基于繆勒矩陣顯微圖像的微塑料和微藻分類(lèi)

盧小剛，崔煒，熊志航,3，張華峰，廖然

(1.長(zhǎng)江大學(xué) 物理與光電工程學(xué)院，湖北 荊州 434023；2.清華大學(xué)深圳國(guó)際研究生院，廣東 深圳 518055；3.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院 物理與光電工程學(xué)院，廣東 佛山 528231)

水環(huán)境安全日益受到人們重視.由微塑料造成的環(huán)境污染成為人們關(guān)注的新熱點(diǎn).微塑料通常是指粒徑小于5 mm 的塑料制品或塑料碎屑[1]；它在環(huán)境中的殘留濃度高且容易被生物攝入，對(duì)生物體的健康構(gòu)成潛在威脅[2].我國(guó)水體中微塑料污染問(wèn)題比較嚴(yán)重，部分水體中檢測(cè)到的微塑料濃度較高[3].微藻是水生態(tài)系統(tǒng)的主要初級(jí)生產(chǎn)者，在水生食物網(wǎng)的物質(zhì)轉(zhuǎn)移和能量流動(dòng)中發(fā)揮著重要作用[4].微藻在食品生產(chǎn)、醫(yī)藥研究、生物能源等領(lǐng)域具有很大的商業(yè)價(jià)值[5].有害微藻過(guò)度增殖會(huì)引發(fā)水華，導(dǎo)致水中魚(yú)類(lèi)中毒甚至死亡，嚴(yán)重污染水環(huán)境[6].

探測(cè)微塑料、微藻是水資源開(kāi)發(fā)和水環(huán)境污染監(jiān)測(cè)的重要組成部分.光學(xué)探測(cè)方法具有無(wú)損傷、非接觸、信息量大等優(yōu)勢(shì)[7]，多種光學(xué)儀器被用于原位監(jiān)測(cè)水體懸浮顆粒物的變化.激光粒度儀LISST-200X 基于激光前向散射原理，用于測(cè)量水體前向散射小角度分布，可獲取顆粒物的粒徑分布和濃度[8].吸收系數(shù)和衰減系數(shù)是水體固有光學(xué)量，水體吸收-衰減測(cè)量?jī)xAC-S 能同時(shí)測(cè)量這2 個(gè)系數(shù)，為水體顆粒物分析和水色遙感提供基礎(chǔ)參數(shù)[9].濁度計(jì)通過(guò)測(cè)量懸浮顆粒物的散射光測(cè)量水體濁度，水體濁度常用于評(píng)估懸浮顆粒物濃度[10].以上光學(xué)儀器進(jìn)行的是水中大量顆粒物的統(tǒng)計(jì)測(cè)量，難以對(duì)顆粒物細(xì)致分類(lèi).光學(xué)顯微鏡通過(guò)觀察顆粒物大小、顏色、形態(tài)等特征對(duì)顆粒物進(jìn)行分類(lèi)，是微藻、微塑料觀察和鑒定的常用儀器[11].普通光學(xué)顯微鏡在識(shí)別某些形態(tài)特征相似的微藻或微塑料時(shí)，不僅準(zhǔn)確度較低[12]，而且分析過(guò)程耗時(shí)，鑒定種類(lèi)需要專(zhuān)業(yè)分類(lèi)學(xué)家在觀察大量相關(guān)圖集的基礎(chǔ)上，通過(guò)觀察顆粒物的形態(tài)特征進(jìn)行分類(lèi)鑒定[13].流式細(xì)胞儀通過(guò)流體動(dòng)力學(xué)液流系統(tǒng)，讓顆粒物依次通過(guò)探測(cè)區(qū)域，測(cè)量單個(gè)顆粒物的散射光強(qiáng)和熒光強(qiáng)度，據(jù)此對(duì)顆粒物進(jìn)行分類(lèi)[14].由于自然水體中顆粒物的種類(lèi)復(fù)雜、形態(tài)差異大且粒徑分布廣，導(dǎo)致液流系統(tǒng)容易堵塞，影響了流式細(xì)胞儀的廣泛使用[15].偏振是光的基本屬性[16].用偏振光照射顆粒物后，出射光的偏振態(tài)對(duì)顆粒物的微觀結(jié)構(gòu)尤為敏感.偏振光技術(shù)能夠兼容傳統(tǒng)的非偏振光學(xué)儀器，在傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡上添加偏振器件可以構(gòu)成繆勒矩陣顯微鏡，測(cè)量樣品的繆勒矩陣[17].繆勒矩陣表征樣品偏振光學(xué)屬性，如退偏、雙折射和細(xì)微結(jié)構(gòu)取向等[18].Li 等[12]使用繆勒顯微鏡進(jìn)行海藻成像和分類(lèi)，證明了利用繆勒矩陣圖像的分類(lèi)準(zhǔn)確度優(yōu)于光強(qiáng)圖像.Liu 等[19]使用繆勒矩陣顯微鏡進(jìn)行形態(tài)相似的微藻的有效分類(lèi)，實(shí)現(xiàn)了海洋微藻的高通量分類(lèi).此處的通量是指同一視野中同時(shí)測(cè)量的微藻數(shù)量，與流式細(xì)胞儀中定義的通量（單位時(shí)間內(nèi)經(jīng)過(guò)檢測(cè)區(qū)的顆粒物數(shù)量）不同[14,19].繆勒矩陣顯微鏡作為非標(biāo)記、定量化、無(wú)損傷的檢測(cè)工具，在水體顆粒物分類(lèi)領(lǐng)域顯示出了技術(shù)優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用潛力.

