基于宏基因組測序技術的非靶向篩查方法檢測肉類食品中的動物源性成分

丁清龍 楊丹婷 謝愛華 韋云 陳秀芬 周露

基金項目：國家市場監(jiān)督管理總局科技計劃項目（2019MK057）；廣東省市場監(jiān)督管理局科技計劃項目（2021ZS03）。

作者簡介：丁清龍（1990—），男，河北滄州人，碩士，工程師。研究方向：食品安全檢測。

通信作者：周露（1982—），女，河南洛陽人，博士，正高級工程師。研究方向：食品安全檢測。E-mail：zhoulu1982@sohu.com。

摘 要：目的：建立肉類食品中動物源性成分非靶向篩查方法。方法：基于宏基因組測序技術建立肉類食品中動物源性成分非靶向篩查方法，將該方法用于模擬樣品和實際樣品檢測，并用現有標準檢測方法對實際樣品檢測結果進行確認。結果：模擬樣品檢測結果與模擬情況一致；在實際樣品中檢出與樣品名稱不一致或樣品標簽未標識的動物源性成分，且非靶向篩查方法檢測結果與現有標準方法檢測結果一致。結論：該方法可以快速鎖定樣品中未知的動物源性成分，檢測結果準確可靠，可為政府打擊肉類食品摻假提供更為有力的技術支撐。

關鍵詞：宏基因組測序；動物源性成分；非靶向；摻假

Determination of Animal-Derived Ingredients in Meat Products by Non-Targeted Screening Method Based on Metagenomic Sequencing Technology

DING Qinglong， YANG Danting， XIE Aihua， WEI Yun， CHEN Xiufen， ZHOU Lu*

（Guangdong Institute of Food Inspection， Guangzhou 510435， China）

Abstract： Objective： To establish the non-targeted screening method for animal-derived ingredients in meat products. Method： The non-targeted screening method for animal-derived ingredients in meat products was established based on metagenomic sequencing technology. The method was applied to the determination of simulated samples and actual samples， and the results of actual samples were confirmed by existing standard determination methods. Result： The determination results of simulated samples were consistent with design of simulated samples. The animal-derived ingredients inconsistent with sample name or label identification were detected in actual samples， and the results of non-targeted screening method and existing standard methods were consistent. Conclusion： This method could quickly test the unknown animal-derived ingredients of samples， and the determination results were accurate and reliable. It could provide more powerful technical support to combat meat adulteration for the government.

Keywords： metagenomic sequencing technology; animal-derived ingredients; non-targeted; adulteration

肉類食品是人們餐桌必備的主要食品之一，常見的高經濟價值的肉類食品有牛肉、羊肉及其制品等。但受經濟利益驅動，肉類食品中摻雜使假、以次充好事件頻繁發(fā)生。例如，歐洲市場的“馬肉風波”，以鴨肉代替牛羊肉的“假羊肉串”“假牛肉干”“假肥牛片”等[1]。這種摻假行為不僅侵害了消費者的權益，擾亂市場，更降低了消費者對相關部門肉類食品監(jiān)管的信任度。

我國現行有效的肉類食品動物源性成分檢測標準僅能進行單一成分的定向檢測。但隨著監(jiān)管力度的加大，肉類食品摻假物種的種類向多元化方向發(fā)展，樣品摻假的物種及物種數目存在很大的不確定性。單一成分的定性檢測極易造成漏檢導致假陰性，給肉類食品市場監(jiān)管帶來巨大挑戰(zhàn)。因此，急需建立肉類食品中動物源性成分非靶向篩查方法。

