 加酶量（X1）。通過對(duì)擬合的線性方程進(jìn)行更深層次的分析，最終通過軟件分析給出最佳提取參數(shù)，即加酶量89.87%，反應(yīng)時(shí)間59.97 min，反應(yīng)溫度55.95℃，在最佳提取條件下，理論應(yīng)得到升麻素和5-O-甲基維斯阿米醇的總提取率為4.58 mg/g。

圖5 各因素交互作用對(duì)防風(fēng)總色原酮苷元提取率的效應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plot of the effect of interaction of various factors on total chromone aglycone from Saposhnikoviae Radix

3.3.4 試驗(yàn)驗(yàn)證

為了驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，修正最佳提取參數(shù)：加酶量90%、反應(yīng)時(shí)間60 min、反應(yīng)溫度56℃，應(yīng)用最佳提取條件進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，得到升麻素和5-O-甲基維斯阿米醇的平均總提取率為4.49 mg/g（RSD = 0.9%，n = 3），與理論值相差2%，未加酶的平均提取率為1.38 mg/g，提高了3倍以上。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與軟件提供的預(yù)測(cè)值基本上是相同的，說明實(shí)驗(yàn)所用的模型對(duì)防風(fēng)總色原酮苷元的提取是適用的，高效的。

3.4 體外抗炎活性評(píng)價(jià)

3.4.1 細(xì)胞活力

如圖6所示，RAW 264.7細(xì)胞給藥處理24 h后，存活率均未受到抑制，說明防風(fēng)總色原酮苷及苷元（0、6.25、12.5、25、50、100 mg/L）對(duì)RAW 264.7細(xì)胞都不具有毒性。

圖6 樣品1（a）， 2（b）對(duì)細(xì)胞存活率的影響Fig.6 Effects of sample 1 （a）， 2 （b） on cell viability

3.4.2 一氧化氮含量（NO）檢測(cè)

由圖7可知，與空白組比較，LPS組NO水平顯著增加（P＜ 0.001），提示造模成功；各給藥組與LPS組比較，NO含量水平均差異顯著（P＜ 0.001）；給藥組間，樣品1抑制NO分泌效果優(yōu)于樣品2， 25 mg/L劑量下樣品1即與100 mg/L樣品2效果相當(dāng)。表明防風(fēng)總色原酮苷元對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞釋放NO具有很好的抑制作用，并顯著優(yōu)于參比提取物。NO抑制率IC50分別為2.30 ± 0.34，3.32 ±0.47 mg/L。

圖7 樣品1（a）， 2（b）對(duì)RAW 264.7細(xì)胞上清中NO含量的影響Fig.7 Effects of sample 1（a）， 2（b） on NO content in supernatant of RAW 264.7 cells

5 討論與結(jié)論

本研究在酶解基礎(chǔ)上，采用超聲輔助乙醇法提取防風(fēng)干燥根中的色原酮苷元，提取率有較大提高，苷元轉(zhuǎn)化徹底。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，運(yùn)用響應(yīng)面法對(duì)苷元提取條件進(jìn)行優(yōu)化，確定防風(fēng)總色原酮苷元的最佳提取工藝參數(shù)為：加酶量89.87%，酶解時(shí)間59.97 min，酶解溫度55.95℃。方差結(jié)果顯示，影響提取率的單因素依次為：反應(yīng)溫度 = 反應(yīng)時(shí)間 ＞ 加酶量。與傳統(tǒng)提取方法相比，該工藝操作容易，提取效率高，穩(wěn)定性好。纖維二糖酶安全環(huán)保，成本低廉。對(duì)總色原酮苷元提取物進(jìn)行體外抗炎活性研究，發(fā)現(xiàn)在小鼠巨噬細(xì)胞炎癥模型中，工藝優(yōu)化前后提取物的濃度大于25 mg/L時(shí)，均對(duì)上清液中一氧化氮（NO）分泌具有顯著抑制作用，而最佳提取條件下總色原酮苷元提取物25 mg/L時(shí)與優(yōu)化前提取物100 mg/L時(shí)作用相近，NO含量接近正常水平，具有良好的抗炎活性。為防風(fēng)創(chuàng)新藥物的研發(fā)提供參考，為防風(fēng)藥材的綜合開發(fā)利用提供了新的思路。