液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定牛肉湯中罌粟堿和那可丁含量的不確定度評定

作者簡介：周勇（1985—），男，云南紅河人，本科，工程師。研究方向：食品、化妝品及藥品檢驗。

摘 要：探討了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定牛肉湯中罌粟堿和那可丁含量的不確定度評價方法，根據(jù)測量不確定度的評定理論，分別對試驗中的儀器和操作步驟的各個不確定度分量進行計算。當k=2時，牛肉湯中罌粟堿的含量為9.74 μg·kg-1，擴展不確定度為3.88 μg·kg-1；那可丁的含量為8.89 μg·kg-1，擴展不確定度為

2.62 μg·kg-1，其中標準曲線擬合和樣品前處理階段對不確定度影響最大。

關(guān)鍵詞：牛肉湯；罌粟堿；那可丁；不確定度評定

Evaluation of Uncertainty in the Determination of Papaverine and Narcotine in Beef Soup by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

ZHOU Yong

（Honghe Inspection Institute for Food and Drug Control， Honghe 661199， China）

Abstract： Explored the uncertainty evaluation method for the determination of papaverine and narcotine content in beef soup using liquid chromatography tandem mass spectrometry. Based on the evaluation theory of measurement uncertainty， the uncertainty components of the instruments and operating steps in the experiment were calculated. When k=2， the papaverine content in beef soup was 9.74 μg·kg-1， with an expanded uncertainty of 3.88 μg·kg-1; the content of narcotine is 8.89 μg·kg-1， with an expanded uncertainty of 2.62 μg·kg-1， with the uncertainty of standard curve fitting and sample pre-treatment stage having the greatest impact.

Keywords： beef soup; papaverine; narcotine; uncertainty assessment

牛肉富含氨基酸、蛋白質(zhì)、微量元素和礦物質(zhì)，能提高機體免疫力、增強抗病能力，對兒童生長發(fā)育有一定的促進作用[1]。牛肉具有補脾胃、補養(yǎng)氣血、補肝腎及強筋壯骨的作用。在云南省，牛肉米線深受人們喜愛，但一些商家為了商業(yè)利益，會在牛肉湯料中加入罌粟殼，使人體產(chǎn)生強烈的依賴性和鮮美的味覺感受。罌粟殼含有罌粟堿和那可丁等多種生物堿類物質(zhì)，對人體健康具有毒害作用[2-3]。

本文依據(jù)《食品中嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁和蒂巴因的測定》（BJS 201802）[4]測定牛肉湯中的罌粟堿、那可丁的含量，分別對試驗中的儀器和操作步驟中的各個不確定度分量進行計算，通過合成得到牛肉湯中罌粟堿和那可丁含量的擴展不確定度，分析不確定度的最大影響分量，為評價檢測結(jié)果提供參考[5-6]。

1 材料與方法

1.1 儀器和標準品

AB QTRAP4500+Thermo U3000液質(zhì)聯(lián)用儀（正離子監(jiān)測模式：Urel=11%，k=2）；LA-612純水機（英國埃爾格）；SK5210HP超聲波清洗器（上?？茖С暎?；SH1850R高速冷凍離心機（湖南湘儀）；Vortex Genie 2渦旋振蕩器（美國Scientific Industries）；MS204TS/02電子天平（梅特勒-托利多）。

100 μg·mL-1甲醇中鹽酸罌粟堿（以罌粟堿計），不確定度3%（k=2），壇墨質(zhì)檢；100 μg·mL-1甲醇中鹽酸那可?。ㄒ阅强啥∮嫞?，不確定度3%（k=2），壇墨質(zhì)檢。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品前處理

準確稱取試樣2 g（精確至0.01 g）于離心管中，加入2 mL水，渦旋振蕩30 s，加入15 mL乙腈，渦旋振蕩1 min，超聲提取30 min，再加入6 g無水硫酸鎂和1.5 g無水醋酸鈉，立即渦旋振蕩2 min，使樣品吸附其中的水分，4 000 r·min-1離心5 min，取上清液過有機相濾膜（0.22 μm），準確量取濾液

1 mL至20 mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，進樣[4]。

1.2.2 標準溶液的配制

分別準確吸取0.1 mL 100 μg·mL-1甲醇中鹽酸罌粟堿（以罌粟堿計）和0.1 mL 100 μg·mL-1甲醇中鹽酸那可?。ㄒ阅强啥∮嫞┯谕?0 mL容量瓶中，乙腈定容，搖勻，得到1.0 μg·mL-1的罌粟堿和那可丁混合標準中間溶液。再準確吸取1.0 mL混合標準中間溶液于100 mL容量瓶中，乙腈定容，搖勻，得到

0.01 μg·mL-1的罌粟堿和那可丁混合標準使用溶液。分別準確吸取0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、1.0 mL、

