超聲波與酶法輔助提取紫蘇葉中黃酮類化合物的工藝研究*

劉 娜，陳金瑩，閆文樂(lè)，苑儀楨，王凱瑤，張紫玉，司可可

(1 鄭州師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，河南 鄭州 450044；2 天水市第五中學(xué)，甘肅 天水 741000)

紫蘇其葉似唇形，葉邊呈鋸齒狀，屬于唇形科紫蘇屬中的一年生草本植物[1]。在我國(guó)有兩千多年的栽培歷史，各地區(qū)均有種植[2]。紫蘇氣清香，味微辛，其根、莖、葉、籽皆可入藥，具有很高的醫(yī)用和食用價(jià)值[3-5]。紫蘇葉中含有多種生物活性成分，紫蘇葉中的黃酮類化合物具有殺菌消炎、抗氧化、促進(jìn)血液循環(huán)、增強(qiáng)免疫力、降壓降脂、減輕心腦血管疾病等功效[6-8]。從植物組織中萃取黃酮類化合物的方法有：溶劑提取法[9-10]、超聲波和微波輔助提取法[11-13]等。其中溶劑提法報(bào)道較多，該法對(duì)提取設(shè)備要求不高、所耗成本低、綠色安全，但提取出的成分較多，不利于后續(xù)的分離純化。超聲波輔助提取法具有所需儀器設(shè)備簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)單高效、提取率高的優(yōu)點(diǎn)。因此，文中采用超聲波與酶輔助提取紫蘇葉中的黃酮類化合物，并通過(guò)紫外分光光度法進(jìn)行定量分析。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、加酶量、酶解溫度、酶解時(shí)間、超聲時(shí)間、超聲溫度、料液比等因素對(duì)紫蘇葉中黃酮類化合物萃取率的影響，以期優(yōu)化出最佳提取工藝。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與試劑

新鮮紫蘇葉采摘于廣西南寧(4月)，蘆丁對(duì)照品和纖維素酶：上海麥克林生化科技有限公司；無(wú)水乙醇等試劑為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FA114電子分析天平，上海?？惦娮觾x器廠；T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司；JP-020超聲波清洗儀，深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司；H1850 醫(yī)用離心機(jī)，北京儀器開(kāi)發(fā)有限公司；DF-101S恒溫油浴鍋，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原材料預(yù)處理

紫蘇葉洗凈并至于陰涼處晾干，然后放在烘箱中60 ℃下烘4 h，將烘干后的紫蘇葉粉碎，過(guò)60目篩得紫蘇葉粉末，裝入樣品袋中置于陰涼干燥處備用。

1.2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

向50 mL燒杯中加入準(zhǔn)確稱取的10.1 mg蘆丁對(duì)照品，加入60%乙醇溶液10.0 mL，攪拌溶解后轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，加60%乙醇溶液至刻度線，搖勻得0.202 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。取潔凈干燥的10 mL容量瓶6個(gè)，用吸量管分別準(zhǔn)確量取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中，加60%乙醇溶液至5.0 mL。向上述6個(gè)容量瓶中依次加入0.3 mL 5% NaNO2溶液，搖勻后靜置3 min，再加入10% Al(NO3)3溶液0.3 mL，搖勻后靜置3 min，最后加入5% NaOH溶液3.0 mL，加60%乙醇溶液至刻度線，搖勻后靜置10 min。通過(guò)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在500 nm處，測(cè)定其吸光度A。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度C為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 總黃酮類化合物含量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取1.0 g紫蘇葉粉末于圓底燒瓶中，加入一定比例的纖維素酶，然后按一定的料液比加入一定體積的乙醇溶液，設(shè)置酶解溫度，在該溫度下水解一定時(shí)間，水解結(jié)束后在100 ℃下滅活，隨后轉(zhuǎn)移至超聲儀中，設(shè)置超聲溫度，在該溫度下超聲一定時(shí)間，將所得萃取液抽濾。量取5.0 mL離心處理，準(zhǔn)確移取2.0 mL上層清液于50 mL容量瓶中，然后按照1.2.2的方法進(jìn)行顯色和測(cè)定所得試液的吸光度A。最后根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算試液中黃酮類化合物的濃度和紫蘇葉中黃酮類化合物的萃取率，計(jì)算公式如下：