本研究使用繆勒矩陣顯微鏡進(jìn)行水中微藻和微塑料的測(cè)量，討論影響分類(lèi)結(jié)果的因素，包括不同顆粒物所在像素的處理方法，顆粒物運(yùn)動(dòng)偽影，繆勒矩陣顯微鏡在不同成像深度的對(duì)焦等.1）以2 種常見(jiàn)微塑料和2 種微藻為樣品，利用繆勒矩陣顯微鏡高通量地測(cè)量大視野范圍內(nèi)所有顆粒物的繆勒矩陣；2）由繆勒矩陣計(jì)算得到的多個(gè)偏振參數(shù)來(lái)表征顆粒物的物理性質(zhì)；3）借助前饋神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的深度學(xué)習(xí)方法對(duì)顆粒物進(jìn)行分類(lèi).

1 繆勒矩陣顯微方法

1.1 實(shí)驗(yàn)原理

光的偏振態(tài)可以采用斯托克斯向量S描述，S=[S0,S1,S2,S3]T，其中S0為 總光強(qiáng)，S1為水平 和垂直線偏振分量的強(qiáng)度差，S2為±45°方向線偏振分量的強(qiáng)度差，S3為右旋與左旋圓偏振分量的強(qiáng)度差[20].當(dāng)照明光穿過(guò)樣品時(shí)，

式中：Sout為透射光的斯托克斯向量；Sin為照明光的斯托克斯向量；M為繆勒矩陣 ，它包含了樣品的所有偏振信息，16 個(gè)陣元可以表征多種偏振效應(yīng)；其中M11為樣品的光強(qiáng)信息，M22、M33為樣品的退偏特征，M12、M13為樣品的二向色性特征，M24、M34、M42和M43為樣品的雙折射特征.通過(guò)改變?nèi)肷涔夂统錾涔獾钠駪B(tài)，求解線性方程組可以得到樣品的繆勒矩陣.根據(jù)定義，至少需要4 次測(cè)量才能得到完整的繆勒矩陣.

繆勒矩陣攜帶顆粒物豐富的微觀結(jié)構(gòu)特征信息，可以完備描述顆粒物偏振光學(xué)性質(zhì)，對(duì)散射顆粒物的光學(xué)性質(zhì)(包括折射率、吸收、雙折射、二向色性等)、形態(tài)(粒徑、形狀、取向、排列、有序度等)和微觀結(jié)構(gòu)(表面形貌、內(nèi)部亞結(jié)構(gòu))都十分敏感，特別是對(duì)亞波長(zhǎng)尺度以下的超光學(xué)分辨結(jié)構(gòu)特征敏感[21].通過(guò)繆勒矩陣分解[22]，可以將繆勒矩陣分解為一組代表明確物理過(guò)程的子矩陣，進(jìn)而獲得一組具有明確物理意義的偏振參數(shù)，即散射退偏、相位延遲、線性相位延遲、二向色性.繆勒矩陣變換[23-24]從特定樣本偏振行為分析出發(fā)，獲得一組具有物理意義的偏振參數(shù)，這些偏振參數(shù)可以提供樣品微觀結(jié)構(gòu)信息.本研究使用的偏振參數(shù)包含有D、t以及b等在內(nèi)的34 個(gè)偏振參數(shù)，它們都是旋轉(zhuǎn)不變量.其中D表示二向色性，t表示各向異性，b為線性相位延遲，其他偏振參數(shù)的含義可參考文獻(xiàn)[21]～[24].

