拮抗獼猴桃腐敗菌酵母的分離與鑒定

劉昂 張妤婕 董柏余 姚秋萍 馮瑤 朱德全

基金項(xiàng)目：貴州省教育廳特色領(lǐng)域項(xiàng)目（黔教合KY字（2021）062）。

作者簡介：劉昂（2000—），女，山東菏澤人，碩士在讀。研究方向：微生物藥學(xué)。

通信作者：朱德全（1980—），男，貴州遵義人，博士，副教授。研究方向：微生物與發(fā)酵工程。E-mail：zdqoliver

@163.com。

摘 要：獼猴桃具有豐富的維生素和生物活性物質(zhì)，具有較高的食用和藥用價(jià)值。然而，由于其皮薄多汁，獼猴桃采摘后容易腐敗。研究表明，導(dǎo)致獼猴桃腐敗的主要病原菌是葡萄坐腔菌（Botryosphaeria dothidea）和間座殼菌（Diaporthe phaseolorum），其次是灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）。酵母菌是較好的果蔬采后生防菌，對(duì)引起果蔬采后病害的病原菌具有很好的拮抗作用。本研究從傳統(tǒng)發(fā)酵食品和水果表面分離純化酵母菌株，并以灰葡萄孢菌和葡萄坐腔菌為指示菌，采用平板對(duì)峙法篩選出對(duì)這兩種菌具有抑菌活性的酵母菌菌株。一共分離純化了19株酵母菌，篩選出5株對(duì)灰葡萄孢菌和葡萄坐腔菌具有良好抑菌活性的酵母，分別為YMF-a、PJ1、SC、MG、JJ。其中，酵母菌YMF-a表現(xiàn)出最顯著的拮抗效果，對(duì)葡萄坐腔菌和灰葡萄孢菌的抑制率均超過60%。通過菌體和菌落形態(tài)及26S rDNA序列分析鑒定，鑒定YMF-a、PJ1、SC、MG、JJ為文萊畢赤酵母（Pichia bruneiensis）、季也蒙邁耶氏酵母（Meyerozyma guilliermondii）、熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）、文萊畢赤酵母（Pichia bruneiensis）和膜醭畢赤酵母（Pichia membranifaciens）。本研究篩選和分離的拮抗酵母為開發(fā)獼猴桃的生物保鮮劑奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：獼猴桃；篩選鑒定；拮抗酵母；生物防治

Screening and Identification of Antagonistic Yeast of Kiwi Spoilage

LIU Ang1，2， ZHANG Yujie1，2， DONG Boyu1，2， YAO Qiuping1，2， FENG Yao1，2， ZHU Dequan1，2*

（1.School of Ethnic-Minority Medicine， Guizhou Minzu University， Guiyang 550025， China;

2.Key Laboratory of Guizhou Ethnic Medicine Resource Development and Utilization， Guizhou Minzu University， State Ethnic Affairs Commission， Guiyang 550025， China）

Abstract： Kiwifruit is known for its abundant vitamins and bioactive substances， and has high edible and medicinal value. However， due to its thin and juicy skin， it is prone to decay after harvesting. Studies have shown that the main pathogens causing kiwifruit decay are Botryosphaeria dothidea and Diaporthe phaseolorum， followed by Botrytis cinerea. Yeast is an excellent post-harvest biocontrol agent for fruits and vegetables， with good antagonistic effects on pathogenic microorganisms that cause post-harvest diseases. In this study， yeast strains were isolated and purified from traditional fermented foods and fruit surfaces， and using Botrytis cinerea and Botryosphaeria dothidea as indicator bacteria， and yeast strains with antibacterial activity against Botrytis cinerea and Botryosphaeria dothidea were screened using a plate confrontation method. A total of 19 yeast strains were isolated and purified， and 5 yeast strains with good inhibitory activity against Botrytis cinerea and Botryosphaeria dothidea were selected， namely YMF-a， PJ1， SC， MG， and JJ. Among them， the yeast strain YMF-a showed the most significant antagonistic effect， with inhibition rates against both Botrytis cinerea and Botryosphaeria dothidea exceeding 60%. Through morphological and 26S rDNA sequence analysis， YMF-a， PJ1， SC， MG， and JJ were identified as Pichia bruneiensis， Meyerozyma guilliermondii， Candida tropicalis， Pichia bruneiensis， and Pichia membranifaciens， respectively. The screening and isolation of antagonistic yeast in this study lay the foundation for the development of biological preservation agents for kiwifruit.

