青稞蛋白降血糖肽的純化、結(jié)構(gòu)鑒定及體外降血糖和抗氧化活性

陶 瑾, 張莉方, 徐寧莉, 朱雪洋, 張國(guó)強(qiáng)

(安徽工程大學(xué)生物與食品工程學(xué)院,蕪湖 241000)

青稞(HordeumvulgareL. var. nudum Hook. f.),屬禾本科大麥屬谷物,種植歷史悠久,是藏區(qū)居民主要食糧和重要農(nóng)產(chǎn)品加工原料[1]。青稞主要分布于青藏高原裸大麥區(qū),一年一熟制,具有耐寒性強(qiáng)、生育期短、適應(yīng)性廣、產(chǎn)量穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)[2,3]。青稞含有較高的蛋白質(zhì)和不飽和脂肪酸,而且賴氨酸和色氨酸含量較其他谷物相比更高,“三高兩低” 即高蛋白、高膳食、高維生素和低糖、低脂的膳食結(jié)構(gòu)被當(dāng)代健康生活飲食所提倡[4]。研究表明,飲食中長(zhǎng)期添加大麥粉可以對(duì)高脂血癥、糖尿病和動(dòng)脈硬化起到一定的預(yù)防作用[5,6]。目前對(duì)于青稞中的β-葡聚糖[7]、酚類(lèi)、黃酮類(lèi)[8]和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸[9]研究較多。青稞的價(jià)值隨著科技的發(fā)展在不斷被挖掘,其應(yīng)用范圍也將擴(kuò)大。然而,關(guān)于從青稞中提取具有降血糖活性肽的報(bào)道不多。

近年來(lái),因?yàn)殡木哂薪Y(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、活性高、生物友好性等優(yōu)點(diǎn)[10],食源性生物活性肽研究數(shù)量的顯著增加[11]?？梢酝ㄟ^(guò)酶、化學(xué)和微生物水解的方法來(lái)制備生物活性肽,其中酶水解是最為有效和經(jīng)濟(jì)的方法[12]。特定的蛋白酶有獨(dú)特的酶切位點(diǎn),使蛋白質(zhì)水解具有可預(yù)測(cè)性。由于肽結(jié)構(gòu)的激素樣特性或作為拮抗受體抑制劑的作用,可以發(fā)揮它們的生物活性,并且其生物活性主要是受到特定氨基酸序列的影響[13,14]。天然活性肽較合成降血糖和抗氧化劑相比,具有安全、無(wú)毒害的優(yōu)勢(shì)。多項(xiàng)研究已成功在動(dòng)植物中分離和鑒定出具有降血糖活性的肽[15]。Shibu等[16]通過(guò)堿性蛋白酶水解馬鈴薯蛋白制備具有降血糖活性的馬鈴薯蛋白多肽(肽序列:DIKTNKPVIF),通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證十肽可調(diào)節(jié)小鼠血糖、控制了血漿總甘油、總膽固醇、胰島素和糖化血紅蛋白水平,有益于改善胰島和肝、心、腎組織損害。Gu等[17]通過(guò)木瓜蛋白酶水解小米蛋白分離出具有降血糖活性的小米蛋白多肽(肽序列:AATHTGPLS、TTPHGGPPILT),分子對(duì)接表明,2種多肽均可通過(guò)氫鍵和π-π占據(jù)DPP-IV的活性中心。胡宇航等[18]等通過(guò)堿性蛋白酶水解玉米蛋白獲得具有α-糖苷酶抑制活性的玉米蛋白多肽(肽序列:APALLPF),通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證玉米蛋白多肽能抑制HepG2細(xì)胞(人體肝癌細(xì)胞)生物活性,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