1.2 繆勒矩陣顯微鏡

在商用透射式顯微鏡上添加起偏器（polarization state generator, PSG）模塊和檢偏器（polarization state analyzer, PSA）模塊構(gòu)成繆勒矩陣顯微鏡[17,25]，其結(jié)構(gòu)如圖1 所示.PSG 由固定角度的線偏振片P1 和可旋轉(zhuǎn)的四分之一波片R1 構(gòu)成.R1安裝在電動(dòng)旋轉(zhuǎn)平臺(tái)上，旋轉(zhuǎn)R1 的角度可以得到不同偏振態(tài)的照明光.PSA 由2 個(gè)基于焦平面劃分的線偏振相機(jī)（DoFP CCD）、1 個(gè)50∶50 非偏振分光棱鏡和1 個(gè)固定角度的四分之一波片R2 構(gòu)成.穿過(guò)樣品的透射光被非偏振分光棱鏡分成2 份，一份先經(jīng)過(guò)R2 再照射到線偏振相機(jī)DoFP CCD1上，另一份直接照射到線偏振相機(jī)DoFP CCD2 上.2 個(gè)線偏振相機(jī)搭配四分之一波片組成的結(jié)構(gòu)在經(jīng)過(guò)校準(zhǔn)后可以測(cè)量待測(cè)光的偏振態(tài)[17].

圖1 繆勒矩陣顯微鏡結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Schematic of Mueller matrix microscope

PSG 調(diào)制發(fā)光二極管（光源波長(zhǎng)λ=514 nm）發(fā)出的照明光偏振態(tài)，PSA 檢測(cè)穿過(guò)樣品的透射光得出透射光斯托克斯向量.根據(jù)文獻(xiàn)[26]的研究結(jié)論，令R1旋轉(zhuǎn)到4 個(gè)特定的角度（±45°和±19.6°）進(jìn)行起偏，每轉(zhuǎn)動(dòng)到其中的一個(gè)角度時(shí)2 個(gè)線偏振相機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，共進(jìn)行4 次采集.PSG 先后產(chǎn)生4 組不同偏振態(tài)的照明光，其斯托克斯向量組成4×4 矩陣SPSG；PSA 相對(duì)應(yīng)地得到4 組透射光斯托克斯向量，組成4×4 矩陣SPSA.樣品的繆勒矩陣計(jì)算式為

1.3 樣品

實(shí)驗(yàn)用微塑料分別是聚氯乙烯（PVC）和尼龍6（PA6），購(gòu)買(mǎi)自東莞市樟木頭華創(chuàng)塑膠原料商行，均為白色粉末狀.單個(gè)顆粒物粒徑約為1 000目（13 μm），在水中會(huì)呈聚集狀態(tài)，粒徑不一.PVC的折射率為1.53，PA6 的折射率為1.54.這2 種微塑料廣泛分布于河流、湖泊、海洋[27].實(shí)驗(yàn)用微藻分別是多芒藻（Golenkinia）和衣藻（Chlamydomonas），購(gòu)買(mǎi)自中國(guó)科學(xué)院淡水藻種庫(kù).多芒藻細(xì)胞半徑平均約為10 μm，細(xì)胞為球形，周?chē)欣w細(xì)的刺毛；衣藻細(xì)胞半徑平均約為5 μm，細(xì)胞為卵形，前端有2 條等長(zhǎng)的鞭毛.微藻的折射率為1.36～1.45.多芒藻多生活于湖泊、河流、水坑，可以快速積累油脂實(shí)現(xiàn)生物能源生產(chǎn)，可以用于污水處理[28].衣藻多生活于有機(jī)質(zhì)豐富的小水體或潮濕的土表上，池塘、湖泊或河流中也常發(fā)現(xiàn)，是能夠特異地對(duì)線粒體、葉綠體與核分別建立轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的生物，具有高研究?jī)r(jià)值[29].

各樣品在繆勒矩陣顯微鏡4 倍物鏡（數(shù)值孔徑為0.1，視場(chǎng)為2 mm，分辨率為每微米1.028 個(gè)像素點(diǎn)）下測(cè)得的繆勒矩陣陣元M11圖像如圖2 所示，圖像大小均為1 992×2 350.圖中，LREF為各圖像的參考長(zhǎng)度.

