鮮食葡萄采后霉菌的分離與鑒定

付清泉 王方方 李甜 史學(xué)偉 王斌

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（31960465）；石河子大學(xué)青年創(chuàng)新人才培育計(jì)劃（CXBJ202004）；五師科技計(jì)劃項(xiàng)目（202101）；七師科技計(jì)劃項(xiàng)目（2022B01）。

作者簡(jiǎn)介：付清泉（1997—），男，河南信陽(yáng)人，碩士。研究方向：食品微生物。

通信作者：王斌（1985—），男，湖南株洲人，博士，副教授。研究方向：食品微生物。E-mail：binwang0228@shzu.edu.cn。

摘 要：本研究以“紅提”葡萄為原料，采用經(jīng)典微生物純培養(yǎng)技術(shù)從葡萄表皮分離致腐霉菌，根據(jù)柯赫法則對(duì)致腐性霉菌進(jìn)行驗(yàn)證，采用形態(tài)學(xué)分析和ITS測(cè)序?qū)χ赂咕M(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，“紅提”葡萄表皮致腐霉菌主要有鏈格孢菌、黑曲霉、黃曲霉。本研究可為鮮食葡萄貯藏保鮮過(guò)程中霉菌的防控提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：葡萄；霉菌；分離與鑒定；返接

Isolation and Identification of Epidermal Mold from Fresh Grape

FU Qingquan， WANG Fangfang， LI Tian， SHI Xuewei， WANG Bin*

（School of Food Science and Technology， Shihezi University， Shihezi 832000， China）

Abstract： In this study， using “Hongti” grape as raw material， rot-causing fungi were isolated from grape epidermis by classical microbial pure culture technology. The rot-causing fungi were verified according to Kochs law， and identified by morphological analysis and ITS sequencing. The results showed that the pathogenic fungi of “Hongti” grape skin mainly included Alternaria alternata， Aspergillus niger， and Aspergillus flavus. This study provide a theoretical basis for the prevention and control of mold in the process of fresh grape storage and preservation.

Keywords： grape; mould; isolation and identification; return connection

葡萄屬于葡萄科葡萄屬漿果類水果，分布廣泛[1]。葡萄不僅味美多汁，而且營(yíng)養(yǎng)十分豐富，富含維生素、花青素、多酚類物質(zhì)，具有抗氧化、抗衰老、預(yù)防癌癥和緩解低血糖等多重功效，深受廣大消費(fèi)者喜愛(ài)[2]。由于葡萄汁多皮薄，采后極易受到各種病原微生物的侵染，使果實(shí)表面失水皺縮和破裂，造成全果腐爛變質(zhì)，縮短葡萄貯藏期，降低葡萄果實(shí)品

質(zhì)[3-4]。引起葡萄果實(shí)腐敗變質(zhì)的真菌主要有霜霉菌、灰葡萄孢、黑曲霉等，分別可引起葡萄霜霉病、灰霉病、黑粉病等，嚴(yán)重影響葡萄的外觀品質(zhì)和銷售價(jià)值[5-6]。因此，了解葡萄表皮優(yōu)勢(shì)腐敗霉菌的組成，對(duì)延長(zhǎng)葡萄的貯存期具有十分重要的指導(dǎo)意義。

以石河子市“紅提”葡萄為實(shí)驗(yàn)材料，采用傳統(tǒng)的微生物分離手段對(duì)鮮食葡萄采后常溫貯藏過(guò)程中腐敗變質(zhì)的葡萄果實(shí)表面致腐霉菌進(jìn)行分離與篩選，明確引起葡萄采后腐爛變質(zhì)的主要致腐霉菌種類。經(jīng)形態(tài)學(xué)、顯微觀察、真菌ITS區(qū)測(cè)序分析，對(duì)致腐霉菌進(jìn)行分類鑒定，確定采后常溫貯藏過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)腐敗霉菌種類。該研究采用致腐性實(shí)驗(yàn)和返接侵染實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證相結(jié)合的方式，最終確定采后葡萄的優(yōu)勢(shì)腐敗霉菌，為鮮食葡萄果實(shí)貯藏保鮮過(guò)程中霉菌的防治提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄品種為“紅提”，在石河子市本地采摘后置于（25±0.5）℃貯藏；PDA培養(yǎng)基；北京索萊寶真菌基因組DNA提取試劑盒。

