AKR7A5基因敲除對(duì)雄性小鼠生殖的影響

劉慶玲,趙振軍,徐文秀,孔令英,劉笑含,許文達(dá),董思琳,李 巖,石 慧

(煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東 煙臺(tái) 264005)

醛酮還原酶(Aldo-keto reductase,AKR)7A5是醛酮還原酶的第7個(gè)亞家族(Aldo-keto reductase family 7 member,AKR7A)成員[1-3],是HINSHELWOOD等2002年從小鼠肝臟中鑒定出的一種新醛酮還原酶,其可將體內(nèi)多種醛或酮還原為毒性較小或無(wú)毒性的相應(yīng)的醇,從而保護(hù)機(jī)體免受有毒醛或酮的損害[2]。國(guó)內(nèi)外對(duì)AKR7A5的研究多集中在醛酮還原酶特性上[4-5],且研究?jī)H限于體外細(xì)胞培養(yǎng)層面[6-7],在生殖方面研究較少。

目前不孕不育率逐年升高[8],人類不育的遺傳原因大多還不清楚[9],通過(guò)小鼠基因敲除模型可為揭示人類不育的遺傳原因提供理論依據(jù)[10-12]。實(shí)驗(yàn)室前期的人附睪差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn),人AKR7A2基因可能對(duì)睪丸、附睪精子有重要作用[13]。由于使用人類配子進(jìn)行研究存在倫理和技術(shù)問(wèn)題[14-15],且小鼠AKR7A5與人AKR7A2的氨基酸序列有89%同源性[2],因此,本研究利用AKR7A5基因敲除小鼠模型,在活體水平考察該基因?qū)π∈笊车挠绊?為人類不育研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

AKR7A5基因敲除型小鼠由山東大學(xué)惠贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠基因型鑒定 剪取小鼠尾尖,用動(dòng)物基因組DNA快速抽提試劑盒(D0065S,碧云天)提取小鼠基因組DNA。AKR7A5基因鑒定使用兩對(duì)引物,分別是Primer F1:5′-AAGGATCTCCATGCTTTCAGGC-3′;Primer R1:5′-ACAGCATCCTGACAATACCTAGGAAC-3′;Primer F2:5′-GCACCCTCTCTGCTAGTTGG-3′;Primer R2:5′-GGCAGTAGAGTTGGCTTGGCA3′。PCR反應(yīng)體系(50 μL)如下:2×taq plus master mix 25 μL、DNA模板2 μL、引物F/R(10 μmol/L)各2 μL、加入雙蒸水至50 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?預(yù)變性94 ℃×3 min;變性94 ℃×30 s;退火57 ℃×30 s;延伸72 ℃×50 s(30個(gè)循環(huán));最終延伸72 ℃×7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后,于凝膠成像儀系統(tǒng)拍照觀察。AKR7A5基因敲除型小鼠可見(jiàn)引物F1-R1擴(kuò)增出來(lái)的573 bp條帶,野生型小鼠可見(jiàn)引物F2-R2擴(kuò)增出來(lái)的742 bp條帶,同時(shí)擴(kuò)增出上述兩種條帶的小鼠即為雜合型。

1.2.2 小鼠睪丸、附睪系數(shù)測(cè)定 選擇2.5月齡野生型和AKR7A5基因敲除型小鼠各6只,稱量其體重、睪丸重、附睪重。按照臟器重(g)/體重(g)×100% 計(jì)算臟器系數(shù)[16]。

1.2.3 睪丸、附睪組織切片及蘇木精-伊紅(HE)染色 處死小鼠并分離睪丸和附睪,快速放入4%多聚甲醛溶液中,室溫固定12 h,制備組織切片并進(jìn)行HE染色,顯微鏡下觀察野生型與AKR7A5基因敲除型小鼠組織形態(tài)差異并拍照保存。

1.2.4 精子活力測(cè)定 取野生型和AKR7A5基因敲除型雄性小鼠各6只,斷頸處死,將附睪迅速放進(jìn)1 mL預(yù)熱的磷酸緩沖鹽溶液中,用眼科剪將附睪尾部剪成幾段,37 ℃孵育10 min。吸取10 μL含小鼠精子的PBS溶液,采用計(jì)算機(jī)輔助精子分析儀分析精子的濃度和運(yùn)動(dòng)參數(shù)。

1.2.5 生育力測(cè)定 將3只AKR7A5基因敲除型雄性小鼠(2.5月齡)、3只野生型雄性小鼠(2.5月齡)分別與生育力正常的成年野生型雌性小鼠交配,按照雄性∶雌性=1∶3的比例合籠。記錄4個(gè)月的總產(chǎn)仔數(shù)、每窩產(chǎn)仔數(shù)及窩數(shù)以進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本研究數(shù)據(jù)利用SPSS ver.21軟件,采用單因素方差分析方法處理,統(tǒng)計(jì)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。當(dāng)P<0.05,P<0.01表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠基因型鑒定結(jié)果

