不同萃取法測定雞蛋中甲氧芐啶殘留量的方法比對

鄭陸紅

摘 要：本研究在樣品經(jīng)乙腈提取后分別采用陽離子交換固相萃取柱萃取、乙腈飽和正己烷液液萃取和QuEChERS萃取3種不同的萃取凈化方法對雞蛋進行前處理，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）對雞蛋中甲氧芐啶殘留量進行測定。研究表明3種不同萃取凈化方法在0.5～50.0 μg·L-1甲氧芐啶均具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R2）大于0.999，檢出限為0.5 μg·kg-1，定量限為1.0 μg·kg-1，方法回收率均在60.3%～99.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于15%。3種前處理方法均適用于雞蛋中甲氧芐啶的測定。

關(guān)鍵詞：甲氧芐啶；雞蛋；固相萃取法；液液萃取法；QuEChERS萃取法；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

Comparativer Study of the Effects of Different Extraction Methods on the Detection of Trimethoprim Residue in Egg

ZHENG Luhong1，2，3

（1.Guangdong Food Industry Institute Co.， Ltd.， Guangzhou 511442， China;

2.Guangdong Provincial Public Laboratory of Food Industry， Guangzhou 511442， China;

3.Guangdong Food Quality Supervision and Inspection Station， Guangzhou 511442， China）

Abstract： This study investigated the pre-treatment of eggs using three different extraction and purification methods， namely cation exchange solid-phase extraction， acetonitrile saturated n-hexane liquid-liquid extraction， and QuEChERS extraction， after being extracted with acetonitrile. The residues of trimethoprim in eggs were determined by ultra-high performance liquid chromatogeny-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）. The result? showned that three different extraction and purification methods exhibit a good linear relationship for trimethoprim in the concentration range of 0.5 ～ 50.0 μg·L-1， the correlation coefficients （R2） were greater than 0.999， the

detection limit was 0.5 μg·kg-1， the quantification limit of 1.0 μg·kg-1， and the recovery rates of the methods ranged from 60.3% to 99.7% with the RSD less than 15%. These three methods are all suitable for the determination of trimethoprim in eggs．

Keywords： trimethoprim; eggs; solid phase extraction; liquid-liquid extraction; QuEChERS extraction; ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

甲氧芐啶（Trimethoprim）是一種抗菌增效劑，常將其與磺胺類藥物一起使用，使其抗菌譜擴大、抗菌活性增強，達(dá)到抗菌增效的效果[1-3]。甲氧芐啶可用于治療細(xì)菌感染性疾病，在獸醫(yī)臨床上應(yīng)用十分廣泛[4]。如果養(yǎng)殖戶違規(guī)加大甲氧芐啶用量，且不遵守停藥時間，則容易導(dǎo)致上市畜禽產(chǎn)品中存在藥物殘留。動物產(chǎn)品的甲氧芐啶殘留一般不會對人體產(chǎn)生急性毒性作用，但長期大量攝入甲氧芐啶殘留的食品，可能在人體內(nèi)蓄積，導(dǎo)致胃腸道損害、皮膚過敏癥狀等。目前，我國已批準(zhǔn)甲氧芐啶作為增效劑與磺胺類藥物聯(lián)合使用。我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部2022年頒布的《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中41種獸藥最大殘留限量》（GB 31650.1—2022）規(guī)定甲氧芐啶在家禽蛋中的最大殘留限量值為10 μg·kg-1[5]。

目前，針對雞蛋中甲氧芐啶殘留量分析的檢測方法報道較少。我國已有相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)來檢測動物源性食品中甲氧芐啶的含量，如《進出口動物源性食品中二甲氧芐氨嘧啶、三甲氧芐氨嘧啶和二甲氧甲基芐氨嘧啶殘留的檢測方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》（SN/T 2538—2010）[6]適用于肌肉、內(nèi)臟、牛脂肪、雞蛋、魚肉及蜂產(chǎn)品中甲氧芐啶殘留量的測定，但該標(biāo)準(zhǔn)未寫明雞蛋應(yīng)按哪種前處理方式進行實驗；《動物源性食品中磺胺類藥物殘留量的測定 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》（GB/T 21316—2007）[7]用于測定動物源食品（肝臟、腎臟、肌肉、水產(chǎn)品和牛奶）中甲氧芐啶的殘留量，針對雞蛋中甲氧芐啶殘留量的檢測方法相對較少。因此，本文對比不同的萃取方法包括固相萃取法、液液萃取法和QuEChERS法的檢出限、回收率、精密度以及基質(zhì)效應(yīng)，建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測雞蛋中甲氧芐啶殘留的方法，為監(jiān)測雞蛋中的甲氧芐啶殘留提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲氧芐啶（738-70-5），BePure公司；氨水、乙腈、甲醇、正己烷、甲酸，上海安譜科技股份有限公司；氯化鈉、無水硫酸鈉，廣州化學(xué)試劑廠；固相萃取小柱PCX（60 mg，3 mL），天津博納艾杰爾科技有限公司；ProElut QuEChERS（15 mL）凈化管，迪馬公司。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，Waters公司；天平，梅特勒-托利多有限公司；離心機，天美中國科學(xué)儀器有限公司；渦旋振蕩器，廣州綠百草生物科技有限公司；氮吹儀，?？苾x器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 試料的制備

