木質素降解真菌的篩選與鑒定

劉佳莉，成于恒

（1.河北環(huán)境工程學院河北省農(nóng)業(yè)生態(tài)安全重點實驗室，河北秦皇島 066102；2.福建師范大學地理科學學院，福建福州 350007）

木質素是一類結構復雜而穩(wěn)定的有機聚合物，它結實堅韌，不容易腐爛，同時賦予植物作為植物細胞壁形成中特別重要的剛性成分。木質素還是自然界僅次于纖維的第二大可再生生物資源，全球年產(chǎn)量可達1500億t[1]。

我國是一個農(nóng)業(yè)大國，農(nóng)產(chǎn)品的生產(chǎn)量在世界居于領先地位，每年會產(chǎn)生大量的農(nóng)業(yè)廢棄物——秸稈，但由于我國對秸稈的集中處理設施和技術規(guī)范還遠沒有到位，絕大多數(shù)都是以焚燒的形式處理，此種方法利用率低，同時還會排出大量的有害氣體和煙塵，導致空氣質量下降，造成了嚴重的空氣污染，影響人體健康，不利于農(nóng)業(yè)和環(huán)境的協(xié)調發(fā)展。木質素是秸稈的主要組成部分，它在自然環(huán)境中降解緩慢，所以尋找一種可以高效利用木質素的方法變得尤為迫切。

目前，常用于降解木質素的方法有物理法、化學法、物理化學法、生物法，但是物理法、化學法、物理化學法都對反應條件比較苛刻，對設備要求高[2]。而通過微生物法來處理木質素，具有反應條件溫和、低耗能的特點，所以生物降解法為我們提供了更具體更有效的選擇，微生物當中能分解木質素的大多是真菌。20世紀80年代，科學家們先后從真菌的代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了漆酶、木質素過氧化物酶和錳過氧化物酶，這三種類酶都被證實對木質纖維具有降解作用[3-4]。本文通從秦皇島海濱國家森林公園中的土壤中，篩選出具有高效降解木質素的真菌，然后對其酶活性進行測定，最后對影響產(chǎn)酶的條件進行探究。

1 材料與方法

1.1 試驗土樣

從秦皇島海濱國家森林公園中選取三塊10m×10m的樣地，取樣時刨除土層表面凋落物等雜質，使用五點取樣法，用土鉆采集5個深度約20cm的土芯，挑除細根，去除肉眼可見的作物殘留物及石頭等細小雜質，徹底混合形成一個均勻的混合樣品放置于自封袋中，然后將樣品放在裝有冰袋的保溫箱中，立即送往實驗室進行后續(xù)處理分析。

1.2 菌株的篩選

稱取10g土壤于錐形瓶中，加入90ml滅菌處理的蒸餾水，200rpm，30min，取10-3、10-4、10-5濃度懸液涂布于固體培養(yǎng)基上，挑取真菌菌落進行純化。經(jīng)過6輪純化后，菌株放于4℃冰箱冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

參考李靈靈等人的方法[5]挑取在PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d后經(jīng)純化菌株的菌絲，接種到PDA-愈創(chuàng)木酚固體培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，觀察其是否顯現(xiàn)出紅色；接種于苯胺藍固體培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，觀察有無透明圈出現(xiàn)。

1.3 酶活測定

將篩選出的真菌置于PDA固體培養(yǎng)基中28℃下培養(yǎng)5d后，制備菌塊，接種于含有液體發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基[6]的100ml錐形瓶中，接種量3%，放于30℃，150rpm的水浴搖床中培養(yǎng)5d。提取發(fā)酵培養(yǎng)5d的產(chǎn)酶培養(yǎng)液置于滅菌處理后的離心管中。在28℃，4500rpm條件下離心15min，靜置10min后的上層清澈液體為粗酶液。

漆酶（Lac）活性測定使用愈創(chuàng)木酚方法[7]。每1min催化1nmol/L愈創(chuàng)木酚的酶量為1個酶活，單位為U。

錳過氧化物酶（Mnp）活性測定反應體系為3ml，使用50mmol/L，pH=4.5的酒石酸-酒石酸鈉緩沖液2ml，15mmol/L硫酸錳1ml，粗酶液0.4ml，在37℃加入0.1ml的10mmol/L H2O2溶液啟動反應，測定在240nm處3min吸光度的變化[8-9]。

每種酶活測定做5次重復。

1.4 生長曲線的測定

將菌株用接種針接于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h后，吸取100μl菌液于新的液體培養(yǎng)基中，每2h在600nm波長下測定吸光度，并繪制生長曲線。

1.5 形態(tài)學鑒定

將菌株接種于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5d，觀察菌落形態(tài)并在顯微鏡下觀察菌絲，然后結合《真菌鑒定手冊》區(qū)分真菌種類。

1.6 木質素降解率的測定

將菌株接種到200ml液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3d，然后從中吸取100μl菌液接于木質素降解液體培養(yǎng)基中。每兩天吸取5ml液態(tài)培養(yǎng)物并離心（7500rpm/min，5min），將稀釋10倍后的上層清液置于275nm波長下，測定其OD值。同一菌株做三個重復。

1.7 初始pH值對酶活性的影響

設置液體培養(yǎng)基初始pH值為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0五組，于30℃，150rpm恒溫培養(yǎng)，每兩天取一次樣，4500rpm下離心15min，分別取不同pH值下的培養(yǎng)液上清液測定酶活。

1.8 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2016對菌株各項實驗所得數(shù)據(jù)統(tǒng)計、計算并制作圖表。使用SPSS 23.0對數(shù)據(jù)差異性進行Duncan分析。