Keywords： Kiwi; screening and identification; antagonizes yeast; biocontrol

獼猴桃又稱奇異果、狐貍桃等，屬于雙子葉植物的獼猴桃科（Actinidiaceae）獼猴桃屬（Actinidia）[1]。獼猴桃屬為呼吸躍變型果實(shí)，采后容易腐爛軟化。在果實(shí)生長后期至儲(chǔ)運(yùn)期，常發(fā)生獼猴桃軟腐病，是影響采后貯藏品質(zhì)的主要真菌性病害之一，也是導(dǎo)致采后貯運(yùn)損失的重要因素之一[2]。研究表明，引起獼猴桃腐爛的致腐微生物主要為真菌。李誠等[3]從江西省奉新縣獼猴桃中分離鑒定出葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）、擬莖點(diǎn)霉菌（Phomopsis sp.）為主要病原菌。雷霽卿等[4]和潘慧等[5]通過調(diào)查研究紅陽獼猴桃病果，發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致軟腐病的病原菌主要有葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）、擬莖點(diǎn)霉菌（Phomopsis sp.）、間座殼菌（Diaporthe sp.）和鏈格孢菌（Alternaria alternata）等。石浩[6]在軟棗獼猴桃中分離鑒定出子囊菌門中主要的優(yōu)勢(shì)病原菌為葡萄座腔菌屬（Botryosphaeia dothidea）和間座殼菌屬（Diaporthe phaseolorum）。楊帥[7]認(rèn)為獼猴桃中主要的優(yōu)勢(shì)病原菌為灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea），該菌嚴(yán)重威脅果蔬產(chǎn)量和品質(zhì)安全。

酵母是指一類可以發(fā)酵糖類物質(zhì)的真核微生物，廣泛存在于果實(shí)表面、葉片、根部、土壤和海水等環(huán)境中。拮抗酵母可通過體外和體內(nèi)方法進(jìn)行拮抗菌的篩選與分離[8-9]。大量研究表明，酵母具有很高的拮抗?jié)摿?。DA等[10]利用體內(nèi)和體外篩選方法，從土壤、樹葉、花朵和柑橘類水果中分離出對(duì)意大利青霉菌具有很高預(yù)防和治療應(yīng)用潛力的酵母。IGNATOVA等[11]從豆科植物下收集的深色栗子土壤中篩選出了10種可以抑制植物病原真菌生長發(fā)育的酵母菌株。朱寒冰等[12]從191株酵母中篩選出17種對(duì)腐敗菌具有拮抗作用的酵母菌。范先敏[13]通過篩選發(fā)現(xiàn)了

5株對(duì)獼猴桃軟腐病菌生長具有抑制作用的生防菌株。郭虹娜[14]研究發(fā)現(xiàn)拮抗酵母揮發(fā)物可以抑制灰葡萄孢菌的菌絲生長。

本研究旨在通過體外拮抗實(shí)驗(yàn)篩選出具有拮抗獼猴桃腐敗菌潛力的酵母菌株，并結(jié)合菌株形態(tài)特征觀察和分子生物學(xué)方法進(jìn)行鑒定。希望為獼猴桃的生物保鮮提供支持，并為開發(fā)獼猴桃貯藏保鮮的酵母生防制劑提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

（1）供試病原菌：灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）和葡萄坐腔菌（Botryosphaeria dothidea），購于菌種保藏中心。

（2）酵母菌：從醪糟、酸菜、炸肉、泡椒、糟辣椒、玉米面粉發(fā)酵面團(tuán)等各種發(fā)酵食品和水果店采購的蘋果、草莓、金桔、雪梨、芒果、紫提子等水果以及番茄、南瓜等表面分離酵母菌。

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Potato Dextrose Agar，PDA）、馬鈴薯葡萄糖肉湯（Potato Dextrose Broth，PDB）、麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基，上海博微生物科技有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

電熱恒溫培養(yǎng)箱（DH6000BII），天津市泰斯特儀器有限公司；潔凈工作臺(tái)（SW－CJ－2FD），蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；生物顯微鏡（Motic BA200），重慶奧普光電技術(shù)有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋（LDZX－50KE），上海申安醫(yī)療器械廠；高速冷凍離心機(jī)（X1R），賽默飛世爾科技（中國）有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DH－101－2AB），天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酵母菌分離

