食源性阪崎腸桿菌檢測(cè)方法研究進(jìn)展

鄧麗萍 鄧訪萍 張琴

摘 要：阪崎腸桿菌可感染嬰幼兒，引發(fā)腦膜炎、菌血癥和壞死性小腸結(jié)腸炎。因此，探究出快速、靈敏、高效的阪崎腸桿菌檢測(cè)方法對(duì)于保障食品質(zhì)量安全至關(guān)重要。目前，阪崎腸桿菌的檢測(cè)方法中比較常見的是分離鑒定法、分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)和免疫學(xué)檢測(cè)法。分離鑒定法易于操作、成本低，但檢測(cè)周期長(zhǎng)，無(wú)法滿足對(duì)目標(biāo)食品快速檢測(cè)的需求；分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)是一種高靈敏度和特異性的檢測(cè)手段，但是由于其對(duì)檢測(cè)人員要求高，所需設(shè)備和試劑價(jià)格昂貴，目前多在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，不適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)；免疫學(xué)檢測(cè)方法簡(jiǎn)單快捷，適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢驗(yàn)，但容易受到其他雜菌的影響，敏感性較低。本文綜述了分離鑒定法、分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)、免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)等多種阪崎腸桿菌的檢測(cè)方法，結(jié)合參考文獻(xiàn)就檢測(cè)研究進(jìn)展予以分析，以期為食品中阪崎腸桿菌的快速檢測(cè)方法研究提供參考。

關(guān)鍵詞：阪崎腸桿菌；檢測(cè)方法；研究進(jìn)展

Research Progress in Detection Methods for Foodborne Enterobacter sakazakii

DENG Liping1，2，3， DENG Fangping4， ZHANG Qin1，2，3

（1.Guangdong Food Quality Supervision and Inspection Station， Guangzhou 511442， China;

2.Guangdong Food Industry Institute Limited Company， Guangzhou 511442， China;

3.Guangdong Provincial Food Industry Public Laboratory， Guangzhou 511442， China;

4.The First Hospital of Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou 510080， China）

Abstract： Trace amounts of E. sakazakii can infect newborns and young children， causing meningitis， septicaemia and necrotising small bowel colitis， among others. Therefore， exploring a rapid， sensitive and efficient detection method for E. sakazakii is essential for ensuring food quality and safety. At present， conventional isolation and identification， molecular biology and immunological detection methods for E. sakazakii are more common. The separation and identification method is easy to operate and low cost， but the detection cycle is long， which can not meet the demand for rapid detection of target food. Molecular biotechnology is a highly sensitive and specific means of detection， but due to its high demand for test technicians， the required equipment and reagents are expensive， and is currently mostly carried out in the laboratory， is not suitable for on-site testing. The method of immunological determination is simple and fast， which is suitable for field rapid detection， but it is easy to be interfered with other miscellaneous bacteria and its sensitivity is not high enough. In this paper， separation and identification method， molecular biological detection techniques， immunological detection techniques and other detection methods of E. sakazakii were reviewed， and the research progress of detection was analyzed in combination with references， in order to provide reference for the rapid detection of E. sakazakii in food.

Keywords： Enterobacter sakazakii; detection method; research progress

阪崎腸桿菌（又稱阪崎氏腸桿菌）是一種寄生于人和動(dòng)物腸道內(nèi)的條件致病菌，在自然界中分布廣泛，具有一定的耐熱性、耐干燥性、耐高滲環(huán)境性，可抵抗超高溫瞬時(shí)滅菌。奶粉被認(rèn)為是其主要的傳播途徑，微量的阪崎腸桿菌（≥3 CFU/100 g）就可能導(dǎo)致感染的發(fā)生，可引發(fā)新生兒腦膜炎、菌血癥和壞死性小腸結(jié)腸炎等病癥，甚至?xí)?dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥和發(fā)育障礙。來(lái)自美國(guó)FDA的監(jiān)測(cè)表明，在美國(guó)出生體重偏低的新生兒中，阪崎腸桿菌感染率為8.7/10萬(wàn)；而1歲以下嬰兒阪崎腸桿菌感染率為1/10萬(wàn)，感染死亡率為20%～50%，1961—2003年全球有案可查的48起嬰兒感染事件中，有25起是新生兒感染[1]。因此，探究出一種快速靈敏、簡(jiǎn)便高效的檢測(cè)阪崎腸桿菌的方法至關(guān)重要。目前阪崎腸桿菌的檢測(cè)方法主要有分離鑒定法、分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)、免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)等[2]。本文將對(duì)上述檢測(cè)方法的研究進(jìn)展進(jìn)行對(duì)比分析，為建立更加敏感、高效的阪崎腸桿菌檢測(cè)方案提供參考。