(1)

式中：y為紫蘇葉中黃酮類化合物萃取率，%；c為試液黃酮類化合物濃度，mg/mL；v0為萃取試液總體積，mL；n為稀釋倍數(shù)；m為稱取紫蘇葉干粉末質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與討論

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

圖1 蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Rutin’s standard curve

以60%乙醇溶液為空白對(duì)照，通過(guò)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在500 nm處，測(cè)定其吸光度。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度C為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果如圖1所示，蘆丁濃度c(mg/mL)與吸光度A在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系，線性回歸方程為A=12.257 4c-0.027 2，R2=0.999 4。

2.2 紫蘇葉中黃酮類化合物的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)紫蘇葉中黃酮類化合物萃取率的影響

準(zhǔn)確稱取5份1.0 g紫蘇葉粉末和3.0 mg/g纖維素酶(加酶量為0.3%)，按照料液比1∶40，分別加入體積分?jǐn)?shù)為30%、40%、50%、60%、70%乙醇溶液，在30 ℃下酶解3 h，酶解結(jié)束后在100 ℃下滅活，轉(zhuǎn)移至超聲儀中在50 ℃下超聲萃取20 min，萃取液按照1.2.3的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行處理和顯色，測(cè)定各試液的吸光度，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)紫蘇葉中黃酮類化合物萃取率的影響。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)萃取率的影響Fig.2 Influence of ethanol volume fraction on extraction rate

不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液對(duì)萃取率的影響如圖2所示。乙醇體積分?jǐn)?shù)在30%～50%時(shí)，紫蘇葉中黃酮類化合物的萃取率呈現(xiàn)增大趨勢(shì)；乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，紫蘇葉中黃酮類化合物的萃取率達(dá)到最大值；乙醇體積分?jǐn)?shù)在50%～70%時(shí)，紫蘇葉中黃酮類化合物的萃取率呈下降趨勢(shì)。原因可能是紫蘇葉中黃酮類化合物為極性有機(jī)化合物，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)偏小或偏大時(shí)，黃酮類化合物在乙醇溶液中的溶解度偏低。因此，體積分?jǐn)?shù)為50%乙醇溶液作為萃取劑時(shí)，試液中黃酮類化合物的濃度最高。

2.2.2 加酶量對(duì)紫蘇葉中黃酮類化合物萃取率的影響

圖3 加酶量對(duì)萃取率的影響Fig.3 Effect of enzyme dosage on extraction rate

準(zhǔn)確稱取5份1.0 g紫蘇葉粉末，分別按照加酶量為0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%加入纖維素酶，按照料液比1∶40，加入50%乙醇溶液40 mL，在30 ℃下酶解3 h。酶解結(jié)束后在100 ℃下滅活，轉(zhuǎn)移至超聲儀中在50 ℃下超聲萃取20 min，萃取液按照1.2.3的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行處理和顯色，測(cè)定各試液的吸光度，考察加酶量對(duì)紫蘇葉中黃酮類化合物的萃取率的影響。

加酶量對(duì)萃取率的影響圖3所示。加酶量小于0.5%時(shí)，萃取率隨著加酶量的增加而升高；加酶量大于0.5%時(shí)，萃取率隨著加酶量的增加而降低；加酶量為0.5%時(shí)，萃取率最大。隨著加酶量的增大，水解速度加快；加酶量過(guò)大時(shí)，水解作用受到抑制，萃取率降低。因此，最佳加酶量為0.5%。

