雞壞死性腸炎病原菌的分離與鑒定

陳 成，孫思楠

（六安市裕安區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局 237010）

產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）是革蘭陽性粗大桿菌，屬厭氧菌，但對厭氧的要求不高，廣泛存在于自然界的水源、土壤、塵埃中。產(chǎn)氣莢膜梭菌在不同動物的身上都有致病性，可引起人及動物的創(chuàng)傷性壞疽[1－3]，導致了較為嚴重的食品安全問題。各型產(chǎn)氣莢膜梭菌均含有α 毒素 （CPa）基因，α 毒素被認為是最基本、最重要的致病因子[4]。本文對淮南市某肉雞養(yǎng)殖戶送檢的疑似壞死性腸炎的病死雞進行了病原菌的分離與鑒定，并對其進行了藥敏試驗，生化試驗，動物接種試驗等來確定其相關(guān)的特性。在六安的周邊地區(qū)，許多養(yǎng)殖戶所養(yǎng)的雞都因為壞死性腸炎而有所虧損。由于雞壞死性腸炎發(fā)病的廣泛性和難以防治，給養(yǎng)殖戶帶來大量的經(jīng)濟損失。壞死性腸炎被認為是影響肉雞行業(yè)的全球疾病之一，壞死性腸炎不但影響雞的生產(chǎn)性能而且易引發(fā)一些其他的疾病，造成嚴重的損失。此外由于許多養(yǎng)殖人員和獸醫(yī)工作人員對此病的認識不足，重視不夠也會造成許多不必要的損失。由此，對雞壞死性腸炎的研究，進行分離和鑒定，對于指導雞壞死性腸炎的預防和治療有重大意義，也豐富了雞壞死性腸炎的流行病學資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物

健康家兔一只，昆明小鼠四只。

1.1.2 病料

一只病死雞的肝和腸道。

1.1.3 培養(yǎng)基

厭氧肉肝湯、生化試驗培養(yǎng)基、糖發(fā)酵培養(yǎng)基、分離培養(yǎng)基、亞硫酸鹽-多粘菌素-磺胺嘧啶（SPS）瓊脂培養(yǎng)基。

1.1.4 藥敏紙片

卡納霉素，頭孢噻吩，麥迪霉素，頭孢哌酮，左氟沙星，氯霉素，克林霉素，頭孢他啶，復方新諾明，頭孢吡肟，米諾環(huán)素，諾氟沙星，克拉霉素，環(huán)丙沙星，氧氟沙星，頭孢噻肟，慶大霉素，頭孢噻琳，哌拉西琳，妥布霉素。

1.1.5 主要儀器及試劑

DK-8D 電熱恒溫水槽（上海醫(yī)用恒溫設備廠），高速離心機（德國Eppendorf 公司），LDZX-SOFBS 立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠），培養(yǎng)箱（力康生物醫(yī)療科技股份有限公司），天平（上海醫(yī)用激光儀器廠），培養(yǎng)皿，試管，量筒，三角燒瓶，玻璃棒，超凈工作臺（上海三發(fā)科學儀器有限公司），pH 試紙，電磁爐，試管塞，包裝紙扎繩，酒精燈，接種環(huán)，各種類型針頭，搪瓷缸。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基制備

1.2.1.1 厭氧肉肝湯的制備

肉肝浸液1000 mL；蛋白胨10 g；氯化鈉5 g；葡萄糖2 g；pH 調(diào)至7.6～7.8。

首先，取去筋膜及脂肪的牛肉和去筋膜的肝250 g，將其切成小塊，加入1000 mL 水，攪拌均勻，冷浸20～24 h。然后取出，加熱煮沸20～60 min，注意不要沸騰時溢出。補足水量，用紗布過濾，棄去肉渣及肝塊。然后，在肉肝湯中加入蛋白胨，氯化鈉，加熱溶解，調(diào)節(jié)pH值。煮沸10～20 min，冷卻后加入已經(jīng)混勻的肉肝湯浸液，加入葡萄糖混勻。將煮過的肝塊，用水沖洗后切成寬0.5 cm 以下的小方塊，用水沖洗后分裝試管，加入已經(jīng)混勻的肉肝湯，比例為1∶10。最后再加蓋3～4 mm 厚的液體石蠟，116℃，30～40 min。

1.2.1.2 sps 培養(yǎng)基的制備

胰蛋白胨15 g，酵母浸膏10 g，檸檬酸鐵0.5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1000 mL，pH=7.2