取500 g雞蛋，攪拌均勻后裝入潔凈容器內(nèi)，密封并做好標(biāo)識。

1.2.2 固相萃取法

稱取2.0 g試樣于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈，渦旋振蕩3 min，超聲20 min，10 000 r·min-1離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液待凈化。PCX固相萃取小柱用3 mL水和3 mL甲醇活化后，取備用液過小柱。依次用3 mL水和3 mL甲醇淋洗，用3 mL 5%氨水-甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，35 ℃水浴中濃縮至近干。用1 mL 50%乙腈水溶液溶解殘渣，混勻過0.22 μm有機濾膜過濾后供UPLC-MS/MS測定。

1.2.3 液液萃取法

稱取2.0 g試樣于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈，渦旋振蕩3 min，超聲20 min，10 000 r·min-1離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入

20 mL乙腈飽和正己烷渦旋振搖5 min，10 000 r·min-1離心5 min，取乙腈層于35 ℃水浴中濃縮至近干。用1 mL 50%乙腈水溶液溶解殘渣，混勻過0.22 μm有機濾膜過濾后供UPLC-MS/MS測定。

1.2.4 QuEChERS萃取法

稱取2.0 g試樣于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈，渦旋振蕩2 min，超聲20 min，加入3 g氯化鈉和3 g無水硫酸鈉，渦旋振蕩2 min，10 000 r·min-1離心5 min。轉(zhuǎn)移上清液于QuEChERS凈化管中，渦旋混合1 min，10 000 r·min-1離心3 min，準(zhǔn)確吸取

5 mL已凈化的提取液于35 ℃水浴中濃縮至近干。用1 mL 50%乙腈水溶液溶解殘渣，混勻過0.22 μm有機濾膜過濾后供UPLC-MS/MS測定。

1.2.5 色譜條件

色譜柱：C18柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）；流速：0.4 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進樣量：2 μL；流動相：A為0.1%甲酸水溶液，B為甲醇。梯度洗脫程序：0.00～0.50 min，95%A；0.51～3.00 min，95%A→5%A；3.01～4.00 min，5%A；4.01～

6.00 min，95%A。

1.2.6 質(zhì)譜條件

通過電噴霧離子源正離子模式下進行多反應(yīng)監(jiān)測，電離電壓1.2 kV，源溫度150 ℃，霧化氣溫度400 ℃，錐孔氣流速50 L·h-1，霧化氣流速

1 000 L·h-1。

1.2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制與基質(zhì)效應(yīng)

按1.2.2、1.2.3、1.2.4 3種前處理方法，分別用空白基質(zhì)溶液與50%乙腈水溶液配制成0.500 μg·mL-1、1.000 μg·mL-1、2.000 μg·mL-1、

5.000 μg·mL-1、10.000 μg·mL-1、20.000 μg·mL-1和50.000 μg·mL-1的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。在相同條件下進行測定，分別建立基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線和溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，通過計算基質(zhì)效應(yīng)（Matrix Effect，ME）值，判斷基質(zhì)效應(yīng)。公式為ME=（基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的斜率/無基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的斜率-1）×100%。|ME|值大于50%，為強基質(zhì)效應(yīng)；|ME|值在20%～50%，為中等基質(zhì)效應(yīng)；|ME|值小于20%，為弱基質(zhì)效應(yīng)[8]。

1.3 結(jié)果處理

實驗結(jié)果采用MassLynx V4.2軟件進行繪圖和數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 液相色譜條件的選擇

甲氧芐啶呈弱堿性，正離子掃描模式下，在流動相中加入甲酸可提高待測目標(biāo)化合物的電離效率和改善峰形。因此本試驗考察了0.1%甲酸水溶液-甲醇、0.1%甲酸水溶液-乙腈、水-甲醇和水-乙腈對甲氧芐啶的分離效果、靈敏度及峰形的影響。結(jié)果表明，水相中加入0.1%甲酸可較好地提高檢測響應(yīng)，峰形尖銳對稱，保留時間穩(wěn)定，重復(fù)性好。甲醇極性較乙腈強，在反相液相色譜中甲醇保留強于乙腈，且響應(yīng)比乙腈高。因此本文選用含0.1%甲酸水溶液-甲醇溶液作為流動相。甲氧芐啶的總離子流圖如圖1。