2.2.3 酶解溫度對(duì)紫蘇葉中黃酮類化合物萃取率的影響

準(zhǔn)確稱取5份1.0 g紫蘇葉粉末，加酶量為0.5%時(shí)，按照料液比1∶40，加入50%乙醇溶液40 mL，分別在度為20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃下酶解2 h，酶解結(jié)束后在100 ℃下滅活，轉(zhuǎn)移至超聲儀中在50 ℃下超聲萃取20 min，萃取液按照1.2.3的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行處理和顯色，測(cè)定試液的吸光度，根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算紫蘇葉中黃酮類化合物的萃取率，考察酶解溫度的影響。

圖4 酶解溫度對(duì)萃取率的影響Fig.4 Influence of enzymatic hydrolysis temperature on extraction rate

不同酶解溫度對(duì)萃取率的影響圖4所示。酶解溫度在 20～30 ℃時(shí)，萃取率逐漸升高；當(dāng)酶解溫度為30 ℃時(shí)，萃取率最大；酶解溫度超過(guò)30 ℃，萃取率逐漸下降。纖維素酶的活性受溫度影響較大，在30 ℃時(shí)酶的活性最高。因此，酶解溫度為 30 ℃時(shí)，試液中黃酮類化合物的濃度最高。

2.2.4 酶解時(shí)間對(duì)紫蘇葉中黃酮類化合物萃取率的影響

圖5 酶解時(shí)間對(duì)萃取率的影響Fig.5 Influence of enzymatic hydrolysis time on extraction rate

準(zhǔn)確稱取5份1.0 g紫蘇葉粉末，加酶量為0.5%時(shí)，按照料液比1∶40，加入50%乙醇溶液40 mL，在30 ℃下分別酶解1 h、2 h、3 h、4 h、5 h，酶解結(jié)束后在100 ℃下滅活，轉(zhuǎn)移至超聲儀中，在30 ℃下超聲萃取20 min，萃取液按照1.2.3的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行處理和顯色，測(cè)定各試液的吸光度，考察酶解時(shí)間對(duì)紫蘇葉中黃酮類化合物萃取率的影響。

不同酶解時(shí)間對(duì)萃取率的影響圖5所示。在酶解時(shí)間為1～3 h時(shí)，紫蘇葉中黃酮類化合物的萃取率呈上升趨勢(shì)；酶解時(shí)間為3 h時(shí)，萃取率達(dá)到最大值，酶解時(shí)間超過(guò)3 h后萃取率逐漸下降，原因是加入的纖維素酶能夠加速破壞植物的細(xì)胞壁，使黃酮類化合物更易浸出，但隨著酶解時(shí)間的增長(zhǎng)紫蘇葉中其他化合物的浸出抑制了黃酮類化合物的浸出，使萃取率呈下降趨勢(shì)。因此，最佳酶解時(shí)間為3 h。

2.2.5 超聲溫度對(duì)紫蘇葉中黃酮類化合物萃取率的影響

準(zhǔn)確稱取1.0 g紫蘇葉粉末，加酶量為0.5%時(shí)，按照料液比1∶40，加入50%乙醇溶液40 mL，在30 ℃下分別酶解3 h，酶解結(jié)束后在100 ℃下滅活，轉(zhuǎn)移至超聲儀中，分別在30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃下超聲萃取20 min，萃取液按照1.2.3的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行處理和顯色，測(cè)定各試液的吸光度，考察超聲溫度對(duì)紫蘇葉中黃酮類化合物萃取率的影響。

圖6 超聲溫度對(duì)萃取率的影響Fig.6 Influence of ultrasonic temperature on extraction rate

不同超聲溫度對(duì)萃取率的影響如由圖6所示。超聲溫度為30～60 ℃時(shí)，黃酮類化合物的萃取率呈上升趨勢(shì)；超聲溫度為60 ℃時(shí)，萃取率達(dá)到最大值；在超聲溫度60～80℃時(shí)，黃酮類化合物的萃取率隨著溫度的升高逐漸下降。可能的原因是隨著溫度的升高黃酮類化合物在溶液中的溶解度逐漸增大；超聲溫度過(guò)高時(shí)，一些熱敏性黃酮類化合物不穩(wěn)定，萃取率下降。由此可知，最佳的超聲萃取溫度為60 ℃。