因此,植物蛋白擁有降血糖的潛力,綜合青稞具有的降血糖功效,研究以青稞蛋白(藏青2000)為原料,探究青稞蛋白水解物的降血糖和抗氧化活性。通過(guò)評(píng)估α-葡萄糖苷酶抑制力和水解度篩選蛋白酶,確定酶解最佳工藝條件。然后以α-葡萄糖苷酶抑制活性為指標(biāo)通過(guò)超濾和Sephadex G-15對(duì)粗肽分級(jí)純化,測(cè)定其抗氧化、降血糖活性。純化后活性最高的組分通過(guò)多肽測(cè)序進(jìn)行進(jìn)一步分析。研究旨在深入了解青稞肽的降血糖和抗氧化能力,并為未來(lái)具有降血糖功能的食品或藥品開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青稞蛋白:堿溶酸沉法制備;木瓜蛋白酶(2.0×105U/g)、菠蘿蛋白酶(3.0×105U/g)、胰蛋白酶(1.3×105U/g)、中性蛋白酶(1.0×105U/g)、酸性蛋白酶(7.0×105U/g)、堿性蛋白酶(2.0×105U/g)、ABTS、DPPH、α-葡萄糖苷酶、4-硝基苯基-α-D-呋喃葡萄糖苷(pNPG)、α-淀粉酶(枯草桿菌)、葡聚糖凝膠G-15、3,5-二硝基水楊酸、碳酸鈉、38%甲醛水溶液、酒石酸鉀鈉,試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PHSJ-5雷磁pH計(jì),LGJ-10真空冷凍干燥機(jī),超濾離心管(3、10、30 ku),SPECTRAMAX M5酶標(biāo)儀,HL-1S恒流泵,BSZ-100型自動(dòng)收集器,UV- 5200紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),Thermo EASY nLC液相色譜儀、Thermo Orbitrap Fusion Lumos質(zhì)譜儀。

1.3 方法

1.3.1 蛋白酶的篩選

選取胰蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶,底物質(zhì)量濃度取2 g/100 mL,加酶量取10 000 U/g,分別在各自最適酶解溫度、最適pH的條件下,酶解4 h[19],選定α-葡萄糖苷酶抑制活性為主要測(cè)定指標(biāo),選定水解度為輔助參考指標(biāo),考察各蛋白酶酶解物的降血糖活性,確定最適蛋白酶。水解度(degree of hydrolysis,DH)的測(cè)定采用甲醛滴定法[20]進(jìn)行測(cè)定,DH計(jì)算中氮含量采用GB/T 5009.5—2016 《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》測(cè)定。

1.3.2 酶解條件的確定及優(yōu)化

取青稞蛋白以超純水溶解,調(diào)節(jié)pH,加入選定最適蛋白酶,恒溫且不停攪拌一段時(shí)間,酶解過(guò)程中保持溶液pH恒定,酶解結(jié)束后,在100 ℃水浴15 min滅酶,4 000 r/min的條件下離心15 min,取上清液即為青稞粗肽?？疾煸诘孜镔|(zhì)量濃度(1、2、3、4、5 g/100 mL),加酶量(6 000、8 000、10 000、12 000、14 000 U/g),酶解時(shí)間(1、2、3、4、5、6 h)和酶解溫度(30、40、50、60、70 ℃)條件下,以α-葡萄糖苷酶抑制活性為指標(biāo)的降血糖活性。在此基礎(chǔ)上,通過(guò)Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化,選定自變量為底物濃度(A)、加酶量(B)、酶解時(shí)間(C),α-葡萄糖苷酶抑制率為相應(yīng)值,響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)因素水平表

1.3.3 體外降血糖活性的測(cè)定

1.3.3.1 α-葡萄糖苷酶抑制活性測(cè)定

依次取20 μL樣品,50 μL PBS(0.2 mol/L,pH 6.8)和50 μL pNPG(1 mg/mL)溶液加入96孔酶標(biāo)板, 37 ℃反應(yīng)10 min,再加入50 μL α-葡萄糖苷酶,在37 ℃中反應(yīng)30 min,最后添加80 μL Na2CO3(0.2 mol/L)終止反應(yīng),并在405 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值[21]。

(1)