1 分離鑒定法

由于受生物化學(xué)、形態(tài)等方面的限制，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)阪崎腸桿菌的分離鑒定主要采用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織（International Organization for Standardization，ISO）及食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）規(guī)定的方法。2008年我國(guó)也制定了阪崎腸桿菌的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，2016年又進(jìn)行了修正，規(guī)范了阪崎腸桿菌的檢測(cè)[3]。除了這些典型的檢測(cè)方法，還有在FDA法基礎(chǔ)上改進(jìn)的DFI法，擬以5-溴-4-氯-吲哚-α-D-吡喃葡萄糖苷（XαGLC）為發(fā)色團(tuán)，以α-葡萄糖苷酶為底物，通過(guò)水解XαGLC，使其呈現(xiàn)特殊的藍(lán)綠色[4]。此外，國(guó)內(nèi)外學(xué)者也嘗試使用一些相對(duì)快速的傳統(tǒng)檢驗(yàn)方法進(jìn)行阪崎腸桿菌檢測(cè)。例如，李潔莉等[5]采用VITEK全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)對(duì)阪崎腸桿菌人工污染的嬰兒配方乳粉進(jìn)行檢測(cè)，把30種生化反應(yīng)培養(yǎng)基固定到鑒定卡上，依據(jù)細(xì)菌在鑒定卡各種生化反應(yīng)孔中生長(zhǎng)變化情況，利用數(shù)值法判斷、針對(duì)性識(shí)別；宋春美等[6]利用試劑盒實(shí)現(xiàn)了乳粉中阪崎桿菌的污染檢測(cè)等。阪崎腸桿菌的分離與鑒別方法存在耗時(shí)長(zhǎng)、不易區(qū)分、易產(chǎn)生“假陽(yáng)性”等問(wèn)題，盡管經(jīng)過(guò)改進(jìn)，其檢出速度及特異性均得到了提高，但仍然存在難以區(qū)分的問(wèn)題。

2 分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)

2.1 單重PCR

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)技術(shù)（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一種比較成熟的分子生物學(xué)技術(shù)，它以細(xì)菌特有的毒性基因?yàn)槟０?，通過(guò)擴(kuò)增目標(biāo)基因?qū)崿F(xiàn)對(duì)阪崎腸桿菌的快速檢測(cè)。在2003年，KEYSER等[7]首次報(bào)道了用基因設(shè)計(jì)引物序列對(duì)阪崎腸桿菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，這一方法是根據(jù)16S rRNA基因序列來(lái)設(shè)計(jì)引物的。

2.2 多重PCR

多重PCR是通過(guò)在同一個(gè)PCR系統(tǒng)中添加兩對(duì)或多對(duì)引物，實(shí)現(xiàn)多個(gè)目標(biāo)基因的同步檢測(cè)。采用多重PCR方法，通過(guò)將不同的引物加入相同的PCR反應(yīng)中，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)病原體的同時(shí)檢測(cè)，并對(duì)特定的致病基因進(jìn)行鑒定，從而極大地提高檢測(cè)效率。為減少單重PCR可能造成的假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)，葉應(yīng)旺等[8]基于阪崎腸桿菌，構(gòu)建了一種以α-1，4-葡萄糖苷酶及OmpA為標(biāo)靶的雙重PCR法，用于快速、準(zhǔn)確地測(cè)定阪崎腸桿菌。為了提高PCR結(jié)果的準(zhǔn)確性，ZHOU等[9]利用固定化技術(shù)，構(gòu)建了一種能同時(shí)測(cè)定3 CFU·mL-1目標(biāo)菌含量的多重PCR體系。與單重PCR相比，采用雙重PCR檢測(cè)阪崎腸桿菌的方法雖然靈敏度可能有所降低，但可實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確測(cè)定，提高了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。梁會(huì)營(yíng)等[10]以阪崎腸桿菌ompA基因和金葡菌nuc基因?yàn)檠芯繉?duì)象，采用雙重PCR技術(shù)，獲得282 bp、482 bp的兩個(gè)擴(kuò)增片段；侯殿東等[11]基于阪崎腸桿菌ompA基因、沙門氏菌屬侵襲性抗原（invA），建立了能同步檢測(cè)阪崎腸桿菌與沙門氏菌的雙重PCR方法；李洋洋等[12]對(duì)反應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行了優(yōu)化，設(shè)計(jì)3對(duì)引物用于多重PCR擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)了對(duì)嬰兒乳粉中阪崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌的同時(shí)測(cè)定。