圖2 微塑料和微藻的光強(qiáng)圖像Fig.2 Images of light intensity of microplastics and microalgae

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

圖2 中顆粒物透射光比周?chē)尘暗墓飧?，利用M11將顆粒物從背景中分離；先將圖像中的像素值用該圖像的最大值歸一化，然后將其中大于0.5 的所有像素點(diǎn)都?xì)w為背景，其余像素點(diǎn)為顆粒物像素點(diǎn)，將同一個(gè)連通域內(nèi)的顆粒物像素點(diǎn)算作1 個(gè)顆粒物.本研究采用2 種數(shù)據(jù)處理方法：1）像素點(diǎn)法（pixel point method, PPM），2）平均值法（mean value method, MVM）.PPM 取顆粒物圖像上所有的像素點(diǎn)，計(jì)算每個(gè)像素點(diǎn)的PBPA，所有像素點(diǎn)都?xì)w入數(shù)據(jù)集；MVM 是將該顆粒物看成整體，先計(jì)算圖像上每個(gè)像素的PBPA，再取平均值，1 個(gè)顆粒物只有1 個(gè)PBPA 歸入數(shù)據(jù)集.不同PBPA 計(jì)算方法對(duì)應(yīng)的顆粒物類(lèi)別的判別方法也不同.采用像素點(diǎn)法的判別方法先利用分類(lèi)模型輸出所有像素點(diǎn)對(duì)應(yīng)的顆粒物類(lèi)別，如果被歸于某類(lèi)的像素點(diǎn)數(shù)最多，則將整塊顆粒物歸入該類(lèi)；采用平均值法所對(duì)應(yīng)的判別方法則是直接使用分類(lèi)模型的輸出結(jié)果作為整塊顆粒物的類(lèi)別.

前饋神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是典型的深度學(xué)習(xí)方法[30]，也是成熟的監(jiān)督工具，可以在大量變量中提取特征并實(shí)現(xiàn)高預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性.本研究建立針對(duì)二分類(lèi)的前饋神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型并將其作為分類(lèi)模型.繆勒矩陣蘊(yùn)含豐富的顆粒物信息，顆粒物的物理特征復(fù)雜、種間差異多樣，為此采用前饋神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)從繆勒矩陣數(shù)據(jù)中提取不同種顆粒物的差異特征，以實(shí)現(xiàn)顆粒物分類(lèi).如圖3 所示，前饋神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分類(lèi)模型包含輸入層、一層隱藏層以及輸出層.輸入層有34 個(gè)單元I1～I(xiàn)34，分別對(duì)應(yīng)PBPA 的34 個(gè)數(shù)組元素；隱藏層有8 個(gè)神經(jīng)元H1～H8；輸出層有2 個(gè)單元O1、O2，代表2 種顆粒物的預(yù)測(cè)概率.Wij為Ii和Hj之 間 的 權(quán) 值，Vjk為Hj和Ok之 間 的 權(quán) 值.隱藏層凈輸入的和為

圖3 前饋神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型示意圖Fig.3 Schematic diagram of feedforward neural network model

輸出層的輸入的和為

輸入與輸出的關(guān)系用權(quán)值聯(lián)系在一起.劃分?jǐn)?shù)據(jù)集的70%為訓(xùn)練集，15%為驗(yàn)證集，15%為測(cè)試集.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)采集14 個(gè)PVC 的測(cè)量視野、8 個(gè)PA6 的測(cè)量視野，11 個(gè)多芒藻的測(cè)量視野、4 個(gè)衣藻的測(cè)量視野，每種顆粒物各獲得1 100 個(gè).對(duì)于采用像素點(diǎn)法計(jì)算PBPA 的微塑料來(lái)說(shuō)，其數(shù)據(jù)集的樣本數(shù)均約為2.0×105個(gè)，對(duì)于采用圖像平均值法計(jì)算PBPA 的微塑料和微藻，其數(shù)據(jù)集樣本數(shù)各約為1 100 個(gè).

