基于TLR4/NF-κB信號(hào)通路探討川膝散對(duì)腎虛血瘀型膝骨性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制

周曉成 ,項(xiàng) 杰,張姚萍,吳良金,孫風(fēng)凡,夏曉斌,穆中杰

(杭州市富陽(yáng)中醫(yī)骨傷醫(yī)院·浙江 杭州 311400)

膝骨性關(guān)節(jié)炎是臨床常見(jiàn)的骨關(guān)節(jié)疾病,早期主要表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)負(fù)重活動(dòng)時(shí)輕微疼痛,隨著疾病的進(jìn)展,出現(xiàn)靜息狀態(tài)下膝關(guān)節(jié)疼痛,甚至膝關(guān)節(jié)畸形、活動(dòng)受限等癥狀,嚴(yán)重影響患者的日常生活[1]。西醫(yī)藥物保守治療主要以抗炎炎鎮(zhèn)痛類藥物、關(guān)節(jié)腔注射等治療為主,難以有效地控制膝骨性關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展,并且存在一定的副作用[2]。中醫(yī)中藥具有安全性高、多靶點(diǎn)治療等優(yōu)勢(shì),在骨傷科疾病的治療中有廣泛的應(yīng)用。膝骨性關(guān)節(jié)炎屬于中醫(yī)“痹證”范疇,老年膝骨性關(guān)節(jié)炎多以腎虛為其本,而痹證日久易致瘀,從而形成腎虛血瘀這一虛實(shí)夾雜之證,臨床上較為常見(jiàn)[3]。川膝散是本院張玉柱主任治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的經(jīng)驗(yàn)方,臨床應(yīng)用療效確切,但其作用機(jī)制尚不明確。本研究將探討川膝散對(duì)腎虛血瘀型膝骨性關(guān)節(jié)炎TLR4/NF-κB信號(hào)通路的影響,為該藥物的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 臨床資料

1.1 一般資料 納入2021年1月—2022年12月至杭州市富陽(yáng)中醫(yī)骨傷醫(yī)院就診的膝骨性關(guān)節(jié)炎患者90 例。應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法將患者分為對(duì)照組和觀察組,每組各45例;其中5例中途主動(dòng)要求退出,3 例不能按規(guī)定治療接受其他治療,3例無(wú)法堅(jiān)持治療,最終共納入79例患者,其中對(duì)照組41例,觀察組38例,組間一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,具有可比性(P>0.05),見(jiàn)表1。本研究經(jīng)過(guò)杭州市富陽(yáng)中醫(yī)骨傷醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(廳浙中2020-02A號(hào))。

表1 兩組患者一般資料比較

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)骨科學(xué)分會(huì)關(guān)節(jié)外科學(xué)組制訂的《骨關(guān)節(jié)炎診療指南(2018版)》[4],并根據(jù)Kellgren-lawrence 分級(jí)[5]對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)行分級(jí)。中醫(yī)證候診斷依據(jù)《中醫(yī)骨傷科臨床診療指南·膝痹病(膝骨關(guān)節(jié)炎)》[6]中腎虛血瘀證標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) 1)符合膝骨性關(guān)節(jié)炎診斷標(biāo)準(zhǔn)且Kellgren-lawrence 分級(jí)為I、II 級(jí);2)VAS疼痛評(píng)分≥4 分;3)中醫(yī)證候?yàn)槟I虛血瘀型;4)年齡60～70 歲;5)簽署知情同意書(shū)。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) 1)類風(fēng)濕、痛風(fēng)、感染等其他疾病引起的膝關(guān)節(jié)炎;2)肢體畸形;3)存在神經(jīng)系統(tǒng)疾病;4)既往膝關(guān)節(jié)手術(shù)史。

1.5 剔除及脫漏標(biāo)準(zhǔn) 1)未按規(guī)定治療,無(wú)法判斷療效者;2)資料不全者;3)無(wú)法堅(jiān)持治療者;4)主動(dòng)要求退出者。