2.3 熒光定量PCR

美國(guó)PE公司于1995年提出了一種核酸定量方法，即通過(guò)設(shè)計(jì)特定的熒光標(biāo)記探針，或?qū)晒馊玖弦敕磻?yīng)系統(tǒng)中，對(duì)PCR反應(yīng)中的放大產(chǎn)物進(jìn)行跟蹤檢測(cè)，并利用熱分解曲線軟件對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，獲得最優(yōu)的模板濃度。PCR檢測(cè)不僅可以定性，還可以定量。相對(duì)于傳統(tǒng)PCR，熒光定量PCR具有檢測(cè)模板數(shù)目精確、動(dòng)力學(xué)范圍大、敏感性高等優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA片段存在與否的判定，同時(shí)還能測(cè)定DNA的拷貝數(shù)，進(jìn)行定量檢測(cè)，而傳統(tǒng)PCR僅能實(shí)現(xiàn)半定量；此外，因?yàn)镻CR是在反應(yīng)管內(nèi)進(jìn)行的，所以熒光定量PCR的研究樣品被污染的概率大大降低，也無(wú)須通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)評(píng)估，節(jié)省了許多操作時(shí)間，提高了實(shí)驗(yàn)效率。不過(guò)，熒光定量PCR也有其局限性，即不能區(qū)分是否停止發(fā)育和失去活性的細(xì)菌。但也不能只關(guān)注熒光定量PCR的局限性，就忽略它的特異性，因其特異性，熒光定量PCR已廣泛應(yīng)用于食源性病原菌的檢測(cè)[13]。SEO等[14]針對(duì)阪崎腸桿菌大分子合成操縱子基因，確定了實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)阪崎腸桿菌的可行性。利用該技術(shù)應(yīng)用于臨床樣本中，對(duì)目標(biāo)菌進(jìn)行檢驗(yàn)，均未出現(xiàn)任何錯(cuò)誤性的結(jié)果，表明其準(zhǔn)確性高。2011年，F(xiàn)DA將該方法定為篩選和確認(rèn)嬰兒奶粉中阪崎腸桿菌的一種有效檢驗(yàn)方法[15]。

2.4 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）技術(shù)是Notomi于2000年提出的一種核酸放大方法，其基本原理是在目標(biāo)基因6或8位點(diǎn)上設(shè)計(jì)4或6個(gè)引物，采用替換鏈DNA聚合酶，使其在恒溫條件下1 h即可實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，并根據(jù)熒光顏色及渾濁度的變化判斷其結(jié)果[16]。賀楠等[17]、胡連霞[18]和張宏偉等[19]分別根據(jù)阪崎腸桿菌16S rRNA、ITS序列等特異基因，設(shè)計(jì)出相應(yīng)的LAMP引物，建立了一種靈敏的LAMP快速檢測(cè)技術(shù)。實(shí)驗(yàn)證明，該方法具有較高的特異性和敏感性，操作簡(jiǎn)單，便于推廣。近年來(lái)，LAMP技術(shù)在疾病診斷、食品安全方面都得到了廣泛應(yīng)用[20]。

2.5 核酸探針技術(shù)

2.5.1 熒光原位雜交技術(shù)