從PVC、PA6、多芒藻和衣藻這4 個(gè)類(lèi)別的顆粒物樣品的繆勒矩陣圖像中獲取單個(gè)顆粒物的圖像信息，分析繆勒矩陣陣元的差異.各類(lèi)別顆粒物的單個(gè)顆粒物的繆勒矩陣圖像組成如圖4 所示.考慮到各種顆粒物大小不一，為了完整顯示它們的結(jié)構(gòu)特征，設(shè)定PVC 的繆勒矩陣陣元圖像大小為80×80，PA6 的繆勒矩陣陣元圖像大小為50×50，多芒藻的繆勒矩陣陣元圖像大小為40×40，衣藻的繆勒矩陣陣元圖像大小為30×30.圖中，VNOR為繆勒矩陣陣元的歸一化值.為了顯示方便，對(duì)各類(lèi)別顆粒物圖像進(jìn)行縮放，讓它們合成的繆勒矩陣圖像一樣大，繆勒矩陣的對(duì)角陣元的值已減1.可以看出，PVC 和PA6 均在M22、M33有明顯的差異，表明這2 種微塑料對(duì)光的退偏程度不同[31].實(shí)驗(yàn) 微 塑 料 的M24、M34、M42和M43同 樣 有 明 顯 差 異，反映了不同微塑料內(nèi)部結(jié)構(gòu)引起的雙折射不同[31].PVC 的M22和M33差異大，表明該樣品具有明顯的各向異性[31].圖中可以明顯觀察到單個(gè)微塑料顆粒內(nèi)部陣元值分布差異較大，這是由于該顆粒由許多細(xì)小微塑料堆疊而成，在不同位置處，厚度的不同會(huì)導(dǎo)致其陣元值不同.多芒藻對(duì)應(yīng)的M22和M33在細(xì)胞的不同結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)出較大差異，表明多芒藻細(xì)胞內(nèi)部不同部位的退偏特征較其他特征更 加 明 顯[31].由M24、M34、M42和M43陣 元 可 以 看出，多芒藻內(nèi)部結(jié)構(gòu)具有明顯的雙折射[31]；由M12、M13、M21和M31陣元的取值可以看出，多芒藻內(nèi)部結(jié)構(gòu)的排列導(dǎo)致了二向色性分布的變化[19].上述4 個(gè)類(lèi)別樣品對(duì)應(yīng)的繆勒矩陣陣元有顯著差異，反映出樣品不同微觀結(jié)構(gòu)具有不同的偏振特征，因此可以根據(jù)這些特征來(lái)區(qū)分不同種類(lèi)的顆粒物樣品.

圖4 微塑料和微藻的繆勒矩陣圖像Fig.4 Mueller matrix images of microplastics and microalgae

2.1 微塑料分類(lèi)

微塑料的形狀大小不一，當(dāng)采用像素點(diǎn)法計(jì)算PBPA 時(shí)，數(shù)據(jù)集對(duì)應(yīng)的微塑料樣本數(shù)為200 000個(gè).測(cè)試集樣本數(shù)占總樣本數(shù)的15%，將測(cè)試集數(shù)據(jù)作為分類(lèi)模型的輸入，得到微塑料分類(lèi)對(duì)應(yīng)的混淆矩陣，如圖5（a）所示.混淆矩陣的行表示實(shí)際類(lèi)別，矩陣的列表示預(yù)測(cè)類(lèi)別，對(duì)角線陣元的值表示預(yù)測(cè)準(zhǔn)確的比例，越接近100%，分類(lèi)效果越好.混淆矩陣由大量測(cè)試集樣本得到，保證了分類(lèi)準(zhǔn)確度[32].2 種微塑料在純樣品實(shí)驗(yàn)中的分類(lèi)效果圖，如圖5（b）、（c）所示，圖中深色代表PVC，淺色代表PA6.可以看到，在純PVC 樣品的實(shí)驗(yàn)中，視野內(nèi)共有35 個(gè)微塑料顆粒，其中34 個(gè)被準(zhǔn)確識(shí)別；在純PA6 樣品的實(shí)驗(yàn)中，視野內(nèi)共有114 個(gè)微塑料顆粒，其中107 個(gè)被準(zhǔn)確識(shí)別.2 類(lèi)微塑料在水中混合時(shí)的分類(lèi)效果圖如圖5（d）所示.在混合實(shí)驗(yàn)中，顆粒物被分為2 類(lèi)，其比例與圖5（b）、（c）的比例接近；可以看出，2 種微塑料的形態(tài)、大小變化范圍很大，并且微塑料的聚集程度不同，僅憑圖像難以得知微塑料種類(lèi).由大量測(cè)試集樣本得到的混淆矩陣，保證了繆勒矩陣數(shù)據(jù)可以準(zhǔn)確地進(jìn)行微塑料種類(lèi)的區(qū)分，因此圖5（d）混合樣品中的2 種微塑料被準(zhǔn)確地識(shí)別出來(lái)是可信的.

圖5 聚氯乙烯和尼龍6 的混淆矩陣和分類(lèi)效果圖Fig.5 Confusion matrix and classification result of PVC and PA6

2.2 微藻分類(lèi)

微藻形狀單一，且細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)豐富，當(dāng)采用平均值法計(jì)算PBPA 時(shí)，數(shù)據(jù)集對(duì)應(yīng)的微藻樣本數(shù)為1 100 個(gè).微藻分類(lèi)對(duì)應(yīng)的混淆矩陣如圖6（a）所示，多芒藻和衣藻的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率分別為87.3%和90.2%.如圖6（b）所示為2 種微藻在水中混合時(shí)的分類(lèi)效果圖，包含31 個(gè)多芒藻，171 個(gè)衣藻.圖中，紅色代表多芒藻，黑色代表衣藻.27 個(gè)多芒藻細(xì)胞被準(zhǔn)確識(shí)別，156 個(gè)衣藻被準(zhǔn)確識(shí)別，準(zhǔn)確度分別是87.1%和91.2%，與混淆矩陣接近.衣藻普遍小于多芒藻[28-29]，對(duì)比圖2（c）和圖2（d）可以得出類(lèi)似結(jié)論，因此在圖6（b）的混合樣品中，可以通過(guò)觀察圖像中顆粒物大小來(lái)區(qū)分二者，但是這種判別方式可能存在誤差.