將醪糟、酸菜、炸肉、兩種泡椒、糟辣椒、玉米面粉發(fā)酵面團(tuán)和自然發(fā)酵的雪梨、紫提子、芒果、蘋果、番茄、南瓜、金桔、草莓、青提表皮分別取一點(diǎn)放入小燒杯中，經(jīng)無菌水浸泡后在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上涂布，28 ℃條件下培養(yǎng)2～3 d。隨后，分離純化以獲得酵母菌，并編號(hào)為LZ-A、LZ-B、SC、ZR、PJ1、PJ2、ZLJ、YMF-a、YMF-b、XL、TZ、MG、PG、FQ、NG、JJ、CM。

1.2.2 酵母菌保藏

將純化好的酵母菌接種于PDB培養(yǎng)基中培養(yǎng)3～5 d，并且傳2～3代，傳好代后的菌液振蕩、離心，菌體附著在離心管底部，倒掉上清液，加入含30%甘油的麥芽汁培養(yǎng)基，將菌液振蕩均勻放置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.3 腐敗菌活化

將病原菌菌塊接種到新的PDA培養(yǎng)基上，使菌絲面與培養(yǎng)基緊密接觸，放入預(yù)設(shè)溫度為28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5～7 d，備用。

1.3 病原菌形態(tài)特征觀察

將分離純化后的病原菌菌株轉(zhuǎn)移至PDA平板，菌株1呈淡淡的淡褐色，菌絲密集，生長蔓延至培養(yǎng)基邊緣；菌絲有隔膜，呈分枝狀，附著有孢子，符合灰葡萄孢菌性狀，見圖1。菌株2的菌絲生長稠密，且菌絲生長初期為白色棉絮狀，后期為淺灰色或灰黑色的菌絲，并且向平板邊緣蔓延生長；菌絲有隔膜，產(chǎn)生分支，培養(yǎng)10 d后產(chǎn)生孢子，符合葡萄坐腔菌性狀，見圖2。

1.4 拮抗酵母菌的篩選與鑒定

1.4.1 拮抗酵母菌的初篩

利用平板對(duì)峙法，將培養(yǎng)5～7 d的灰葡萄孢菌和葡萄坐腔菌分別置于PDA培養(yǎng)基上，在PDA平板的中央接種直徑為6 mm的病原菌菌餅，并距離該菌餅2 cm處接種同等直徑的酵母菌菌塊，在平板底部劃線將培養(yǎng)基均勻劃分成4塊，按照上述操作方法將4種不同來源的酵母接種于培養(yǎng)基上，菌面朝下讓酵母菌與培養(yǎng)基緊密接觸。操作完成后用封口膜密封平板，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5 d。再對(duì)腐敗菌有抑制效果的酵母菌進(jìn)行進(jìn)一步篩選。

1.4.2 拮抗酵母菌的復(fù)篩

利用平板對(duì)峙法，將培養(yǎng)5～7 d的灰葡萄孢菌和葡萄坐腔菌菌絲生長邊緣打孔制得直徑6 mm的菌塊，將這些菌塊在距離PDA培養(yǎng)基中心2 cm處，菌絲面朝下接種于PDA培養(yǎng)基上。將初步篩選出的酵母菌接種于含有PDA的液體培養(yǎng)基中，28 ℃條件下培養(yǎng)3～5 d。用移液槍吸取100 μL菌懸液，并將其浸泡在無菌、直徑為6 mm的濾紙片上，然后將濾紙片接種在距離培養(yǎng)基中心2 cm處，同時(shí)使用浸泡無菌水的濾紙片作為對(duì)照。接種完畢后用封口膜將平板密封，放入28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7～10 d。計(jì)算酵母對(duì)灰葡萄孢菌和葡萄坐腔菌的抑制率，計(jì)算公式：相對(duì)抑制率=（空白對(duì)照組直徑-實(shí)驗(yàn)組直徑）/空白對(duì)照組直徑×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗酵母菌的初篩

通過拮抗酵母的初篩實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示分離純化的各種酵母菌均對(duì)灰葡萄孢菌和葡萄坐腔菌有抑制作用（圖3）。

2.2 拮抗酵母菌的復(fù)篩

對(duì)初篩出的酵母菌進(jìn)行單板對(duì)峙復(fù)篩，測(cè)量并觀察兩種獼猴桃腐敗菌的生長直徑，并計(jì)算拮抗酵母對(duì)每種腐敗菌的相對(duì)抑制百分比，以評(píng)估19種酵母對(duì)這兩種菌的拮抗活性。結(jié)果如表1所示，有18種酵母對(duì)灰葡萄孢菌的相對(duì)抑制程度大于或等于20%，有16種酵母對(duì)葡萄坐腔菌的相對(duì)抑制程度大于或等于20%。