2 實驗結果與分析

2.1 愈創(chuàng)木酚顯色和苯胺藍褪色

愈創(chuàng)木酚是一種木質素苯環(huán)單元特征類似物，能降解木質素的真菌會產(chǎn)生漆酶（Lac），漆酶可以使愈創(chuàng)木酚變?yōu)榧t色，若菌株可以分泌漆酶，則會在PDA-愈創(chuàng)木酚平板上顯現(xiàn)出紅色顯色圈，顯色圈的大小可以衡量產(chǎn)酶量與活性。

但由于愈創(chuàng)木酚的特殊物理化學性質，使用愈創(chuàng)木酚培養(yǎng)基無法檢出錳過氧化物酶（MnP）與木質素過氧化物酶（Lip）。而錳過氧化物酶（MnP）與木質素過氧化物酶（Lip）可以使偶氮染料苯胺藍發(fā)生褪色，所以使用苯胺藍平板可以檢測出錳過氧化物酶和木質素過氧化物酶。褪色圈大小可以衡量兩種酶的酶量與酶活力。

本實驗共篩選出6株真菌，其中只有菌株X1具有產(chǎn)木質素降解酶能力。X1在PDA-愈創(chuàng)木酚平板（圖1A）上顯紅色效果強烈；與未接種的苯胺藍平板（圖1C）對比，菌株X1在PDA-苯胺藍平板上培養(yǎng)使藍色全部褪色（圖1B），說明菌株X1可以產(chǎn)生降解木質素的酶，且產(chǎn)酶效果好。

圖1 愈創(chuàng)木酚顯色和苯胺藍褪色平板

2.2 酶活測定

將菌株X1接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)5d，吸取菌液離心，取上層清澈液體測定三種酶的酶活力。測定結果表明Lac活力為38.4U/ml，MnP活力為104.9U/ml，如表1。

表1 菌株X1漆酶、錳過氧化物酶酶活

2.3 菌株生長曲線

由于培養(yǎng)液中的菌株量增加可以降低透光率、增加吸光值（OD值），所以我們以培養(yǎng)時間為橫坐標，以培養(yǎng)液在600nm下的OD值為縱軸繪制圖像，結果見圖2，由于含菌量少，在6h前變化較緩，在6h之后生長速率加快，10h后趨于穩(wěn)定不再增長，此時菌株數(shù)量達到最大值。

圖2 菌株X1生長曲線

2.4 菌株形態(tài)學觀察

將菌株點接種于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5d，X1的菌落外表為白色，呈平面擴散生長，形狀為扁平圓形，菌落中心略微突出，菌絲易于挑取為短絨毛狀，菌落干燥，底部與培養(yǎng)基的結合緊密，菌落邊緣與培養(yǎng)基結合處較為堅硬。通過在顯微鏡下觀察其菌絲，發(fā)現(xiàn)其為單菌絲，菌絲上有橫隔，末端呈鈍圓形（圖3）。同時結合《真菌鑒定手冊》判斷其為半知菌亞門，絲孢綱，絲孢目，叢梗孢科，地霉屬。

圖3 菌株菌絲形態(tài)

2.5 菌株木質素降解率測定

通過對菌株X1木質素降解真菌解木質素量測定，發(fā)現(xiàn)在測定的前兩天對于堿性木質素的降解率變化較小，可能由于菌株在前期生長緩慢且先利用培養(yǎng)基中的碳源和氮源，第三天開始降解木質素，第四天降解速率達到最高，第五天降解率達到峰值并基本維持峰值，菌株X1對于堿性木質素降解率為44.55%（圖4）。

圖4 木質素降解率

2.6 初始pH對漆酶、錳過氧化物酶活性的影響

在菌株生長前2d時，不同pH對于酶活力的影響并不算大，但在第2d之后顯現(xiàn)出差異。當菌株在初始pH值為4.0，培養(yǎng)2d后漆酶活力迅速上升，直到培養(yǎng)6d時漆酶活力達到最大值45.6 U，之后由于含菌量達最大值，培養(yǎng)基內(nèi)營養(yǎng)成分被消耗，菌株活力下降甚至死亡，酶活力降低（圖5）。在初始pH值為4.0時，培養(yǎng)2d后錳過氧化物酶活力迅速上升，也在培第養(yǎng)6d時酶活力達到峰值為133.0 U，在pH值為4.5時酶活性在第6d接近峰值，但在前期和后期低于pH值為4.0的酶活，pH值處于3.0和3.5時，明顯對酶活力產(chǎn)生抑制（圖6）。真菌X1在pH為4.0的情況下生長發(fā)育最好，在培養(yǎng)第6d時，產(chǎn)酶性能最佳。

圖5 初始pH對漆酶酶活影響

圖6 初始pH對錳過氧化物酶酶活影響

3 結論與討論

菌株X1可以產(chǎn)漆酶、錳過氧化物酶、木質素氧化酶等三種可以降解木質素的酶。當培養(yǎng)基pH為4時菌株的產(chǎn)酶能力最強，最佳產(chǎn)酶時間為第6天，與劉梁濤等人的結論一致，但漆酶活性低于劉梁濤的結論[10]。該菌株對于堿木質素的降解率隨著時間的增加而增加，在培養(yǎng)7d后可達到44.55%，在第4d之后降解率趨于穩(wěn)，該菌株對于堿木質素的降解率44.55%低于王福玲實驗得到 的65.4%[11]，高于喬喬報道的36.4%[12]，降解效率適中。

本實驗篩選出的真菌X1具有木質素降解能力，可以進一步應用于化工生產(chǎn)領域、環(huán)保領域、農(nóng)林領域等，可為木質素的降解、利用和秸稈還田提供新的微生物材料。