圖6 多芒藻和衣藻的混淆矩陣和分類(lèi)效果圖Fig.6 Confusion matrix and classification result of Golenkinia and Chlamydomona

2.3 微塑料與微藻分類(lèi)

在考察微塑料和微藻的分類(lèi)情況時(shí)，為了便于與真值進(jìn)行比較，實(shí)驗(yàn)選擇圖像特征比較明顯的微塑料PVC 和圓形的多芒藻作為樣品.此時(shí)，微塑料和微藻均采用平均值法計(jì)算各自的PBPA，其數(shù)據(jù)集樣本數(shù)各1 100 個(gè)，其混淆矩陣如圖7（a）所示.可以看出，2 類(lèi)顆粒物的分類(lèi)準(zhǔn)確度大于85%，分類(lèi)準(zhǔn)確度較高，其中微塑料的分類(lèi)準(zhǔn)確度大于微藻的分類(lèi)準(zhǔn)確度.為了模擬自然水體中的情形，實(shí)驗(yàn)時(shí)將2 種顆粒物在水中混合后測(cè)量其繆勒矩陣圖像，分類(lèi)效果圖如圖7（b）所示.利用圖像特征認(rèn)定顆粒物類(lèi)別作為真值，其中認(rèn)定圓形顆粒物為多芒藻，形狀不規(guī)則的顆粒物則為PVC.圖中包含26 個(gè)PVC，63 個(gè)多芒藻，分類(lèi)效果圖中藍(lán)色代表PVC，紅色代表多芒藻.其中，21 個(gè)PVC 被準(zhǔn)確識(shí)別，58 個(gè)多芒藻細(xì)胞被準(zhǔn)確識(shí)別，微塑料和微藻的分類(lèi)準(zhǔn)確度分別為8 0.8%、92.1%，與混淆矩陣接近.雖然圖7 中采用圖像特征區(qū)別顯著的2 種顆粒物作為例子，方便評(píng)估分類(lèi)結(jié)果的準(zhǔn)確性，但是自然水體中顆粒物種類(lèi)繁多、形態(tài)復(fù)雜，區(qū)分不同顆粒物難度很大.如圖5（d）中2 種不同微塑料混合時(shí)，僅憑圖像特征難以區(qū)分二者，還需要顆粒物的偏振特征（繆勒矩陣）.

圖7 聚氯乙烯和多芒藻的混淆矩陣以及分類(lèi)效果圖Fig.7 Confusion matrix and classification result of PVC and Golenkinia

如圖8 所示為對(duì)PVC、PA6、多芒藻、衣藻4 種顆粒物進(jìn)行四分類(lèi)的混淆矩陣.各類(lèi)顆粒物的分類(lèi)準(zhǔn)確度差異很大，比如對(duì)2 種微塑料的分類(lèi)準(zhǔn)確度大于90%，衣藻的分類(lèi)準(zhǔn)確度大于80%，但是多芒藻的分類(lèi)準(zhǔn)確度小于80%.可以看出，多芒藻與PVC 之間的誤判較高，這與圖7（a）中混淆矩陣的結(jié)果類(lèi)似；圖6（a）多芒藻與衣藻之間也有一定程度的誤判.綜合來(lái)看，多芒藻的分類(lèi)準(zhǔn)確度較低，但是4 類(lèi)顆粒物的平均分類(lèi)準(zhǔn)確度大于86%，說(shuō)明繆勒矩陣顯微方法可以較準(zhǔn)確地識(shí)別不同的顆粒物.

圖8 4 種顆粒物四分類(lèi)的混淆矩陣Fig.8 Confusion matrix corresponding to four classifications of four particles

綜合圖5～8 的結(jié)果可以看出，繆勒矩陣圖像可以準(zhǔn)確地對(duì)水中微塑料和微藻進(jìn)行分類(lèi).分類(lèi)準(zhǔn)確度受制于PBPA 的計(jì)算方法、顆粒物種類(lèi)的真值影響；繆勒矩陣圖像的準(zhǔn)確測(cè)量也可能關(guān)乎分類(lèi)效果.