2.3 酵母菌的鑒定

2.3.1 酵母菌菌落和細(xì)胞形態(tài)觀察

通過初篩實(shí)驗(yàn)，得出以下13株有明顯抑制效果的菌株，所以對(duì)這13種菌株的菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。將13株真菌進(jìn)行分類，共分為5類，分別為A類（PJ1、PJ2、CM、MG、JJ、XL）、B類（TZ、SC、YMF-a、FQ）、C類（NG）、D類（ZLJ）、E類（PG）。以上5類酵母菌的形態(tài)學(xué)特征如表2所示，顯微鏡觀察見圖4。

2.3.2 拮抗酵母菌的分子生物學(xué)鑒定與分析

通過平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)，19種酵母中，YMF-a、PJ1、SC、MG、JJ這5株酵母對(duì)灰葡萄孢菌和葡萄坐腔菌都有較好的抑制效果（相對(duì)抑制程度均≥40%）。根據(jù)DNA試劑盒說明書[15]提取5株酵母總DNA，對(duì)其26S rRNA區(qū)測(cè)序，將5株酵母基因序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源序列比對(duì)，選取相似度大于99%的同源序列進(jìn)行分析，鑒定結(jié)果見表3。

綜上所述，YMF-a菌株鑒定為文萊畢赤酵母（Pichia bruneiensis），PJ1菌株為季也蒙邁耶氏酵母（Meyerozyma guilliermondii），SC菌株為文萊畢赤酵母（Pichia bruneiensis），MG菌株為熱帶假絲酵母（Candida tropicalis），JJ菌株為膜醭畢赤酵母（Pichia membranifaciens）。

3 結(jié)論與討論

軟腐病也稱為熟腐病，是一種常見的潛伏性病，發(fā)生在獼猴桃采摘后儲(chǔ)藏期間，其腐爛率可在50%以上，極大地影響了獼猴桃的品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[16]。該病主要由葡萄坐腔菌（Botryosphaeria dothidea）、間座殼菌（Diaporthe phaseolorum）和灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）等病原菌引起。盡管拮抗酵母菌在蘋果[17]、芒果[18]、番茄[19]、草莓[12]等果樹病害的生物防治中有所應(yīng)用，并取得了不同程度的抑菌效果，但對(duì)于獼猴桃軟腐病的防治報(bào)道卻相對(duì)較少。因此，本研究通過體外對(duì)峙實(shí)驗(yàn)，篩選出了19株酵母，并發(fā)現(xiàn)其中5株酵母（YMF-a、PJ1、SC、MG、JJ）對(duì)灰葡萄孢菌和葡萄坐腔菌都有較好的抑制效果，其中YMF-a酵母的拮抗效果最好，對(duì)于灰葡萄孢菌和葡萄坐腔菌的相對(duì)抑制率均超過60%。經(jīng)過菌落和菌體形態(tài)結(jié)合26srDNA序列分析鑒定，YMF-a和SC鑒定為文萊畢赤酵母（Pichia bruneiensis）、PJ1為季也蒙邁耶氏酵母（Meyerozyma guilliermondii）、MG為熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）、JJ為膜醭畢赤酵母（Pichia membranifaciens）。此結(jié)論與陳瑩瑩等[20]探究膜醭畢赤酵母（Pichia membranifaciens）對(duì)采后灰葡萄孢菌有抑菌效果的結(jié)果相一致，與羅玲等[21]從獼猴桃汁發(fā)酵液中分離篩選出一株酵母菌株AY1-1為庫德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）結(jié)果不同。

近年來，天然溫和的生物防控方法已成為控制食品中有害微生物污染的主要方式。拮抗酵母具有遺傳穩(wěn)定性高、適應(yīng)性強(qiáng)、抗菌譜廣、生產(chǎn)成本低等特點(diǎn)，在果蔬的采后保鮮方面已被廣泛應(yīng)用[22]。本文旨在探究酵母菌對(duì)獼猴桃腐敗菌的拮抗作用，為以酵母菌為基礎(chǔ)的新型抗菌劑的開發(fā)提供參考[23]，并期望能夠更好地提高食品質(zhì)量，保障食品安全，在生物防治領(lǐng)域具有巨大的發(fā)展前景。

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