2 方法

2.1 治療方法 對(duì)照組：由專門醫(yī)生對(duì)患者進(jìn)行坐位股四頭肌非負(fù)重訓(xùn)練的指導(dǎo),每日訓(xùn)練3組,每組鍛煉20次;應(yīng)用氟比洛芬凝膠貼膏(北京泰德制藥股份有限公司;批號(hào)：J20160090;規(guī)格：40 mg/貼×6 貼)外用,每日2次;口服硫酸氨基葡萄糖(浙江海正藥業(yè)股份有限公司;批號(hào)：H20041316;規(guī)格：0.314 g×12?！?板),2粒/次,每日3次。觀察組：在對(duì)照組基礎(chǔ)上予以內(nèi)服川膝散(川牛膝15 g、桃仁10 g、紅花6 g、當(dāng)歸10 g、赤芍12 g、生地15 g、防己10 g、延胡索10 g、澤蘭10 g、黃柏8 g、赤小豆25 g組成),并辨證加減：腎陽(yáng)虛加鹿角片10 g、補(bǔ)骨脂10 g;腎陰虛加龜甲10 g、枸杞12 g、女貞子12 g;血虛加阿膠10 g、熟地15 g、制首烏15 g;氣虛加黃芪25 g、黨參15 g;脾虛加黨參15 g、白術(shù)15 g、炙甘草6 g;納差加雞內(nèi)金9 g、焦三仙15 g;每日1 劑,每劑2 煎,均由本院煎藥房統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)煎制,分2次口服,共服用4 周。

2.2 觀察指標(biāo)及檢測(cè)

2.2.1 膝關(guān)節(jié)疼痛評(píng)分 治療前和治療1個(gè)月后采用視覺(jué)模擬評(píng)分法(visual analogue scale,VAS)[7]評(píng)估,分值為0～10 分,0 分表示無(wú)痛,10分表示疼痛劇烈。

2.2.2 膝關(guān)節(jié)功能評(píng)分 治療前和治療1 個(gè)月后采用JOA評(píng)分[8]及WOMAC骨關(guān)節(jié)炎指數(shù)[9]評(píng)價(jià)。JOA評(píng)分包括步行疼痛、爬樓梯疼痛感、膝關(guān)節(jié)屈曲活動(dòng)度及腫脹4 個(gè)部分,總分為100 分,分值越高代表膝關(guān)節(jié)功能越好。WOMAC骨關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分由疼痛、僵硬程度、關(guān)節(jié)功能3 個(gè)部分組成,共28 個(gè)項(xiàng)目,分值越高表示膝關(guān)節(jié)功能越差。

2.2.3 血清TLR4、NF-κB p65、IL-1b、TNF-α檢測(cè) 治療前和治療1個(gè)月后采取患者清晨空腹靜脈血5 mL,以200 g離心力離心10 min,收集血清,采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清TLR4、NF-κB p65、IL-1b、TNF-α水平,試劑盒購(gòu)自上海達(dá)科為生物技術(shù)有限公司。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料經(jīng)過(guò)正態(tài)分布檢驗(yàn)符合正態(tài)分布,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),組內(nèi)比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 兩組患者治療前后膝關(guān)節(jié)疼痛和功能評(píng)分比較 見(jiàn)表2。

表2 兩組患者治療前后疼痛VAS、JOA及WOMAC評(píng)分比較分)

3.3 兩組患者治療前后TLR4/NF-κB 信號(hào)通路及炎癥指標(biāo)比較 見(jiàn)表3～表4。

表3 兩組患者治療前后血清TLR4、NF-κB p65比較

表4 兩組患者治療前后血清IL-1b、TNF-α水平比較

4 討論

隨著我國(guó)人口老齡化的加劇,膝骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病率逐年上升,已成為老年人群就診最為常見(jiàn)的骨關(guān)節(jié)疾病。根據(jù)膝骨性關(guān)節(jié)炎的臨床表現(xiàn)可歸屬于祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)“痹證”范疇。中老年患者腎氣漸衰,先天之精匱乏無(wú)源,而腎主骨生髓,骨骼缺乏濡養(yǎng),同時(shí)腎精不足,正氣虧虛,易外感風(fēng)、寒、濕外邪,閉阻于內(nèi),日久阻礙經(jīng)脈氣血的運(yùn)行而致瘀,腎虛與血瘀互為交雜,相互影響,導(dǎo)致疾病遷延不愈,故治療上應(yīng)兼顧補(bǔ)腎益精和化瘀通絡(luò)[10]。有學(xué)者在臨床上應(yīng)用補(bǔ)腎活血類中藥治療腎虛血瘀型膝骨性關(guān)節(jié)炎患者,發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎活血類中藥可以起到減輕疼痛、改善膝關(guān)節(jié)功能的功效[11-12]。