式中:A0為對(duì)照組吸光度;A1為樣品組吸光度;A2為背景組吸光度。

1.3.3.2 α-淀粉酶抑制活性測(cè)定

取50 μL樣品和50 μL α-淀粉酶加入5 mL離心管,37 ℃反應(yīng)10 min,后加入150 μL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的淀粉溶液,37 ℃反應(yīng)10 min,最后加入200 μL DNS試劑,沸水浴5 min終止反應(yīng),冷卻后稀釋至3 mL在540 nm處測(cè)定吸光度值[22]。計(jì)算同式(1)。

1.3.4 體外抗氧化活性的測(cè)定

1.3.4.1 ABTS+自由基清除率測(cè)定

ABTS+工作液的配制參考文獻(xiàn)[23]。在96孔酶標(biāo)板中加入50 μL樣品和200 μL ABTS+溶液混勻靜置10 min,于734 nm處測(cè)定吸光值。計(jì)算同式(1)。

1.3.4.2 DPPH自由基清除率測(cè)定

取樣品1 mL和0.2 mmol/L DPPH 2 mL于比色管,混勻,室溫下避光反應(yīng)30 min,在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值[24]。計(jì)算同式(1)。

1.3.5 青稞降血糖肽的分離純化

1.3.5.1 超濾分級(jí)

將青稞粗肽酶解液依次通過(guò)30、10、3 ku的超濾離心管,離心條件為3 000 g,30 min。收集各截留液和過(guò)濾液可得4個(gè)組分分別為:>30 ku(E-1)、10～30 ku(E-2)、3～10 ku(E-3)和<3 ku(E-4)。冷凍干燥后測(cè)定4個(gè)組分的抗氧化、降血糖活性。

1.3.5.2 凝膠分離純化

選定Sephadex G-15凝膠分離青稞小分子質(zhì)量粗肽。將經(jīng)過(guò)預(yù)處理的Sephadex G-15凝膠裝入層析柱(2 cm×6 cm)中,樣品溶液(20 mg/mL)經(jīng)0.22 μm 濾膜處理后,上樣量為1 mL,以超純水洗脫,流速為0.5 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為214 nm,按出峰情況收集各個(gè)峰洗脫液并進(jìn)行冷凍干燥[25],測(cè)定各個(gè)組分體外降血糖及抗氧化活性,將降血糖活性最強(qiáng)的組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

1.3.6 降血糖肽結(jié)構(gòu)鑒定

使用液質(zhì)聯(lián)用LC-MS鑒定肽結(jié)構(gòu)。首先將E-4用20 μL溶解液(體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸、5%乙腈)溶解,充分振蕩渦旋,14 000 r/min,4 ℃離心20 min,上清液轉(zhuǎn)移到上樣管中,吸取8 μL液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)。流動(dòng)相A為0.1%甲酸(體積分?jǐn)?shù)),流動(dòng)相B為0.1%甲酸、80%ACN(體積分?jǐn)?shù))。梯度洗脫條件:0～7 min,VA∶VB=97∶3;7～46 min,VA∶VB=92∶8;46～51 min,VA∶VB=68∶32;51～56 min,VA∶VB=56∶54;56～60 min,VA∶VB=1∶99。質(zhì)譜參數(shù):分析時(shí)長(zhǎng)60 min,一級(jí)質(zhì)譜質(zhì)核比掃描范圍50 ～1 550m/z,分辨率為12×104,自動(dòng)增益控制(AGC)4e5,最大進(jìn)樣時(shí)間50 ms;二級(jí)質(zhì)譜分辨率 3×104,最大進(jìn)樣時(shí)間100 ms,自動(dòng)增益控制(AGC)1e5,分離窗口m/z,TopN: 20,NCE/stepped NCE: 32。采用PEAKS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用Design Expert 11.0中的Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化酶解條件,Origin 2021和 SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)和作圖;采用Duncan和ANOVA法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