1.2 儀器與設(shè)備

SFC-288光學(xué)顯微鏡，上海光學(xué)儀器有限公司；BSA224S萬(wàn)分之一電子天平，濟(jì)南歐萊博科學(xué)儀器有限公司；LabCycler梯度PCR儀，德國(guó)SensoQuest有限責(zé)任公司；YXQ-100G立式壓力蒸汽滅菌器，上海東亞壓力容器制造有限公司；MJ-70F-I微生物恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；GelDoc XR+凝膠成像儀，伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 葡萄表面霉菌的分離純化與保藏

稱取葡萄10 g，放入90 mL無(wú)菌的生理鹽水中，在搖床中搖晃4 h后制成質(zhì)量濃度為10-1 g·mL-1的菌液。然后以10倍梯度稀釋成10-2 g·mL-1、10-3 g·mL-1、

10-4 g·mL-1等不同質(zhì)量濃度的菌液。分別吸取不同濃度的菌懸液100 μL均勻涂布于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato Dextrose Agar，PDA）培養(yǎng)基中，28 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d。選擇菌落形態(tài)特征完全不同的霉菌，采用三點(diǎn)法轉(zhuǎn)接到新的PDA培養(yǎng)基上，28 ℃，3～

5 d，連續(xù)培養(yǎng)2～3次，直至培養(yǎng)基上出現(xiàn)單一菌落。將純化后的單一菌落轉(zhuǎn)接至PDA斜面培養(yǎng)基中28 ℃培養(yǎng)5～7 d，4 ℃保存?zhèn)溆肹7-8]。

1.3.2 葡萄表面霉菌的形態(tài)觀察

采用插片法，在接種純化后的霉菌菌絲PDA培養(yǎng)基中傾斜插入滅菌干燥的蓋玻片，經(jīng)培養(yǎng)3～5 d后輕輕取出蓋玻片置于40倍顯微鏡下觀察霉菌的菌落形態(tài)、顏色、生長(zhǎng)情況和形狀等，參照真菌形態(tài)學(xué)鑒定手冊(cè)對(duì)不同霉菌種類進(jìn)行初步鑒定，確定葡萄表皮霉菌的組成[9]。

1.3.3 葡萄表面霉菌的菌株鑒定

參照索萊寶真菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書，提取DNA溶液于-20 ℃保存?zhèn)溆?。以提取出的霉菌DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)[10]。檢測(cè)無(wú)誤后將產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，將得到的序列在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）中使用GenBank中的Blast軟件進(jìn)行序列比對(duì)，然后用MEGA-X軟件中的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，對(duì)序列的相似性進(jìn)行分析[11]。

1.3.4 返接實(shí)驗(yàn)

選取形狀相似新鮮無(wú)病害的葡萄，用75%乙醇浸泡5 s，無(wú)菌水清洗3次后取出、晾干水分備用。用滅菌牙簽在果實(shí)腰部穿刺3次，挑取純化后的霉菌菌絲接入孔內(nèi)，置于滅菌培養(yǎng)皿中，蓋上滅菌紗布，每天觀察葡萄發(fā)病情況。根據(jù)科赫法則，觀察返接葡萄果實(shí)上的致腐霉菌與此前分離純化菌種是否

相同[11-12]。

1.3.5 溫度對(duì)葡萄表皮霉菌生長(zhǎng)情況的影響

將培養(yǎng)3～5 d的霉菌采用點(diǎn)接法接種至新的PDA平板上，分別在20 ℃、22 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃和30 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。每隔24 h測(cè)定菌落直徑，每個(gè)平行重復(fù)3次，考察霉菌在不同溫度下的生長(zhǎng)情況。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

運(yùn)用NCBI中的Blast對(duì)ITS區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物序列進(jìn)行在線比對(duì)，并下載相似序列，采用MEGA-X構(gòu)建致腐霉菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄表面霉菌菌落形態(tài)描述

對(duì)新疆維吾爾自治區(qū)石河子市的鮮食“紅提”葡萄進(jìn)行采后常溫貯藏霉變后，通過(guò)對(duì)腐敗葡萄表皮的霉菌進(jìn)行3～5次分離純化，得到了菌落顏色、形狀等不同的8種霉菌，分別命名為M1、M5、M6、M7、M8、M9、M12和M18，如圖1所示。