提取鼠尾DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。A、B、C、D、E為AKR7A5基因敲除雜合型小鼠合籠所生子代小鼠,其中小鼠C只出現(xiàn)一條約742 bp的條帶,為野生型;小鼠D、E只出現(xiàn)一條約573 bp的條帶,為AKR7A5基因敲除型;小鼠A、B出現(xiàn)約573 bp和742 bp的兩條帶,為雜合型。

M為DL 2000 Marker;泳道1、3、5以F1-R1為引物擴(kuò)增,泳道2、4、6以F2-R2為引物擴(kuò)增。

2.2 小鼠睪丸、附睪系數(shù)

飼養(yǎng)過(guò)程中AKR7A5基因敲除型小鼠的毛發(fā)、精神和活動(dòng)量等生活狀態(tài)良好。分別選取野生型和AKR7A5基因敲除型2種基因型雄性小鼠各6只,各組小鼠睪丸和附睪系數(shù)見(jiàn)表1,AKR7A5基因敲除型小鼠睪丸、附睪系數(shù)與野生型小鼠相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 小鼠睪丸、附睪系數(shù)

2.3 睪丸、附睪切片

為了進(jìn)一步確證AKR7A5基因敲除對(duì)小鼠睪丸與附睪組織發(fā)育的影響,利用組織病理切片 HE染色技術(shù),觀察分析2組基因型雄性小鼠的睪丸與附睪組織形態(tài)(圖2)。結(jié)果顯示野生型和AKR7A5基因敲除型雄性小鼠睪丸組織曲細(xì)精管均結(jié)構(gòu)清晰,管壁基膜完整,各級(jí)生精細(xì)胞排列緊密規(guī)則,兩者無(wú)明顯差異(圖2(a)、2(d))。兩種基因型小鼠附睪頭和附睪尾的生精小管結(jié)構(gòu)均正常,附睪尾管腔內(nèi)具有成熟精子,但AKR7A5基因敲除型小鼠附睪尾的成熟精子數(shù)量明顯少于野生型小鼠(圖2(b)、(c)、(e)、(f))。

圖2 兩種基因型小鼠睪丸、附睪切片

2.4 精子質(zhì)量分析

與野生型雄性小鼠相比,AKR7A5基因敲除型小鼠的精子濃度、精子直線前游總數(shù)、直線運(yùn)動(dòng)精子、前向運(yùn)動(dòng)精子、平均路徑運(yùn)動(dòng)速度和平均曲線運(yùn)動(dòng)速度數(shù)值均顯著降低(P<0.01);平均直線運(yùn)動(dòng)速度數(shù)值降低(P<0.05);不運(yùn)動(dòng)精子數(shù)值顯著升高(P<0.01);而兩種基因型小鼠精子的非前向運(yùn)動(dòng)精子、平均頭部側(cè)擺幅值、精子平均鞭打頻率、運(yùn)動(dòng)的直線性和運(yùn)動(dòng)的前向性等方面的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

表2 兩種基因型小鼠精子分析情況

2.5 生育力測(cè)定

由表3可見(jiàn),野生型小鼠平均每胎產(chǎn)仔數(shù)為7.97±0.42只,AKR7A5基因敲除型小鼠平均每胎產(chǎn)仔數(shù)為6.27±0.90只。4個(gè)月內(nèi)野生型小鼠和AKR7A5基因敲除型小鼠產(chǎn)仔窩數(shù)相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);4個(gè)月內(nèi)AKR7A5基因敲除型小鼠總產(chǎn)仔數(shù)比野生型小鼠顯著降低(P<0.01)。

表3 生育力測(cè)定結(jié)果

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)AKR7A5基因敲除可影響小鼠成熟精子的數(shù)量和活力、降低總產(chǎn)仔數(shù)[17],即AKR7A5基因?qū)π∈笊尘哂兄匾挠绊憽Ｓ醒芯繄?bào)道精子易受活性氧等氧化代謝產(chǎn)物攻擊,異常增多的活性氧介導(dǎo)氧化應(yīng)激則可引起精子發(fā)生障礙、數(shù)量及活動(dòng)度下降[18-19],AKR7A5酶可以減少活性氧的含量,從而對(duì)氧化應(yīng)激的細(xì)胞有保護(hù)作用[6-7]。推測(cè)AKR7A5基因敲除會(huì)造成生殖系統(tǒng)活性氧增多,引起精子的氧化損傷,進(jìn)而對(duì)生育力造成影響。

對(duì)于小鼠睪丸、附睪系數(shù)以及組織形態(tài),發(fā)現(xiàn)AKR7A5基因敲除型小鼠和野生型小鼠沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。推測(cè)AKR7A5作為AKR超家族的成員之一,其在組織中的功能可被其他成員代償,例如 AKR1B酶[20-22]和AKR1B7酶[23]。

綜上,AKR7A5基因敲除影響小鼠成熟精子的數(shù)量和活力,降低總產(chǎn)仔數(shù)。其潛在的分子機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。