本研究所應(yīng)用的川膝散為國(guó)家非物質(zhì)文化遺產(chǎn)項(xiàng)目“張氏骨傷診療技術(shù)”代表性傳承人張玉柱主任經(jīng)驗(yàn)方。方中川牛膝逐瘀通經(jīng)兼顧補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨;桃仁、紅花、延胡索活血化瘀止痛;當(dāng)歸行血補(bǔ)血;赤芍、生地清熱涼血兼養(yǎng)陰生津;黃柏以瀉火除蒸、解毒;防己、澤蘭、赤小豆以行氣利水為主,輔助活血,水行則血暢,增強(qiáng)活血功能[13]。研究結(jié)果顯示川膝散治療腎虛血瘀型膝骨性關(guān)節(jié)炎患者在治療1個(gè)月后膝關(guān)節(jié)疼痛VAS評(píng)分低于對(duì)照組,前者的JOA評(píng)分高于對(duì)照組,WOMAC評(píng)分低于對(duì)照組;表明川膝散能有效緩解腎虛血瘀型膝骨性關(guān)節(jié)炎患者疼痛,改善膝關(guān)節(jié)的功能。

目前較為公認(rèn)的膝骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制是關(guān)節(jié)內(nèi)機(jī)械損傷和慢性炎癥相互作用的結(jié)果[14]。固有免疫系統(tǒng)的激活是引起關(guān)節(jié)內(nèi)持續(xù)無(wú)菌性低度炎癥反應(yīng)的重要原因。Toll樣受體(Toll like receptors,TLRs)是固有免疫反應(yīng)中重要的一組跨膜分子,不僅參與了病原體相關(guān)分子模式蛋白的識(shí)別,其中部分TLRs還參與了損傷相關(guān)分子模式DAMPs蛋白的識(shí)別,TLRs與相關(guān)分子結(jié)合后能夠激活下游NF-κB信號(hào)通路,誘導(dǎo)TNF-α、IL-6等促炎因子的釋放;而關(guān)節(jié)內(nèi)損傷的軟骨碎片會(huì)被分解為纖維連接蛋白、透明質(zhì)酸、二聚糖等物質(zhì),這些分解物能夠與TLRs結(jié)合,從而激活固有免疫反應(yīng),誘發(fā)關(guān)節(jié)內(nèi)的炎癥反應(yīng),促炎因子的增多會(huì)促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶的分泌,抑制膠原蛋白和蛋白聚糖的合成,促進(jìn)軟骨分解,限制軟骨自我修復(fù)能力,導(dǎo)致關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨進(jìn)一步損傷[15]。在膝骨性關(guān)節(jié)炎模型來(lái)源的軟骨和滑膜中均發(fā)現(xiàn)TLR4表達(dá)顯著升高[15-16],相比其他模式識(shí)別受體,TLR4對(duì)DAMPs蛋白的識(shí)別更為敏感,這使得其更容易識(shí)別損傷軟骨所分解的物質(zhì),誘發(fā)下游通路的激活[17]。RNA結(jié)合蛋白PUM1可以與TLR4的3’端非編碼區(qū)結(jié)合,抑制TLR4 mRNA轉(zhuǎn)錄,Yoon DS等[18]通過(guò)過(guò)表達(dá)PUM1,抑制TLR4的合成,從而降低NF-κB的活性,保護(hù)細(xì)胞免受炎癥介導(dǎo)的軟骨形成表型的破壞。在IL-1β過(guò)表達(dá)的情況下,TLR4敲除的模型鼠軟骨損傷程度和滑膜炎癥均要弱于野生型鼠[19]。因此,TLR4對(duì)膝骨性關(guān)節(jié)炎固有免疫反應(yīng)的激活具有重要意義。既往研究顯示補(bǔ)腎活血類中藥具有抑制炎癥的作用[20-21],本研究結(jié)果顯示,川膝散治療的腎虛血瘀型膝骨性關(guān)節(jié)炎患者血清TLR4、NF-κB p65的表達(dá)相比對(duì)照組降低更明顯,并且血清促炎因子IL-1b和TNF-α的含量也低于對(duì)照組;提示川膝散治療腎虛血瘀型膝骨性關(guān)節(jié)炎的部分機(jī)制是通過(guò)抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路的激活,減少促炎因子的釋放,從而起到減輕疼痛癥狀,改善患者膝關(guān)節(jié)功能的作用。

綜上所述, 川膝散治療可以調(diào)節(jié)TLR4/NF-κB信號(hào)通路,減少炎癥因子產(chǎn)生,起到治療腎虛血瘀型膝骨性關(guān)節(jié)炎的作用。