氚水對斑馬魚早期發(fā)育階段的劑量-效應關系研究

薛惠元 王天姿 劉坤 崔鳳梅 涂彧 孫亮

1蘇州大學蘇州醫(yī)學院放射醫(yī)學與防護學院，放射醫(yī)學與輻射防護國家重點實驗室，蘇州215123；2 溫州醫(yī)科大學公共衛(wèi)生與管理學院，溫州325035

沿海地區(qū)核設施的建設使得水生生態(tài)環(huán)境成為放射性污染物的主要接受者，核電正常運行時的液態(tài)流出物或事故后釋出的大量放射性污染物都會對海洋生態(tài)環(huán)境產生危害。近年來，由于核電排污的增加，導致氚的排放量增加，并引起了社會各界的廣泛關注。此外，氚可以迅速融入環(huán)境和生物系統(tǒng)，因此研究電離輻射在一定劑量范圍內對水生生物的影響很有必要。氚（3H）是氫元素的放射性同位素之一，會隨核反應裝置中的冷卻水排放入環(huán)境[1]。氚流動性極強，可通過食物鏈進入人體，對人類健康造成影響[2-3]。水生模式動物斑馬魚的基因與人類基因有著高達87%的相似度[4]。有研究結果表明，對非人類物種的研究結果可在一定程度上外推至人體[5]。針對斑馬魚早期發(fā)育階段氚暴露的生物效應也有諸多研究，其結果顯示氚暴露可誘發(fā)斑馬魚生長發(fā)育的改變[6-8]。此外，魚類早期發(fā)育階段被認為是其生命周期中最敏感的發(fā)育時期，可用作評估污染物毒性作用[9-10]。因此，本研究選擇處于早期發(fā)育階段的斑馬魚為研究對象，在前期斑馬魚輻射劑量評估的理論基礎上[11]，嘗試將觀察到的氚水對斑馬魚的輻射生物學效應與理論劑量計算相結合，以研究劑量-效應關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑

野生型斑馬魚（AB 品系）購于蘇州木芮生物科技有限公司。實驗經蘇州大學倫理委員會同意，符合《實驗動物護理和使用指南》的要求。

甲基纖維素（M0387-100G）由美國Sigma-Aldrich?公司提供；氚水（5 mCi，185 MBq）由美國PerkinElmer 股份有限公司提供；閃爍液（UItima Gold LLT, PerkinElmer）由美國PerkinElmer 股份有限公司提供。甲基纖維素溶液、E3 溶液由本實驗室自行制備。

根據購買氚水的出廠時間，計算配置溶液時氚水的活度，使用E3 溶液分別稀釋得到3.7×103、3.7×104、3.7×105Bq/ml 實驗用氚水。

1.2 氚水活度濃度測定及其吸收劑量率的計算

分別取培養(yǎng)皿中3.7×103、3.7×104、3.7×105Bq/ml 3 種濃度氚水各4.5 ml，與6.5 ml 閃爍液于20 ml液閃瓶中混合均勻，避光8～12 h。使用檢出限為5 Bq/L 的 液 體 閃 爍 計 數 器（Tri-Carb 2910TR，Quantulus 1220，美國PerkinElmer 股份有限公司）測量。使用公式（1）對氚樣品活度濃度進行計算：

式中，A 為氚樣品的活度濃度，單位 Bq/ml；cpms為待測氚樣品總計數率，單位計數每秒；cpmb為本底樣品總計數率，單位計數每秒；V 為測量所用溶液的體積，單位為ml； η為計數效率，無量綱。