圖1 甲氧芐啶標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖

2.2 質(zhì)譜條件的選擇

基于目標(biāo)物的分子結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)性質(zhì)，選擇ESI+離子化模式，通過流動注射進樣對母離子和子離子進行掃描，優(yōu)化目標(biāo)物的錐孔電壓與碰撞能量參數(shù)，獲得母離子、定量離子和定性離子最優(yōu)質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.3 萃取凈化方法的選擇

雞蛋中含有大量的蛋白質(zhì)和脂肪，特別是磷脂，存在雜質(zhì)多、基質(zhì)干擾嚴(yán)重等問題，去除干擾因素是獸藥殘留檢測分析的難題。本實驗對比了陽離子交換固相萃取柱萃取、乙腈飽和正己烷液液萃取和QuEChERS萃取3種不同萃取凈化方法。QuEChERS萃取凈化的色譜圖有較多雜峰，容易產(chǎn)生干擾，基質(zhì)效應(yīng)較大，回收率偏低。液液萃取法能得到較為滿意的除雜效果和回收率，但需要使用大量溶劑，并需要濃縮，費時。固相萃取法能有效地將干擾組分與目標(biāo)物分離，減小雜質(zhì)干擾，回收率高，重現(xiàn)性好，且不需要使用大量有機溶劑，對環(huán)境的污染小。3種不同萃取凈化方法的圖譜見圖2。相比較，固相萃取法更有優(yōu)勢。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性范圍、檢出限與定量限

配制系列甲氧芐啶標(biāo)準(zhǔn)溶液，在設(shè)定好的儀器條件下進行測定。通過測定甲氧芐啶的峰面積（Y）與其濃度（X）進行回歸分析，甲氧芐啶在0.5～

50.0 μg·L-1線性良好，回歸方程為Y=1 014.9X+

87.444，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8，可用于準(zhǔn)確定量。以信噪比為3作為檢出限，以信噪比為10作為定量限。結(jié)果表明，3種檢測方法的檢出限為0.5 μg·kg-1，定量限為1.0 μg·kg-1。

2.4.2 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是指基質(zhì)中除待測物之外的其他成分對待測物分析的影響。在離子化過程中，基質(zhì)中的成分與目標(biāo)組分存在競爭，改變了目標(biāo)物的電離效率，表現(xiàn)為離子增強或抑制作用，影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性[9]。按1.2.7操作所得基質(zhì)標(biāo)曲與溶劑標(biāo)曲的線性方程、相關(guān)系數(shù)以及基質(zhì)效應(yīng)見表2。結(jié)果表明，液液萃取法和固相萃取凈化法基質(zhì)效應(yīng)較弱，而QuEChERS萃取凈化法為中等基質(zhì)效應(yīng)，需要通過配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進行定量，降低基質(zhì)效應(yīng)的影響。

2.4.3 加標(biāo)回收率與精密度

向陰性雞蛋樣品中分別添加濃度為1.00 μg·kg-1、5.00 μg·kg-1、20.00 μg·kg-1的甲氧芐啶，進行3水平的回收率試驗，每個添加水平重復(fù)測定6次。

3種前處理方法3個添加水平下雞蛋樣品中甲氧芐啶的回收率和精密度如表3所示。3種前處理方法回收率均符合《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》

（GB/T 27404—2008）[10]中回收率與精密度的判定：被測組分含量＜0.1 mg·kg-1，回收率為60%～120%；被測組分含量低于100 μg·kg-1，實驗室內(nèi)變異系數(shù)小于15%。可以看出，3種前處理方法回收率和精密度良好，可滿足雞蛋中甲氧芐啶殘留檢測的需求。QuEChERS法基質(zhì)效應(yīng)大，回收率偏低，使用該方法時最好配制基質(zhì)標(biāo)曲進行定量。

3 結(jié)論

樣品采用乙腈提取，對比了陽離子交換固相萃取柱萃取、乙腈飽和正己烷液液萃取和QuEChERS萃取的萃取凈化效果。3種前處理方法操作簡便，提取時間較短，精密度和加標(biāo)回收率都在參考控制范圍內(nèi)，方法的檢出限均為0.5 μg·kg-1，定量限為1.0 μg·kg-1。3種前處理方法均適用于雞蛋中甲氧芐啶含量的測定，適用于日常篩選和監(jiān)測工作，并為農(nóng)業(yè)行政主管部門制定政策和加強管理提供參考。

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