熒光原位雜交（Fluorescence in Situ Hybridization，F(xiàn)ISH）是一種將細(xì)胞原位雜交和熒光相結(jié)合的新方法?；谮嫫槟c桿菌的16S rRNA基因，ALMEIDA等[21]利用熒光原位雜交方法，構(gòu)建了多肽核酸分子探針，實(shí)現(xiàn)了對(duì)嬰兒奶粉中阪崎腸桿菌的高靈敏、高特異的快速檢測(cè)。熒光原位雜交技術(shù)彌補(bǔ)了PCR技術(shù)無(wú)法區(qū)分死菌活菌的不足，理論上僅能檢測(cè)出活菌，且無(wú)須從模板DNA中提取，操作簡(jiǎn)便。同樣基于阪崎腸桿菌的16S rRNA基因，VermiconAG公司也設(shè)計(jì)了一種特殊的熒光標(biāo)記的基因探針，并將其商品化。

2.5.2 基因芯片

基因芯片技術(shù)的原理是通過(guò)目標(biāo)物與已知序列的核酸探針雜交，然后用熒光探測(cè)器掃描該信號(hào)，從而得到檢測(cè)結(jié)果?；蛐酒煞譃楣押塑账岷蚦DNA兩種芯片?；?種阪崎腸桿菌的 ITS 測(cè)序序列及GenBank測(cè)序結(jié)果，LIU等[22]以ITS為目標(biāo)片段，設(shè)計(jì)2對(duì)引物，10個(gè)探針，選擇性富集，檢測(cè)限可達(dá)

1.3 CFU/100 g。該檢測(cè)技術(shù)具有高通量、操作簡(jiǎn)單快捷、特異性強(qiáng)以及靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，但是技術(shù)復(fù)雜、設(shè)備價(jià)格高、檢測(cè)限較高、檢測(cè)重復(fù)性差以及應(yīng)用分析范圍窄這些問(wèn)題還有待解決。

3 免疫學(xué)檢測(cè)方法

免疫學(xué)檢測(cè)是憑借抗原與抗體結(jié)合的特異性，對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行定性與定量分析，具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、速度快，可同時(shí)測(cè)定多個(gè)樣本等特點(diǎn)。免疫磁珠富集法、ELISA法、免疫熒光法、免疫熒光法以及免疫傳感法等是免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)。

3.1 免疫磁性微球珠富集技術(shù)

免疫磁性微球珠富集技術(shù)是通過(guò)在磁性微球表面修飾特定抗原（或抗體），使待測(cè)樣品與其發(fā)生特異性反應(yīng)，通過(guò)磁分離，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的富集。金燕飛等[23]采用陽(yáng)離子磁珠捕集法對(duì)乳粉中阪崎腸桿菌進(jìn)行了分析，并將其與磁性微球進(jìn)行偶聯(lián)，利用磁珠捕獲技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)乳粉中阪崎腸桿菌的同步富集，從而縮短了檢測(cè)時(shí)間，提高了對(duì)該菌株的檢測(cè)效率。

3.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）利用抗原（抗體）可以吸附在固相載體上，使其具有一定的免疫活性，而當(dāng)檢測(cè)對(duì)象被添加到固相載體表面吸附的抗體或抗原中時(shí)，則會(huì)與這抗原或抗體發(fā)生作用，使其發(fā)生變色，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)檢測(cè)對(duì)象的定性或定量分析，包括直接ELISA、雙抗夾心ELISA、dot-ELISA等。汪琳等[24]制備了抗阪崎腸桿菌單克隆抗體，并初步建立了ELISA檢測(cè)方法。石曼[25]通過(guò)間接ELISA初步研究了阪崎腸桿菌的酶聯(lián)免疫分析方法，也制備了高效價(jià)、高特異性的阪崎腸桿菌多克隆抗體。相對(duì)于常規(guī)的培養(yǎng)檢測(cè)方法，ELISA方法快速、靈敏、特異，為食品檢驗(yàn)及臨床診斷提供了一種新方法，有很好的應(yīng)用前景。

3.3 免疫熒光技術(shù)