2.0 mL和4.0 mL混合標準使用溶液于20 mL容量瓶中，乙腈定容，搖勻，得到質(zhì)量濃度分別為

0.05 ng·mL-1，0.10 ng·mL-1，0.20 ng·mL-1，0.50 ng·mL-1，1.00 ng·mL-1和2.00 ng·mL-1的罌粟堿、那可丁混合標準工作溶液[4]。

1.2.3 色譜與質(zhì)譜條件

（1）色譜條件。色譜柱：Waters BEH HILIC色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；進樣量：5 μL；柱溫：35 ℃；梯度程序見表1。

（2）質(zhì)譜條件。掃描方式：正離子掃描；檢測方

式：多反應監(jiān)測；氣簾氣：40 psi；噴霧氣：50 psi；輔助加熱氣：50 psi；離子化電壓：5 500 V；溫度

500 ℃，碰撞氣：Medium；其他參數(shù)見表2。

2 不確定度數(shù)學模型

以標準工作溶液的濃度為橫坐標，色譜峰面積為縱坐標，繪制標準工作曲線。采用外標法定量，樣品中的罌粟堿和那可丁含量的計算公式為

（1）

式中：X為牛肉湯中各罌粟堿或那可丁的含量，μg·kg-1；C為由標準曲線得出試樣溶液中各待測物的濃度，ng·mL-1；V為試樣提取液的體積，此處為15 mL；

m為樣品的質(zhì)量，g；f為稀釋倍數(shù)，此處為20。

3 不確定度來源分析

根據(jù)標準方法和數(shù)學模型，影響罌粟堿和那可丁含量的不確定度分量主要由樣品前處理引入、標準物質(zhì)引入、標準曲線擬合引入、回收率引入及樣品測量重復性引入。罌粟堿和那可丁含量的不確定度來源魚骨圖見圖1。

4 不確定度分類的計算

4.1 樣品前處理過程引入的測量不確定度

4.1.1 稱量引入的相對標準不確定度

（1）天平示值誤差引入的相對標準不確定度。檢定證書中允許誤差限為0.1 g。樣品稱量2次，作為平行樣，按照均勻分布計算（k=），引入的標準不確定度。天平示值2.00 g的樣品，示值誤差引入的相對標準不確定度為

（2）天平的偏載誤差引入的相對標準不確定度。檢定證書中偏載允許誤差限為0.2 g，稱量2次，標準不確定度，天平示值

2.00 g的樣品，分析天平的偏載誤差引入的相對標準不確定度為

因此，分析天平稱量引入的相對標準不確定度為

4.1.2 樣品前處理過程移液管和容量瓶引入的測量不確定度

按照《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）[7]的規(guī)定，假設(shè)為均勻分布，則樣品前處理過程中移液管和容量瓶引入的不確定度見表3。合成相對標準不確定度為

4.1.3 樣品前處理過程引入的相對標準不確定度

將各分量進行合成，樣品前處理過程引入的測量不確定度為

4.2 標準物質(zhì)引入的不確定度

4.2.1 標準物質(zhì)純度引入的相對標準不確定度

根據(jù)標準物質(zhì)證書得到甲醇中鹽酸罌粟堿（以罌粟堿計），濃度為100 μg·mL-1，不確定度3%（k=2），則罌粟堿標準使用溶液引入的相對標準不確定度為；甲醇中鹽酸那可?。ㄒ阅强啥∮嫞?，濃度為100 μg·mL-1，不確定度3%（k=2），則那可丁標準使用溶液引入的相對標準不確定度為

4.2.2 標準溶液配制引入的相對標準不確定度

按照《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）[7]的規(guī)定，假設(shè)均勻分布，標準溶液稀釋過程中玻璃量器引入的不確定度見表4。合成相對標準不確定度為

4.2.3 標準工作曲線配制引入的相對標準不確定度

按照《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）[7]的規(guī)定，假設(shè)均勻分布，標準工作曲線配制過程中玻璃量器引入的不確定度見表5。合成相對標準不確定度為

4.2.4 標準物質(zhì)引入的相對標準不確定度的合成

將上述各分量進行合成，則標準物質(zhì)罌粟堿和那可丁引入的相對標準不確定度均為

urel（s）=

4.3 標準曲線擬合引入的不確定度

將罌粟堿、那可丁標準曲線擬合方程，分別計算標準曲線的殘余殘差標準差和樣品含量標準偏差。

標準曲線殘余殘差公式為

（2）

式中：n為標準點數(shù)量；a為線性方程的斜率；b為線性方程的截距；xi為校準曲線各濃度點的濃度，ng·mL-1；yi為校準曲線各濃度點相應組分的峰面積，則樣品含量標準偏差公式為