根據生物實驗中所關注的發(fā)育階段及斑馬魚發(fā)育形態(tài)的差異，選用斑馬魚受精后24 h（24 hours post fertilization，24 hpf）胚胎和96 hpf 幼魚為建模對象，使用前期建立的胚胎和幼魚模型[11]?？紤]到散射影響，本研究模擬斑馬魚在培養(yǎng)皿中的實際情況建立相應模型：培養(yǎng)皿直徑為90 mm，高度為20 mm，內有30 枚斑馬魚胚胎或10 條斑馬魚幼魚和25 ml 溶液（根據模擬條件不同有所變化，具體如下文所述）。模擬內照射條件時，斑馬魚胚胎和幼魚幾何條件不變，培養(yǎng)皿中溶液為水，氚在胚胎、幼魚頭部、軀干及卵黃囊中均勻分布，源為各向同性。模擬外照射時，氚在溶液中均勻分布，源為培養(yǎng)皿中圓柱體體積源，直徑與培養(yǎng)皿內徑相同，源為各向同性。表1 為斑馬魚材料組成，游囊內氣體以空氣替代。應用蒙特卡羅軟件GATE（the geant4 application for tomographic emission）8.2 版，結合實驗條件對斑馬魚吸收劑量率進行計算[12]。

表1 斑馬魚受精后24 h 胚胎和96 h 幼魚模型的器官體積、密度和組成Table 1 Volume, density and composition of organs of zebrafish 24 hours post fertilization embryos and 96 hours post fertilization larvae models

建立斑馬魚早期發(fā)育階段氚染毒劑量計算模型（圖1）。

圖1 早期發(fā)育階段斑馬魚受精后24 h 胚胎和受精后96 h 幼魚氚染毒劑量計算模型 A 為模擬的培養(yǎng)皿形態(tài)；B 為將30 枚斑馬魚胚胎隨機分布于培養(yǎng)皿的30 個點位置；C 為將10 條斑馬魚幼魚隨機分布于培養(yǎng)皿的10 個點位置Figure 1 A model for the calculation of tritium contamination dose for 24 hous post fertilization embryos and 96 hours post fertilization larvae of zebrafish at early developmental stages

根據公式（2）計算斑馬魚的吸收劑量率：

式中，D 為劑量率，單位μGy/h；DCext為外照射劑量系數，單位μGy·L·Bq-1·h-1；DCint為內照射劑量系數，單位μGy·kg·Bq-1·h-1；Aw為水中氚的活度濃度，單位Bq/L；Ao為生物體中氚的活度濃度，單位Bq/kg。

實際實驗中，生物體內氚活度由于條件限制難以測量，因此采用濃度比的方法進行計算。本研究中采用Arcanjoa 等[13]文獻中的濃度比公式進行計算。

式中，CF 為濃度比，也稱為濃集因子，無量綱。定義為生物體內放射性核素的活度濃度與環(huán)境介質中放射性核素的活度濃度的比值。Ao為生物體中氚的活度濃度，單位Bq/kg；Aw為水中氚的活度濃度，單位Bq/L。

1.3 斑馬魚翻轉頻率和心率計數

1.3.1 斑馬魚染毒

取10 對成年斑馬魚，雌雄1∶1 配比放入生殖缸，待受精后收集胚胎，28℃恒溫保存在E3 培養(yǎng)液中。對照組為E3 溶液，處理組氚水的3 種濃度分別為3.7×103、3.7×104、3.7×105Bq/ml。將3 hpf胚胎分別暴露于E3 溶液和 3 種不同濃度的氚水中，每組50 枚，并重復3 次實驗。

1.3.2 斑馬魚胚胎翻轉實驗

受精后24 h，在上述3 種不同濃度的氚水中用簡單隨機抽樣方法各選取30 枚斑馬魚胚胎，體式顯微鏡（中國麥克奧迪實業(yè)集團有限公司，Motic SMZ-168）測定胚胎1 min 翻轉次數。

1.3.3 斑馬魚幼魚心率

受精后96 h，在上述3 種不同濃度的氚水中用簡單隨機抽樣方法各選取10 條斑馬魚幼魚，將其放入甲基纖維素中進行固定，測定20 s 心率。各階段結果取平均值。

1.4 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 20.0 軟件對數據進行統(tǒng)計學分析。符合正態(tài)分布的數據以±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，對照組與處理組之間的比較采用LSD-t檢驗（方差齊）。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 斑馬魚幼魚氚染毒劑量計算模型和吸收劑量率