3 討 論

結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，由繆勒顯微鏡采集到的數(shù)據(jù)算出的繆勒矩陣及其演化的偏振參數(shù)對(duì)顆粒物的物理性質(zhì)具有較強(qiáng)表征能力，它是比傳統(tǒng)顯微成像更強(qiáng)有力的分析工具.然而，影響顆粒物分類(lèi)效果的因素有很多，依舊有許多值得探討的地方.

3.1 數(shù)據(jù)處理方法的選擇

圖6 是采用平均值法計(jì)算PBPA 對(duì)2 種微藻進(jìn)行分類(lèi)得到的結(jié)果，獲得了較好的分類(lèi)效果.當(dāng)采用像素點(diǎn)法計(jì)算PBPA 時(shí)，對(duì)應(yīng)的混淆矩陣如圖9 所示.可以看到，相較圖6（a），像素點(diǎn)法對(duì)應(yīng)的準(zhǔn)確度下降了9.2 個(gè)百分點(diǎn).

圖9 2 種微藻采用像素點(diǎn)法時(shí)分類(lèi)后得到的混淆矩陣Fig.9 Confusion matrix obtained after classification of two microalgae using pixel point method

分別采用像素點(diǎn)法和平均值法分析數(shù)據(jù)集中的1 100 個(gè)多芒藻樣本的PBPA，其偏振參數(shù)D、t的值分布情況如圖10 所示.NNOR為偏振參數(shù)分布數(shù)量的歸一化值.采用像素點(diǎn)法時(shí)，D的標(biāo)準(zhǔn)差為0.031 2，t的標(biāo)準(zhǔn)差為0.018 4.采用平均值法時(shí)，D的標(biāo)準(zhǔn)差為0.019 2，t的標(biāo)準(zhǔn)差為0.006 3.可以看到，采用平均值法可以將偏振參數(shù)的值分布范圍縮小.微藻內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜，內(nèi)部結(jié)構(gòu)的偏振特征差異較大，對(duì)整個(gè)細(xì)胞偏振參數(shù)取平均值，可以將這些差異壓制，有利于突出不同微藻之間的差異，因此分類(lèi)效果更好.

圖10 采用不同數(shù)據(jù)處理方法時(shí)2 種偏振參數(shù)值的分布圖Fig.10 Distribution diagram of two polarimetry basis parameters with different data processing methods

3.2 運(yùn)動(dòng)偽影

在水環(huán)境中的顆粒物，尤其是微藻容易發(fā)生旋轉(zhuǎn)和翻滾.部分偏振參數(shù)對(duì)顆粒物的運(yùn)動(dòng)較為敏感，繆勒矩陣顯微鏡在采集圖像數(shù)據(jù)時(shí)須配合電機(jī)的轉(zhuǎn)動(dòng)，用時(shí)18 s，過(guò)程中要求視野下的顆粒物保持靜止不動(dòng)，以便采集到最為準(zhǔn)確的數(shù)據(jù).如圖11所示為有運(yùn)動(dòng)偽影和無(wú)運(yùn)動(dòng)偽影時(shí)PVC 的M11圖像.有運(yùn)動(dòng)偽影和無(wú)運(yùn)動(dòng)偽影的實(shí)驗(yàn)條件不變，區(qū)別僅在于水流動(dòng)的劇烈程度，嚴(yán)格來(lái)講，圖11（b）中的顆粒物圖像依然存在運(yùn)動(dòng)偽影，但成像效果明顯好于圖11（a）的顆粒物圖像.

圖11 有運(yùn)動(dòng)偽影和無(wú)運(yùn)動(dòng)偽影時(shí)聚氯乙烯的光強(qiáng)圖像Fig.11 Images of light intensity of PVC with or without motion artifacts