2.2.6 超聲時(shí)間對(duì)紫蘇葉中黃酮類化合物萃取率的影響

圖7 超聲時(shí)間對(duì)萃取率的影響Fig.7 Influence of ultrasonic time on extraction rate

準(zhǔn)確稱取1.0 g紫蘇葉粉末，加酶量為0.5%時(shí)，按照料液比1∶40，加入50%乙醇溶液40 mL，在30 ℃下分別酶解3 h，酶解結(jié)束后在100 ℃下滅活，轉(zhuǎn)移至超聲儀中，在60 ℃下分別超聲萃取10 min、20 min、30 min、40 min、50 min，萃取液按照1.2.3的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行處理和顯色，測(cè)定各試液的吸光度，考察不同超聲時(shí)間對(duì)黃酮類化合物萃取率的影響。

不同超聲時(shí)間對(duì)萃取率的影響如圖7所示。在超聲萃取時(shí)間為10～20 min 時(shí)，萃取率隨著超聲萃取時(shí)間的推移逐漸增大；當(dāng)超聲時(shí)間為20 min時(shí)，萃取率達(dá)到最大值；一旦超聲時(shí)間超過(guò)20 min時(shí)，黃酮類化合物的萃取率逐漸下降。原因可能是隨著超聲萃取的時(shí)間延長(zhǎng)，黃酮類化合物的溶出程度增大，萃取率隨之增大；隨著紫蘇葉中其他化合物不斷被浸出，致使紫蘇葉中黃酮類化合物的溶解度降低，萃取率下降。由此可知，最佳超聲時(shí)間為20 min 。

2.2.7 料液比對(duì)紫蘇葉中黃酮類化合物萃取率的影響

準(zhǔn)確稱取1.0 g紫蘇葉粉末，加酶量為0.5%時(shí)，分別按照料液比1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60，加入50%乙醇溶液40 mL，在30 ℃下分別酶解3 h，酶解結(jié)束后在100 ℃下滅活，轉(zhuǎn)移至超聲儀中，在60 ℃下超聲萃取20 min，萃取液按照1.2.3的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行處理和顯色，測(cè)定各試液的吸光度，考察不同料液比對(duì)黃酮類化合物萃取率的影響。

圖8 料液比萃取率的影響Fig.8 Influence of solid-liquid ratio on extraction rate

不同料液比對(duì)萃取率的影響如圖8所示。料液比(1∶20)～(1∶50)時(shí)，紫蘇葉中黃酮類化合物的萃取率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；料液比為1∶50時(shí)，萃取率達(dá)到最大值；料液比(1∶50)～(1∶60)時(shí)，紫蘇葉中黃酮類化合物的萃取率呈下降趨勢(shì)。原因可能是萃取溶液較少時(shí)，紫蘇葉中黃酮類化合物易達(dá)到飽和未被充分浸出。當(dāng)萃取溶液較多時(shí)，所用溶劑量增多，黃酮類化合物的萃取率變化不大。由此可知，最佳的料液比為1∶50。

綜上所述，通過(guò)實(shí)驗(yàn)探究和對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析，得出最優(yōu)的萃取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、加酶量為0.5%，酶解時(shí)間3 h、酶解溫度30 ℃、超聲溫度為60 ℃、超聲時(shí)間20 min、料液比為1∶50 g/mL，此時(shí)萃取率最高為3.45%。

3 結(jié) 論

文中采用超聲波和酶法協(xié)同輔助溶劑提法萃取紫蘇葉中黃酮類化合物，并對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)單因素試驗(yàn)，探究乙醇體積分?jǐn)?shù)、加酶量、酶解時(shí)間、酶解溫度、超聲時(shí)間、超聲溫度、料液比等因素對(duì)紫蘇葉中黃酮類化合物萃取率的影響。最終得出的最佳萃取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%、加酶量為0.5%、酶解時(shí)間3 h、酶解溫度30 ℃、超聲時(shí)間20 min、超聲溫度為60 ℃、料液比為1∶50 g/mL。