由表2 可知，氚活度濃度的測定結果與理論濃度值的誤差在5%以內， 24 hpf 斑馬魚胚胎和96 hpf 幼魚的內照射劑量系數一致，外照射劑量系數均高于內照射劑量系數，這可能是因為實驗條件無法滿足“均勻各項同性模型”的假設條件，培養(yǎng)皿的材料中產生了一定的散射線所致；外照射劑量系數96 hpf 幼魚要略高于24 hpf 胚胎，這可能與外形和材料組成的不同有關。因此，雖然斑馬魚幼魚氚的實際濃度比較低，但是最終氚的吸收劑量率幼魚略高于胚胎。

表2 受精后24 h 斑馬魚胚胎與96 h 幼魚在不同濃度氚水中的測量濃度、濃度比、內外照射劑量系數和吸收劑量率Table 2 Measured concentration, concentration ratio, internal and external radiation dose coefficient and absorbed dose rate after exposure of 24 hours post fertilization embryos and 96 hours post fertilization larvae of zebrafish in different concentrations of tritium water

2.2 氚水對斑馬魚翻轉頻次和心率的影響

由表2 可知，24 hpf 斑馬魚胚胎在3.7×103、3.7×104、3.7×105Bq/ml 3 種不同濃度的氚水中對應的吸收劑量率分別為2.15×10、2.21×102、2.55×103μGy/h。氚水暴露后，斑馬魚胚胎翻轉頻率和斑馬魚幼魚心率結果如圖2 所示。各組間斑馬魚胚胎翻轉頻率的差異有統(tǒng)計學意義（F=7.64，P＜0.001），與對照組相比，3.7×103Bq/ml 氚水處理組斑馬魚胚胎翻轉頻率明顯減少（t=3.94，P＜0.001）；3.7×104Bq/ml 氚水處理組斑馬魚胚胎翻轉頻率雖有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（t=-0.06，P=0.95）；3.7×105Bq/ml 氚水處理組斑馬魚胚胎翻轉頻率無明顯改變（t=0.17，P=0.87）。

圖2 氚水對受精后24 h 斑馬魚胚胎翻轉頻率和受精后96 h 斑馬魚幼魚心率的影響 a 表示與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.94、2.86、12.12，P＜0.001、=0.01、＜0.001）Figure 2 Effects of tritiated water on the frequency of zebrafish embryo flipping at 24 hours post fertilization and on the heart rate of zebrafish larvae at 96 hours post fertilization

96 hpf 斑馬魚幼魚在3 種不同濃度的氚水暴露下，相對應的劑量率分別為2.95×10、3.03×102、3.47×103μGy/h，3 組間斑馬魚幼魚心率的比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=93.85，P＜0.001）。由圖2 可見，與對照組相比，3.7×103Bq/ml 氚水處理組斑馬魚幼魚心率明顯下降（t=2.86，P=0.01），而3.7×105Bq/ml 氚水處理組斑馬魚幼魚心率上升（t=-12.12，P＜0.001），3.7×104Bq/ml 氚水處理組斑馬魚幼魚的心率無明顯變化（t=1.27，P=0.21）。

3 討論

斑馬魚胚胎和幼魚對輻射環(huán)境較敏感，低劑量輻射即可對其發(fā)育產生影響，還伴隨著DNA 損傷和基因表達的變化。Gagnaire 等[9]和Arcanjo 等[14]用氚水對斑馬魚胚胎和幼魚進行染毒，結果顯示，0.4 mGy/h 和4 mGy/h 2 種劑量率的斑馬魚自發(fā)翻轉次數與對照組的差異無統(tǒng)計學意義，但隨著發(fā)育時間的不同，自發(fā)翻轉次數也有變化；在0.4 mGy/h劑量率下，96 hpf 幼魚游泳活性較對照組有明顯下降，但在4 mGy/h 劑量率下，2 組的差異無統(tǒng)計學意義。其原因可能與氚水調節(jié)編碼肌肉收縮的相關基因引起DNA 損傷、神經毒性及免疫毒性有關。有研究結果表明，自然情況下，斑馬魚胚胎自發(fā)翻轉頻率先上升后下降，在19 hpf 時達到巔峰，然后至26 hpf 緩慢下降[15]。在另一項關于雙酚A 對斑馬魚神經發(fā)育毒性的研究結果也表明，發(fā)育時間的長短可以影響斑馬魚胚胎自發(fā)翻轉[16]。在本研究中，2.21×102μGy/h 吸收劑量率下，胚胎自發(fā)翻轉頻率輕微上升，可能是因為我們實驗觀察斑馬魚翻轉情況是在受精后23～27 h 進行，從而由于發(fā)育時間的不同造成的。因此在本研究所對應的吸收劑量率下，也許會影響斑馬魚有關神經發(fā)育或肌肉運動的基因表達；同時，高劑量誘發(fā)了斑馬魚胚胎的損傷保護機制，使得較高劑量氚水處理組胚胎翻轉頻率與對照組無明顯差異。