如表1 所示為同一塊PVC 在有運(yùn)動(dòng)偽影和無(wú)運(yùn)動(dòng)偽影時(shí)對(duì)應(yīng)的偏振參數(shù)D、t、b的均值和標(biāo)準(zhǔn)差.表中，DM為偏振參數(shù)D的均值，DSD為偏振參數(shù)D的標(biāo)準(zhǔn)差，tM為偏振參數(shù)t的均值，tSD為偏振參 數(shù)t的 標(biāo) 準(zhǔn) 差，bM為 偏 振 參 數(shù)b的 均 值，bSD為 偏振參數(shù)b的標(biāo)準(zhǔn)差.可以看到，存在運(yùn)動(dòng)偽影時(shí)，各偏振參數(shù)的平均值都發(fā)生較大變化.從偏振參數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)差變化情況來(lái)看，運(yùn)動(dòng)偽影會(huì)導(dǎo)致數(shù)據(jù)變得離散，使分類(lèi)效果變差.在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，通過(guò)抑制細(xì)胞或顆粒物的運(yùn)動(dòng)、更快的成像和更復(fù)雜的圖像配準(zhǔn)技術(shù)，可以減少由運(yùn)動(dòng)偽影引起的誤差.可以通過(guò)添加固定劑（如福爾馬林溶液）來(lái)抑制微藻的自身運(yùn)動(dòng)，或者在蓋玻片邊緣用蠟封抑制液體揮發(fā)來(lái)限制顆粒運(yùn)動(dòng)，也可以通過(guò)減少整個(gè)顯微鏡臺(tái)面的振動(dòng)或晃動(dòng)來(lái)減少顆粒物的運(yùn)動(dòng).

表1 有運(yùn)動(dòng)偽影和無(wú)運(yùn)動(dòng)偽影時(shí)聚氯乙烯偏振參數(shù)的均值和標(biāo)準(zhǔn)差表Tab.1 Mean and standard deviation of polarimetry basis parameters of PVC with or without motion artifacts

3.3 顯微鏡對(duì)焦的影響及應(yīng)對(duì)方法

由于顆粒物在水中位置分布不同、自身厚度不同等因素，實(shí)驗(yàn)時(shí)無(wú)法做到對(duì)視野中所有顆粒物精確對(duì)焦，嘗試采集PVC 和PA6 的多個(gè)焦平面的數(shù)據(jù)，再對(duì)多組數(shù)據(jù)的每個(gè)像素點(diǎn)的偏振參數(shù)進(jìn)行取均值處理.以單個(gè)PVC 顆粒為例，采集3 種不同對(duì)焦情況下的圖像（F1、F2、F3），并取3 張圖像每個(gè)像素點(diǎn)的均值合成新的圖像（F4）.3 種不同對(duì)焦情況下偏振參數(shù)D、t的值分布情況如圖12 所示.在對(duì)焦情況F1 下，D的標(biāo)準(zhǔn)差為0.025 9，t的標(biāo)準(zhǔn)差為0.020 1；在對(duì)焦情況F2 下，D的標(biāo)準(zhǔn)差為0.074 8，t的標(biāo)準(zhǔn)差為0.033 1；在對(duì)焦情況F3 下，D的標(biāo)準(zhǔn)差為0.027 8，t的標(biāo)準(zhǔn)差為0.020 7；對(duì)3 種對(duì)焦情況下的數(shù)據(jù)取平均后，D的標(biāo)準(zhǔn)差為0.030 8，t的標(biāo)準(zhǔn)差為0.016 3.可以看到，對(duì)3 種聚焦下的數(shù)據(jù)取均值后，可以減小單次隨機(jī)對(duì)焦帶來(lái)的不利影響，有利于分類(lèi).

圖12 在不同對(duì)焦情況下2 種偏振參數(shù)值的分布圖Fig.12 Distribution diagram of two polarimetry basis parameters in different focusing situations

4 結(jié) 語(yǔ)

本研究基于繆勒矩陣顯微鏡對(duì)2 種微塑料和2 種微藻進(jìn)行分類(lèi)探測(cè).使用繆勒矩陣顯微鏡采集樣品繆勒矩陣圖像數(shù)據(jù)，得到顆粒物的偏振參數(shù).利用深度學(xué)習(xí)工具實(shí)現(xiàn)對(duì)微塑料、微藻以及微塑料和微藻的分類(lèi)識(shí)別，結(jié)果顯示，分類(lèi)準(zhǔn)確率均超過(guò)80%，表明源于繆勒矩陣圖像的偏振參數(shù)能夠有效、高通量地實(shí)現(xiàn)對(duì)水中微塑料和微藻的分類(lèi)和識(shí)別.本研究討論了不同數(shù)據(jù)處理方法、樣品運(yùn)動(dòng)、物鏡的對(duì)焦對(duì)繆勒顯微鏡所采集數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性的影響，但只在進(jìn)行了微塑料與微藻的簡(jiǎn)單分類(lèi)實(shí)驗(yàn)后展示了方法的有效性.在后續(xù)工作中，1）將探索更多的偏振參數(shù)，從中選擇合適、有效的偏振參數(shù)進(jìn)行多分類(lèi)實(shí)驗(yàn)；2）將對(duì)自然水體中顆粒物開(kāi)展實(shí)驗(yàn)研究，摸索可以直接用于現(xiàn)場(chǎng)水樣檢測(cè)的方法.