加熱煮沸1～2 min，溶解。將溶解后的溶液迅速放入高壓滅菌鍋中121℃高壓維持15 min。每升中加入下列過濾除菌溶液：100 g/L NaSO37H2O 5 mL；1.2 g/L 多粘菌素B 硫酸鹽溶液10 mL；1.2 g/L 磺胺嘧啶鈉溶液10 mL。

1.2.2 細菌增菌培養(yǎng)

從病死雞的腸道中用無菌接種環(huán)刮取病變組織，穿刺接種到已經(jīng)分裝好的厭氧肉肝湯中，點燃酒精燈，灼燒接種針滅菌。左手執(zhí)試管，右手執(zhí)接種環(huán)，從病變組織中挑取少許病變組織，刺入肉肝湯內(nèi)，深度接近試管底部，但不可過深。接種后抽出接種針，將試管塞和試管口迅速在火焰上灼燒殺菌后，將試管塞塞回試管口。再將多余在接種針的細菌在火焰上燒毀。接種完畢后，在試管上做好菌名、日期等標記，放在恒溫培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)24 h。24 h 后肉眼可見肉肝湯變得少許渾濁。用離心機高速離心，3500 r/min 離心10 min，可在試管底部看見白色沉淀物。涂片革蘭氏染色后油鏡下觀察到大量短柱狀菌體。

1.2.3 細菌的分離培養(yǎng)

首先將sps 培養(yǎng)基傾倒分裝到培養(yǎng)基內(nèi)。然后將肉肝湯中的菌體接種到該分離培養(yǎng)基中，點燃酒精燈，灼燒接種環(huán)，滅菌。左手執(zhí)培養(yǎng)皿，用左手的拇指和中指在靠近酒精燈的地方將培養(yǎng)皿打開約20o左右，右手執(zhí)接種環(huán)，從肉肝湯中刮取少量液體，用劃線法在培養(yǎng)基中劃線接種。接種結(jié)束后，迅速蓋好培養(yǎng)皿。在其背面標注好菌名、日期標記。整個操作過程中注意無菌操作。完成后，將培養(yǎng)基放在37℃的恒溫培養(yǎng)基中，隔夜培養(yǎng)。培養(yǎng)后觀察細菌形態(tài)，革蘭氏染色，鏡檢，用厭氧肉肝湯對單個菌落進行純培養(yǎng)。培養(yǎng)后采取革蘭氏染色，鏡檢細菌形態(tài)、染色特征。

1.2.4 生化試驗

將獲得的細菌純培養(yǎng)產(chǎn)物，分別接種在麥芽糖培養(yǎng)基、葡萄糖培養(yǎng)基，乳糖培養(yǎng)基、葡萄糖蛋白胨水、蛋白胨水上，培養(yǎng)后觀察各個培養(yǎng)基的試驗現(xiàn)象。

1.2.5 動物接種試驗

試驗動物分別為小鼠和家兔。首先采用腹腔注射的方法，將在分離培養(yǎng)中獲得的細菌純培養(yǎng)產(chǎn)物注射到小鼠體內(nèi)。正常飼喂24 h 后，制作心臟的血涂片。在載玻片上滴加一滴清水，破開小鼠腹部，取出心臟，用灼燒后的手術(shù)刀切入小鼠心臟，然后采用無菌操作的方法，點燃酒精燈，灼燒接種環(huán)，滅菌。左手執(zhí)培養(yǎng)皿，用左手的拇指和中指在靠近酒精燈的地方將培養(yǎng)皿打開約20o左右，右手執(zhí)接種環(huán)，從小鼠心臟的開口處刮取少量血液，將血液在載玻片清水上均勻涂開，待其正常干燥后待作鏡檢。同時也制作健康小鼠的心臟血液涂片作對比觀察。

在對家兔的實驗中，采用靜脈注射的方法將細菌純培養(yǎng)物注入到家兔體內(nèi)。立即處死，將尸體在恒溫箱內(nèi)保存24 h。同上述一樣的方法，取出兔子肝臟，觀察肝臟病理變化，并制作肝觸片，同時也做一組空白對照，取一只健康家兔的肝臟制作觸片進行對比觀察。

1.2.6 藥敏試驗

將細菌純培養(yǎng)產(chǎn)物加少許培養(yǎng)基中進行藥敏試驗。用到的藥物有：卡那霉素，頭孢噻吩，麥迪霉素，頭孢哌酮，左氟沙星，氯霉素，克林霉素，頭孢他啶，復方新諾明，頭孢吡肟，米諾環(huán)素，諾氟沙星，慶大霉素，環(huán)丙沙星，氧氟沙星，頭孢噻肟，頭孢噻琳，哌拉西琳，妥布霉素等。