由于不同蛋白酶的酶切位點(diǎn)及作用方式不同,對(duì)其生物活性大小也有影響[26]。由圖1可知,不同蛋白酶水解產(chǎn)物對(duì)水解度和α-葡萄糖苷酶抑制活性均有差異,其中胰蛋白酶水解產(chǎn)物的水解度(達(dá)24.25%)和α-葡萄糖苷酶抑制活性(達(dá)61.63%)最高,顯著高于其他蛋白酶(P<0.05)。其次為堿性蛋白酶,中性蛋白酶水解效果最差且α-葡萄糖苷酶抑制活性最低。研究表明,降血糖活性水解效果好的酶主要集中在胰蛋白酶和胃蛋白酶、堿性蛋白酶中[27]。馮俊[28]通過(guò)堿性蛋白酶水解茶籽粕蛋白,水解度最高的組分其α-葡萄糖苷酶抑制活性也是最佳的。實(shí)驗(yàn)表明水解度與α-葡萄糖苷酶抑制活性有一定相關(guān)性,根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選定胰蛋白酶進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同蛋白酶水解產(chǎn)物的α-葡萄糖苷酶抑制率和水解度

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖2可知,底物濃度對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響最大,底物質(zhì)量濃度在3 g/100 mL達(dá)到最大,呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),說(shuō)明增加一定的底物濃度有利于獲得較高α-葡萄糖苷酶抑制活性的肽。其次的影響因素為酶解時(shí)間,3 h后,酶作用于酶切位點(diǎn),肽鏈長(zhǎng)度縮短,氨基酸組成改變,從而使得抑制率明顯降低[29],隨著酶解時(shí)間到4 h后,α-葡萄糖苷酶抑制活性趨于穩(wěn)定略有下降,可能的原因?yàn)榈鞍妆贿^(guò)度水解為短肽降低了α-葡萄糖苷酶抑制活性。底物濃度固定后,隨著加酶量的增加,酶解程度增加,α-葡萄糖苷酶抑制活性也相應(yīng)增加,在添加量達(dá)10 000 U/g后趨勢(shì)變緩。當(dāng)酶解達(dá)到飽和狀態(tài)時(shí)反應(yīng)速率由底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)決定,繼續(xù)增加酶量對(duì)水解度的影響不大[30]。酶解溫度在35 ℃時(shí),α-葡萄糖苷酶抑制活性最高,整體隨酶解溫度的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),在酶的最適溫度范圍附近,酶解效率越高,高溫會(huì)破壞蛋白酶的結(jié)構(gòu)從而降低水解效率[31]。

圖2 單因素對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響

2.3 響應(yīng)面分析結(jié)果

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

由表3可知,AB、BC兩兩因素具有交互作用(P<0.05),AC兩兩因素間差異不顯著(P>0.5)。軟件分析得出最佳酶解工藝參數(shù)為:底物質(zhì)量濃度為2.903 g/100 mL、加酶量為12 291 U/g、酶解時(shí)間為5.093 h,此條件下,α-葡萄糖苷酶抑制活性為70.88%,根據(jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)情況,將制備工藝參數(shù)修正為底物質(zhì)量濃度為3 g/100 mL、加酶量為12 000 U/g、酶解時(shí)間為5 h,在此條件下做3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),α-葡萄糖苷酶抑制活性為70.96%,與模型預(yù)測(cè)值基本一致,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案可行。

2.4 超濾分級(jí)

采用胰蛋白酶進(jìn)行青稞蛋白水解,水解液依次通過(guò)裝有截留分子質(zhì)量為 3、10、30 ku 的超濾離心管后,分離可得分子質(zhì)量分別為>30、10～30、3～10、<3 ku的4種不同分子質(zhì)量段的超濾組分并對(duì)其命名。超濾后的各組分均具有抗氧化和降血糖活性,4個(gè)組分降血糖及抗氧化能力見(jiàn)表4。分級(jí)后的水解產(chǎn)物有顯著差異(P<0.05)。降血糖活性中,E-4的α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性顯著高于其他組分(P<0.05),為(1.790±0.066)、(15.21±0.096)mg/mL;抗氧化活性中,E-4對(duì)ABTS和DPPH自由基的能力也顯著高于其他組(P<0.05),達(dá)(5.120±0.082)、(8.070±0.057)mg/mL。此結(jié)果與趙婉宏等[32]得到超濾后最小的組分具有最好的降血糖活性和抗氧化活性,對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率最高,對(duì)DPPH、羥自由基清除能力和還原力也遠(yuǎn)高于其他超濾組分的結(jié)果一致。張一帆等[33]對(duì)楊梅蛋白水解液超濾得到具有良好的抗氧化和α-葡糖糖苷酶抑制活性的最佳分子質(zhì)量段為<5 ku。蘆鑫等[34]研究表明,芝麻蛋白水解物顯示出較強(qiáng)的抗氧化活性的組分也為低分子質(zhì)量組。這些肽具有較強(qiáng)生物活性可能歸因于其低分子質(zhì)量,因此選定分子質(zhì)量<3 ku的E-4組分為下一步分離對(duì)象。