（3）

式中：n為濃度點數(shù)（自由度取n-2）；p為被測物測量平行次數(shù)；為標準曲線濃度平均值，ng·mL-1；為被測物測量平均值，ng·mL-1。

標準曲線擬合引入的相對標準不確定度為

（4）

試驗中樣品測量的平行次數(shù)為2次，罌粟堿的信號強度為10 515、10 637；那可丁的信號強度為

5 402、5 476。帶入公式（3）和公式（4）后，罌粟堿和那可丁的標準曲線的殘余殘差和樣品含量標準偏差及相對標準不確定度見表6。標準曲線擬合引入的相對標準不確定度分別為

urel（C1）=0.167；urel（C2）=0.098 4

4.4 回收率引入的不確定度

在空白樣品中加標后得到罌粟堿和那可丁加標水平為18 μg·kg-1的加標樣品，進樣6次得到回收率測定結(jié)果為罌粟堿86%、84%、85%、82%、81%、80%，平均回收率為R=83%，標準偏差為S=2.37%；那可丁82%、80%、87%、82%、78%、79%，平均回收率為R=81%，標準偏差為S=3.20%

罌粟堿回收率引入的相對標準不確定度為

那可丁回收率引入的相對標準不確定度為

4.5 樣品測量重復性引入的相對標準不確定度

試驗中，對樣品重復測定3次，代入公式（5）計算。

（5）

式中：S為樣品含量的標準偏差，μg·kg-1；為樣品中各待測物的含量，μg·kg-1。

樣品中罌粟堿的3次測定結(jié)果為9.69 μg·kg-1、9.80 μg·kg-1、9.74 μg·kg-1，則平均含量為9.74 μg·kg-1，標準偏差為0.055 1 μg·kg-1，則樣品中罌粟堿的相對標準不確定度為urel（r1）=0.003 27。

樣品中那可丁的3次測定結(jié)果為8.82 μg·kg-1，

8.94 μg·kg-1，8.90 μg·kg-1，則平均含量為

8.89 μg·kg-1，標準偏差為0.061 1 μg·kg-1，則樣品中那可丁的相對標準不確定度為urel（r2）=0.003 97。

5 合成不確定度和擴展不確定度

5.1 合成不確定度

把上述各分量代入計算合成不確定度，罌粟堿結(jié)果的合成相對標準不確定度為

那可丁測量結(jié)果的合成相對標準不確定度為

合成不確定度為罌粟堿：u=9.74×0.199=

1.94 μg·kg-1；那可?。簎=8.89×0.147=1.31 μg·kg-1。

5.2 擴展不確定度

取包含因子k=2，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定牛肉湯中罌粟堿的含量為9.74 μg·kg-1，擴展不確定度為U=2×1.94=3.88 μg·kg-1；那可丁的含量為8.89 μg·kg-1，擴展不確定度為U=2×1.31=2.62 μg·kg-1。因此，牛肉湯中罌粟堿的測定結(jié)果為（9.74±3.88） μg·kg-1，那可丁的測定結(jié)果為（8.89±2.62） μg·kg-1，k=2。

6 結(jié)論

本實驗對液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定牛肉湯中罌粟堿和那可丁含量的測量不確定度來源進行分析和評定，發(fā)現(xiàn)標準曲線擬合和樣品前處理階段引入的不確定度影響最大，其他不確定度分量引入的相對不確定度影響較小。標準曲線擬合產(chǎn)生的不確定度分量影響較大，可能是一元線性擬合的局限性導致的，分析時可嘗試二次擬合計算待測組分的濃度，同時可調(diào)整標準曲線的濃度范圍，使其更適合待測組分的濃度檢測?？蛇x擇經(jīng)檢定確認后，性能指標更優(yōu)秀的天平來進行樣品的測量。測量不確定度可給出結(jié)果的可信度和置信區(qū)間。可通過測量不確定度的計算來衡量檢驗結(jié)果，特別是檢驗結(jié)果處于檢出限或者定量限等臨界值時，具有重要的意義。更加全面和細化地考慮不確定度的來源，可提高測量結(jié)果的準確度。

參考文獻

[1]忻城縣中投牧業(yè)有限公司.一種肉牛飼料及其制備方法：CN202211344869.9[P].2023-01-20.

[2]黃寧，唐麗君，黃恩堂，等.液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定罌粟殼中5種生物堿的含量[J].藥品評價，2019，16（15）：10-13.

[3]劉敏敏，張朝正，李延志，等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測火鍋底料中罌粟殼[J].食品研究與開發(fā)，2013，34（1）：91-94.

[4]國家市場監(jiān)督總局.食品中嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁和蒂巴因的測定：BJS 201802[S].北京：中國標準出版社，2018.

[5]張信仁，劉正才，陳澤宇，等.辣椒油中罌粟堿測定不確定度評定[J].福建分析測試，2022，31（5）：54-58.

[6]中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會.化學分析方法驗證確認和內(nèi)部質(zhì)量控制實施指南 色譜分析：GB/T 35655—2017[S].北京：中國標準出版社，2017.

[7]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.常用玻璃量器檢定規(guī)程：JJG 196—2006[S].北京：中國計量出版社，2006．