2 試驗結(jié)果

2.1 增菌培養(yǎng)結(jié)果

將離心后的增菌液底部菌體，挑取少許在油鏡下觀察，看到較多的是一些短大，呈橢圓形，兩端鈍圓的桿菌，為革蘭氏陽性菌。

2.2 分離培養(yǎng)結(jié)果

首先在sps 培養(yǎng)基上看到了許多黑色圓形菌落生長。挑取黑色菌落做成涂片在油鏡下觀察，涂片中的細菌大小形態(tài)一致，可判斷為同一菌體。菌體呈革蘭氏陽性，兩端鈍圓，橢圓形短大有莢膜的桿菌。查閱相關(guān)資料推測該菌為產(chǎn)氣莢膜梭菌[1]。

2.3 生化試驗結(jié)果

表1 糖發(fā)酵試驗結(jié)果

表2 其他生化試驗結(jié)果

從糖酵解表中可以看出該菌對葡萄糖，麥芽糖，乳糖的酵解均有產(chǎn)酸產(chǎn)氣現(xiàn)象。而該菌的甲基紅試驗和吲哚試驗均顯示為陰性，vp 試驗和枸櫞酸鹽試驗的結(jié)果均顯示為陽性。這些現(xiàn)象均符合產(chǎn)氣莢膜梭菌的生化試驗特征。

2.4 動物接種試驗結(jié)果

2.4.1 接種家兔的試驗結(jié)果

在家兔的肝臟表面和內(nèi)部均發(fā)現(xiàn)了大量因為氣泡而產(chǎn)生的氣孔，該病理變化符合產(chǎn)氣莢膜梭菌的病理變化特征。對接種的家兔肝臟進行觸片，革蘭氏染色觀察，在油鏡下可清楚的看到肝臟有大量的短粗，兩頭鈍圓的革蘭氏陽性菌落。這也符合產(chǎn)氣莢膜梭菌的細菌形態(tài)學。

2.4.2 接種小鼠的試驗結(jié)果

接種小鼠在24 h 內(nèi)全部死亡。對死亡后的小鼠心臟做心血涂片，革蘭氏染色。在油鏡下也可清楚的看到短粗，兩頭鈍圓的橢圓形革蘭氏陽性菌體。

2.5 藥敏試驗結(jié)果

從表中可以看出，頭孢他啶對該菌的抑制最為明顯。其次哌拉西林、米諾環(huán)素、頭孢噻肟、妥布霉素、頭孢哌酮、氯霉素、克林霉素對其抑制也較為明顯。其中麥迪霉素、復方新諾明、頭孢吡肟、環(huán)丙沙星對其影響較小。

表3 藥敏試驗結(jié)果

3 討論與小結(jié)

試驗分離鑒定了病死雞的肝和腸道細菌，經(jīng)生化試驗、動物接種試驗、藥敏試驗，可確定該病原菌為產(chǎn)氣莢膜梭菌。首先sps 培養(yǎng)基生長出了黑色菌落，據(jù)相關(guān)資料表明[5-6]，產(chǎn)氣莢膜梭菌在sps 培養(yǎng)基生長出的菌落即為黑色菌落。其次在顯微鏡下觀察到的細菌形態(tài)也符合產(chǎn)氣莢膜梭菌的細菌形態(tài)學。我們同時對該菌進行了生化檢測，檢測結(jié)果表明，該菌的生化性質(zhì)和產(chǎn)氣腸桿菌的生化性質(zhì)相似。在動物接種試驗中，腹腔接種小白鼠24 h 內(nèi)全部死亡，在其心血涂片中發(fā)現(xiàn)了該菌的存在，證明該菌具有較強的致病性。接種的家兔在其肝臟發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)氣莢膜梭菌所產(chǎn)生的特征性病變。由以上四點可以推測出引起雞壞死性腸炎的病原菌為產(chǎn)氣莢膜梭菌。藥敏試驗結(jié)果表明，頭孢他啶對該菌的抑制最為明顯。其次哌拉西林、米諾環(huán)素、頭孢噻肟、妥布霉素、頭孢哌酮、氯霉素、克林霉素對其抑制也較為明顯。其中麥迪霉素、復方新諾明、頭孢吡肟、環(huán)丙沙星對其影響較小。