Arcanjo 等[6]在0.4 mGy/h 和4 mGy/h 2 種氚暴露劑量情況下，對 24 hpf 斑馬魚胚胎和96 hpf 斑馬魚幼魚進行轉錄組分析，結果表明，無論劑量率如何，在24 hpf 斑馬魚胚胎中，氚水污染對斑馬魚調控肌肉收縮的基因均有影響，但在不同劑量率下差異表達基因的種類及調控方式不同，只有少部分差異表達基因之間有所重疊。在劑量率為0.4 mGy/h時，暴露于氚水24 h 后，有關斑馬魚肌肉收縮的基因有所上調，而劑量率為4 mGy/h 時，有關斑馬魚肌肉收縮的基因卻出現下調的情況。本研究中，3.7×103Bq/ml與3.7×105Bq/ml 不同濃度氚水處理組斑馬魚卻表現出截然相反的心率變化，其可能原因是由于基因表達不同所造成的。Arcanjo 等[14]在之后的研究中對72 hpf、96 hpf 斑馬魚心率進行觀察，結果顯示，發(fā)育時間對不同劑量率的心率有顯著的影響，生物體也許可以通過早期基因表達的變化來應對氚毒性效應。

斑馬魚24 hpf 和96 hpf 是輻射生物學效應研究中觀察生物學評價終點常見的時間點。本研究通過觀察氚染毒條件下斑馬魚24 hpf、96 hpf 這2 個重要發(fā)育階段的翻轉頻率和心率生物學指標，結合實驗環(huán)境，計算斑馬魚早期發(fā)育階段的吸收劑量率，將劑量計算結果與觀察到的生物效應相結合，結果表明，斑馬魚受照劑量隨發(fā)育時間的增長有所提高，這可能是由于幼魚破膜骨性材料增加所致。斑馬魚胚胎翻轉實驗中，當前劑量率中胚胎翻轉頻率的輕微上升可能是胚胎發(fā)育時間輕微不同和有關神經發(fā)育或肌肉運動的基因表達受到影響造成的。較高劑量處理組翻轉頻率與對照組無明顯差異，這可能是由于高劑量誘發(fā)了胚胎的損傷保護機制所致。同時，胚胎自發(fā)翻轉的實效性，對在一個時間段內進行的翻轉計數結果有一定的影響，后期實驗應盡量避免該情況。在斑馬魚心率實驗中，幼魚心率隨濃度的變化可能是由于不同劑量率下，基因調控行為不同而導致的。

本研究由于魚體較小，且發(fā)育速度較快，未開展不同組織滯留核素相互影響的定量分析。并且假設核素在氚染毒環(huán)境和斑馬魚器官內均勻分布，這一假定對于某些體內再分布的核素而言具有一定局限性。上述假定和不足都是今后優(yōu)化斑馬魚模型和進行劑量-效應關系研究工作的重點。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突

志謝 感謝江蘇省高校協同創(chuàng)新中心對本研究的支持

作者貢獻聲明 薛惠元負責模型的建立、論文的撰寫；王天姿負責實驗內容與數據的分析；劉坤負責數據的采集與整理；崔鳳梅、涂彧負責論文撰寫的指導與修改；孫亮負責論文的設計、審閱與修改