目前，可能實現動物源性成分非靶向篩查的技術分為兩類：一類是基于質譜、光譜等產生的“指紋”圖譜進行鑒別[2-3]；一類是基于分子生物學的方法?！爸讣y”圖譜方法對基質要求高，僅適用于未加工的肉類，同時該方法需要復雜的數學計算。在分子生物學方法中，多重PCR法和微流控芯片法可以實現對樣品多個靶標的同時檢測，但若樣品中含有實驗用引物探針檢測靶標之外的成分，仍會存在漏檢的情況[4-7]。將DNA條形碼技術與Sanger測序技術相結合，挑取多個細菌克隆的方式具有很強的隨機性，該方法漏檢的可能性仍然很大[8]。而基于二代測序的宏基因組技術在鑒定土壤、糞便等含有混合微生物的樣品中菌種方面已得到廣泛應用，該技術可以實現對擴增產物中多種擴增條帶的同時檢測，為基于宏基因組測序技術建立肉類食品中動物源性成分非靶向篩查方法奠定基礎[9]。

本研究基于宏基因組測序技術建立肉類食品中動物源性成分非靶向篩查方法，并將該方法用于模擬樣品和實際樣品檢測，以期為相關部門打擊肉類食品摻假提供可靠的技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 實驗樣品

實驗中用到的豬、水牛、黃牛、山羊、綿羊、雞、鴨、鵝、馬和驢等肉樣于農貿市場購買；牦牛、鼠、雀、鴕鳥、貂、駱駝、乳鴿、貓、雉雞、鴿子和貉肉源從中國檢驗檢疫科學研究院獲得；香辣味牛肉粒、豬血豆腐、牛排等樣品于超市購買；餐館牛肉和羊肉串在餐飲店獲得。

1.1.2 儀器與試劑

T100 PCR儀（美國Bio-Rad公司），Biospec-nano核酸蛋白測定儀（日本島津公司），1300系列A2級別生物安全柜（美國Thermofisher公司），Sorvall? ST 8離心機（美國Thermofisher公司），Sub-cell GT核酸電泳儀（美國Bio-Rad公司），PowerPac Basic電泳儀電泳（美國Bio-Rad公司），GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），QuantStudio 6 Flex熒光定量PCR儀（美國Thermofisher公司），Qubit 4.0熒光計（美國Thermofisher公司），MiSeq高通量測序儀（美國illumina公司）。

DNA提取試劑，DNeasy mericon Food Kit（QIAGEN，貨號69514）；DNA濃度檢測試劑盒，QubitTM 1×dsDNA HS Assay Kit（Invitrogen，貨號Q33231）；PCR擴增試劑，PrimeSTAR? HS DNA Polymerase（Takara，貨號R010A）；基因文庫構建試劑，NexteraR XT Index Kit 24 Indexes-96 samples（illumina，貨號15055293）；高通量測序試劑，PhiX Control Kit v3（illumina，貨號FC-110-3001）和MiSeq Reagent Micro Kit v2（300-cycles）（illumina，貨號FC-103-1002）；熒光PCR試劑，Takara Premix Ex Taq （Probe qPCR）（Takara，貨號RR390A）。

用于宏基因組測序的擴增子上游引物COI-F序列（5-3）為TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCTCAACYAATCAYAAAGATATYGGCAC，下游引物COF-R序列（5-3）為GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGGYATNACTATRAAGAAAATTATTAC。該對引物由Illumina宏基因組測序引物和推薦性國家標準《動物制品中動物源性檢測基因條碼技術 Sanger測序法》（GB/T 35918—2018）中的微型基因條碼引物合并而成。相關引物、探針合成及Sanger測序服務均委托生工生物（上海）股份有限公司完成。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物源性成分非靶向篩查方法的技術路線

動物線粒體DNA上編碼細胞色素酶亞基I（COI）基因序列相對保守，不同種動物的COI基因序列存在差異。本方法使用的擴增子引物為通用引物，可以擴增出不同種動物的COI基因序列，技術路線如圖1所示。使用該擴增子引物對樣品中的所有動物源性成分進行擴增，利用宏基因組測序技術對擴增產物中不同種動物的COI基因序列進行分析檢測，再將獲得的序列在基因數據庫（美國國家生物信息中心）中比對，從而實現樣品中動物源性成分的非靶向檢測。