免疫熒光技術(shù)的原理是在抗原（或抗體）上標(biāo)記一種熒光染料，當(dāng)被檢測(cè)物與該抗原（或抗體）發(fā)生特異作用時(shí)，該復(fù)合物上就會(huì)出現(xiàn)一種熒光物質(zhì)，通過(guò)觀察該熒光物質(zhì)的存在與否，可以判定該抗原或抗體有沒有發(fā)生特異結(jié)合。支援等[26]利用具有特殊光學(xué)性質(zhì)的量子點(diǎn)作為熒光染料，標(biāo)記免疫磁珠富集阪崎腸桿菌，建立了一種快速檢測(cè)阪崎腸桿菌的新方法，該方法的整個(gè)檢測(cè)過(guò)程僅需要2 h，檢測(cè)限約為100 CFU·mL-1。

3.4 電化學(xué)免疫傳感器技術(shù)

電化學(xué)免疫傳感器技術(shù)是利用抗體與抗原反應(yīng)的特異性，將這相互作用轉(zhuǎn)換在電化學(xué)傳感元件上，利用電感元件將被檢測(cè)物的濃度信號(hào)轉(zhuǎn)化成對(duì)應(yīng)的電信號(hào)，從而檢測(cè)和分析被測(cè)物。趙廣英等[27]以阪崎腸桿菌為研究對(duì)象，制備了一種新型的具有高靈敏度、高選擇性、高穩(wěn)定性且成本低的免疫電極，并將其用于阪崎腸桿菌的檢測(cè)，為阪崎腸桿菌的快速檢測(cè)提供了一種新方法。

4 其他技術(shù)

隨著檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，對(duì)阪崎腸桿菌的檢測(cè)已經(jīng)形成了多種檢測(cè)手段，還出現(xiàn)了自動(dòng)化的檢測(cè)體系，使得阪崎腸桿菌的檢測(cè)更加便捷、準(zhǔn)確和可靠。IVERSEN等[28]通過(guò)16S rRNA測(cè)序及生物化學(xué)特性分析，發(fā)現(xiàn)ANN在表型及基因型區(qū)分阪崎腸桿菌及近緣細(xì)菌的準(zhǔn)確率達(dá)99.3%，但其分子機(jī)制尚不清楚。通過(guò)ANN方法對(duì)其他具有α-葡萄糖苷酶陽(yáng)性的阪崎腸桿菌及其他具有α-葡萄糖苷酶活性的菌株進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)16S rRNA的鑒定準(zhǔn)確率可達(dá)98.7%，且能獲得準(zhǔn)確的生物化學(xué)特性分析結(jié)果。趙紅陽(yáng)等[29]采用基質(zhì)輔助激光解析-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)，對(duì)40株阪崎腸桿菌及1株陰溝腸桿菌進(jìn)行了測(cè)定，其中阪崎腸桿菌包括38株野生阪崎腸桿菌和2株標(biāo)準(zhǔn)菌株。歐靜堃[30]制備以阪崎腸桿菌為抗原的膠體金免疫層析試紙條，并以此構(gòu)建了檢測(cè)阪崎腸桿菌的快速檢測(cè)方法。除此之外，還有很多方法可以用于阪崎腸桿菌的檢測(cè)，包括隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA、質(zhì)粒以及核糖核酸分型等。

5 結(jié)語(yǔ)

阪崎腸桿菌常規(guī)檢測(cè)技術(shù)所需測(cè)試費(fèi)用較低，對(duì)操作者的要求較低，但耗時(shí)長(zhǎng)、準(zhǔn)確度和特異度較低，易產(chǎn)生假陰或假陽(yáng)性結(jié)果，無(wú)法滿足快速檢測(cè)的要求。分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但其對(duì)技術(shù)人員要求很高，所需的試劑及設(shè)備也比較昂貴，多在實(shí)驗(yàn)室中使用，不適于現(xiàn)場(chǎng)檢驗(yàn)。免疫學(xué)分析技術(shù)簡(jiǎn)單、快速，特別是免疫層析試紙條便于攜帶，適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，但是容易受到其他雜菌的影響，且靈敏度較低。阪崎腸桿菌的檢測(cè)方法各有利弊，但隨著科技的不斷進(jìn)步和各學(xué)科的交叉融合，各種方法的聯(lián)合應(yīng)用將會(huì)是今后阪崎腸桿菌快速檢測(cè)的一個(gè)重要方向。

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