2.5 凝膠分離

圖3 Sephadex G-15分離圖譜

圖4 青稞蛋白多肽的二級(jí)質(zhì)譜圖

表5 凝膠分離組分的降血糖及抗氧化活性

2.6 質(zhì)譜鑒定

通過(guò)LC-MS/MS測(cè)定和對(duì)比數(shù)據(jù)庫(kù)檢索,可得2條八肽,氨基酸序列為GFSGSGGK,即甘氨酸(Gly)-苯丙氨酸(Phe)-絲氨酸(Ser)-甘氨酸(Gly)-絲氨酸(Ser)-甘氨酸(Gly)-甘氨酸(Gly)-賴氨酸(Lys),分子質(zhì)量分別為695.32 u,荷質(zhì)比m/z為348.67;氨基酸序列為GVGAGAAR即甘氨酸(Gly)-纈氨酸(Val)-甘氨酸(Gly)-丙氨酸(Ala)-甘氨酸(Gly)-丙氨酸(Ala)-丙氨酸(Ala)-精氨酸(Arg),分子質(zhì)量分別為657.36 u,荷質(zhì)比m/z為329.68。2條肽鏈均由親水、疏水和堿性氨基酸組成,其N(xiāo)端為親水氨基酸且C端為堿性氨基酸。Famuwagun等[36]研究發(fā)現(xiàn)對(duì)堿性蛋白酶水解茄子葉蛋白中α-淀粉酶抑制活性最好的肽段氨基酸序列含有堿性、疏水堿性氨基酸結(jié)構(gòu)。Li等[37]以胃蛋白酶和胰蛋白酶水解小球藻中分離出具有DPP-IV抑制活性的多肽結(jié)構(gòu)末端氨基酸為堿性氨基酸。Fernando等[38]以枯草桿菌蛋白酶-胰蛋白酶-風(fēng)味酶三酶復(fù)合水解沙丁魚(yú)毛囊蛋白分離出2條六肽氨基酸,其序列N端為親水氨基酸,C端為堿性氨基酸。因此,推測(cè)青稞蛋白多肽的降血糖活性可能與氨基酸序列的組成有關(guān)。

3 結(jié)論

研究篩選出胰蛋白酶為最適蛋白酶水解青稞蛋白,確定青稞蛋白水解最佳工藝條件為底物質(zhì)量濃度為3 g/100 mL、加酶量為12 000 U/g、酶解時(shí)間為5 h。將酶解后的粗肽通過(guò)超濾和Sephadex G-15柱分離純化得到具有較高生物活性的目標(biāo)蛋白肽。最佳組分E-43的α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制活性抑制能力、ABTS和DPPH自由基清除能力的IC50分別為0.26、6.74、2.62、4.23 mg/mL。質(zhì)譜測(cè)得活性肽氨基酸序列為:Gly-Phe-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly-Lys、Gly-Val-Gly-Ala-Gly-Ala-Ala-Arg,荷質(zhì)比m/z為348.67、329.68,分子質(zhì)量為695.32、657.36 u。2條八肽的氨基酸序列N端均為親水氨基酸,C端均為堿性氨基酸。通過(guò)將氨基酸序列與現(xiàn)有研究中具有降血糖活性的氨基酸序列比較推斷其較強(qiáng)的降血糖能力可能與氨基酸組成有關(guān)。證明了青稞蛋白肽具有潛在藥理價(jià)值。