1.2.2 樣品DNA提取

按照商業(yè)化DNA提取試劑盒說明書的要求提取DNA。提取過程中設置提取對照，以滅菌去離子水代替樣品進行DNA提取。

1.2.3 DNA濃度測定

取3.5 μL已提取的DNA樣品，采用核酸蛋白分析儀測定DNA濃度。

1.2.4 PCR擴增及擴增產物電泳檢測

采用25 μL PCR反應體系，其中10×PCR反應Buffer 2.5 μL、dNTP 2 μL、上下游引物各1 μL（引物濃度為10 μmol·L-1）及DNA模板25～100 ng，補充無菌雙蒸水至總體積為25 μL。

PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，51 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)；

72 ℃，10 min。

將5 μL擴增產物與適量上樣緩沖液混合，用2%的瓊脂糖膠進行電泳檢測。

1.2.5 基因文庫構建

采用COI-F和COI-R為引物，以樣品DNA為模板，進行第1輪PCR。25 μL反應體系：模板

5 μL，5×Buffer 5 μL，dNTP 2 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，DNA聚合酶（高保真）0.2 μL，超純水10.8 μL。反應程序：95 ℃，3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；72 ℃，5 min；4 ℃保存。采用磁珠法對第1輪擴增產物進行純化，以滅菌超純水重懸純化后的DNA。

再以純化后的DNA為模板，以Nextera○R XT Index Kit 24 Indexes-96 samples中的Index primer為引物，進行第2輪PCR（接頭Index PCR）。25 μL反應體系：模板2 μL，5×Buffer 5 μL，dNTP 2 μL，Index 1引物2.5 μL，Index 2引物2.5 μL，DNA聚合酶（高保真）0.2 μL，超純水12.8 μL。反應程序：95 ℃，3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，7個循環(huán)；72 ℃，5 min；4 ℃保存。采用磁珠法對第2輪擴增產物進行純化，以滅菌超純水重懸純化后的DNA，即為構建好的基因文庫。

1.2.6 宏基因組測序

采用Qubit 4.0熒光計對構建好的樣本基因文庫進行定量，并將其稀釋至4 nmol·L-1。從每個稀釋好的文庫中取出5 μL DNA，混勻成為最終上機文庫。取5 μL混合好的文庫和5 μL 0.2 mol·L-1的NaOH，二者混合進行文庫變性后，再向其中加入990 μL預冷的HT1溶液，得到20 pmol·L-1的變性文庫。取

20 pmol·L-1變性文庫210 μL，加入390 μL預冷的HT1溶液，得到終濃度為7 pmol·L-1的樣本變性文庫。制備終濃度為7 pmol·L-1的測序標準品PhiX的過程與上述操作一致。

將樣本變性文庫中摻入30%的PhiX，即420 μL終濃度為7 pmol·L-1的樣本變性文庫與180 μL終濃度為7 pmol·L-1的PhiX標準品變性文庫混合，得到最終上機樣本。將上機樣本加入測序試劑盒的樣本孔中，采用illumina Miseq測序儀上機測序。

1.2.7 測序數據分析

將下機數據中的FASTQ文件導入軟件中，使用CLC Genomics Workbench 21.0.5軟件Toolbox中的Trim工具包對數據進行剪切。然后使用Toolbox中的OTU clustering工具包，對剪切后的數據進行拼接和OTU聚類，最后將OTU聚類得到的序列在美國國家生物信息中心數據庫（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast）中進行比對。將比對結果為Cytochrome oxidase I基因且序列相似度≥95%的序列作為結果序列。

1.2.8 測序結果確認

采用現有動物源性成分檢測標準方法對測序結果進行確認，其中牛源性成分和羊源性成分檢測采用《常見畜禽動物源性成分檢測方法 實時熒光PCR法》（GB/T 38164—2019）；豬源性成分檢測采用《食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法 第8部分：豬成分檢測 實時熒光PCR法》（SN/T 3730.8—2013）；馬源性成分檢測采用《食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法 第5部分：馬成分檢測 實時熒光PCR法》（SN/T 3730.5—2013），雞源性成分檢測采用《動物源性產品中雞源性成分PCR檢測方法》（SN/T 2978—2011）。