2.2 葡萄表面霉菌的ITS區(qū)序列分析

利用NCBI在線比對(duì)8種病原霉菌的PCR擴(kuò)增序列。對(duì)部分同源性較高的菌株，運(yùn)用MEGA-X構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，確定該菌株的系統(tǒng)發(fā)育位置，如圖2所示。8種霉菌序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，霉菌M1同源性較高的菌株ITS序列是毛霉屬菌種，霉菌M7、M8、M12同源性較高的序列是曲霉屬，霉菌M5同源性較高序列是鏈格孢屬菌種，霉菌M6同源性較高序列是籃狀菌屬菌種，霉菌M9同源性較高序列是莖點(diǎn)霉屬菌種，霉菌M18同源性較高序列是青霉屬。真菌形態(tài)學(xué)對(duì)比和序列比對(duì)分析表明，霉菌M1、M5、M6、M7、M8、M9、M12和M18分別為卷枝毛霉、鏈格孢菌、沃特曼籃狀菌、赭曲霉、黑曲霉、桑莖點(diǎn)霉、黃曲霉和青霉。

2.3 返接實(shí)驗(yàn)

為考察采后引起葡萄腐敗的優(yōu)勢(shì)腐敗菌，將從常溫貯藏腐爛的葡萄中分離出的8種霉菌人工返接于滅菌的葡萄中，以滅菌穿刺不接菌的葡萄為對(duì)照，觀察其霉變狀態(tài)和速度。由圖3可知，葡萄M的果粒飽滿，顏色鮮艷有光澤，品質(zhì)較好。M5、M8、M12對(duì)采后葡萄的品質(zhì)影響較大，表現(xiàn)為嚴(yán)重失水皺縮，無(wú)光澤，并且表皮基本被霉菌覆蓋，霉變較嚴(yán)重。從返接發(fā)病后的葡萄上進(jìn)行霉菌的分離純化，得到同種病原霉菌。由科赫法則[12]可知，鏈格孢菌、黑曲霉、黃曲霉3類霉菌為導(dǎo)致葡萄貨架期病害的主要病原菌，其中黑曲霉是導(dǎo)致葡萄嚴(yán)重霉變的

菌株。

M—新鮮的鮮食葡萄；M0—穿刺后不接菌的葡萄；其余為穿刺后接入相應(yīng)霉菌的葡萄。

2.4 溫度對(duì)霉菌生長(zhǎng)情況的影響

溫度是影響霉菌生長(zhǎng)速度的重要因素之一。觀察黑曲霉在20 ℃、22 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃及

30 ℃下的生長(zhǎng)情況，結(jié)果見(jiàn)圖4。黑曲霉最適生長(zhǎng)溫度為28 ℃，20 ℃時(shí)其菌落直徑最小。高溫雖然可以抑制霉菌的生長(zhǎng)，但也會(huì)加速果實(shí)中水分的蒸發(fā)，不利于果實(shí)的貯藏。低溫不僅可以抑制霉菌的生長(zhǎng)，還有利于抑制果實(shí)中各種酶的作用，減少果實(shí)自身?yè)p耗[13]。因此，低溫貯藏可適當(dāng)延長(zhǎng)果品的貯藏期，提高經(jīng)濟(jì)效益。

3 結(jié)論

對(duì)石河子市采后葡萄表皮霉菌進(jìn)行分離純化，聯(lián)合真菌形態(tài)鑒別以及PCR擴(kuò)增測(cè)序進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，分離出8種不同的霉菌，分別為卷枝毛霉、鏈格孢菌、沃特曼藍(lán)狀菌、赭曲霉、黑曲霉、桑莖點(diǎn)霉、黃曲霉和青霉。將純化的8種霉菌返接于葡萄果實(shí)，確定引起鮮食葡萄貯藏期腐敗變質(zhì)的優(yōu)勢(shì)致病霉菌為鏈格孢菌、黑曲霉、黃曲霉。本研究采用自然侵染實(shí)驗(yàn)和人工返接侵染實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證相結(jié)合的方式最終確定優(yōu)勢(shì)腐敗菌，可為后續(xù)鮮食葡萄貯藏中腐敗微生物的防治提供理論基礎(chǔ)，減少果品染病的發(fā)生率，進(jìn)而提高經(jīng)濟(jì)效益。

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