2 結果與分析

2.1 擴增子引物通用性評價

提取豬、水牛、黃牛、山羊、綿羊、牦牛、雞、鴨、鵝、馬、驢、鼠、雀、鴕鳥、貂、駱駝、乳鴿、貓、雉雞、鴿子和貉等21個物種的DNA，分別以其為模板采用1.1.2中所述引物進行PCR擴增。將擴增產物進行電泳，電泳結果見圖2。由圖2可以看出，21種動物DNA的擴增產物均為單一的條帶，條帶長度為227 bp，包括COI序列192 bp和M13測序引物35 bp。

將擴增產物進行Sanger測序，利用NCBI數據庫對測序結果進行比對，結果見表1。由表1可以看出，本方法所用引物（1.1.2中所述）對于測試的21種動物DNA均可以擴增出相應物種的COI基因序列，且序列的相似度均在95%以上，說明該引物通用性良好。

1—豬DNA；2—水牛DNA；3—黃牛DNA；4—山羊DNA；5—綿羊DNA；6—牦牛DNA；7—雞DNA；8—鴨DNA；9—鵝DNA；10—馬DNA；11—驢DNA；12—鼠DNA；13—雀DNA；14—鴕鳥DNA；15—貂DNA；16—駱駝DNA；17—乳鴿DNA；18—貓DNA；19—雉雞DNA；20—鴿子DNA；21—貉DNA。

圖2 引物通用性評價電泳圖

2.2 樣品宏基因組測序及結果確認

采用本研究建立的動物源性成分非靶向檢測方法對在市場上獲得的7份實際樣品和3份實驗室模擬樣品進行檢測，10份樣品的樣品信息見表2。

提取10份樣品的DNA（DNA濃度見表2），按照1.1.2中所述引物進行PCR獲得擴增產物。采用Miseq高通量測序儀對擴增產物進行宏基因組測序，將測序得到的數據進行拼接、過濾、去嵌合和OTU聚類獲得最終的結果序列。將測序結果序列在NCBI數據中進行比對，結果見表3。由表3可知，模擬樣品8檢出豬源性成分和黃牛源性成分，模擬樣品9檢出黃牛源性成分、雞源性成分、鴨源性成分，模擬樣品10檢出綿羊源性成分、雞源性成分、豬源性成分，檢測結果與實際摻入物種一致；而實際樣品1、樣品4、樣品5和樣品6除檢出與其樣品名稱相符的牛源性成分外，還檢出了豬源性成分、馬源性成分、雞源性成分等與樣品名稱不符或標簽未標識的成分；實際樣品2和樣品3除檢出與其樣品名稱相符的豬源性成分外，還檢出了雞源性成分。

為了驗證本研究建立方法檢測結果的準確性，采用現有標準方法對實際樣品（1～7）的宏基因組測序結果（表3）進行確認，結果見表4。從表4中可以看出，采用宏基因組對7份實際樣品進行非靶向檢測的結果與采用現有標準方法的檢測結果一致。綜合模擬樣品檢測結果，說明本研究建立的食品中動物源性成分非靶向檢測方法的檢測結果準確可靠。

3 結論

肉類食品是人們餐桌必備的主要食品之一，但受經濟利益驅動，肉類食品中摻雜使假、以次充好事件頻繁發(fā)生。針對目前肉類食品動物源性成分檢測標準僅能進行單一成分的定向檢測而極易造成漏檢的問題，本研究建立了一種食品中動物源性成分非靶向篩查方法，可以實現樣品中常見動物源性成分的非定向同時檢測。應用該方法對模擬樣品和實際樣品進行檢測，模擬樣品檢測結果與模擬情況一致，且該方法對實際樣品檢測結果與現有標準方法檢測結果一致，說明該方法準確可靠。該方法可以快速鎖定樣品中未知的動物源性成分，可為政府打擊肉類食品摻假提供有力的技術支撐。

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