結核分枝桿菌H37Rα感染肺泡巨噬細胞外泌體提取及鑒定

馬 榮,楊萬忠,戈朝暉

外泌體是細胞間相互作用的關鍵介質之一,在疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演著重要角色[1-2],近年來,外泌體在生物醫(yī)學領域中的研究熱度不斷上升。結核分枝桿菌是一種常見的致病菌,其感染可導致肺部炎癥損害[3-4]。然而,目前對于結核分枝桿菌感染對肺泡巨噬細胞外泌體分泌的影響尚不清楚。因此,本研究旨在通過建立結核分枝桿菌H37Rα菌株刺激的RAW264.7細胞模型,探討其感染對肺泡巨噬細胞外泌體的影響,并對外泌體的形態(tài)學特征進行分析鑒定。本研究將可能對外泌體在結核病發(fā)病機制中的作用提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 主要試劑與儀器:小鼠單核巨細胞(RAW264.7,中國科學院細胞庫),結核分枝桿菌(H37Rα,上海唯問生物技術有限公司),蛋白質印跡法(WB)專用細胞裂解液(上海晶諾生物科技有限公司),TSG101 (武漢三鷹生物技術有限公司),CD63、CD81[賽默飛世爾科技(中國)有限公司],超濾管(Millipore,美國),T-25 培養(yǎng)瓶(Corning,中國),96、24 孔培養(yǎng)板(NEST,美國),透析袋(BLUEBIRD,美國),DEM-3 型自動洗板機(北京拓普分析儀器有限責任公司),酶標儀(BIO-RAD 680,美國),二氧化碳培養(yǎng)箱(SANYO,日本),HD-4 層析工作站(上海滬西儀器廠),胎牛血清、DMEM、HAT(Sigma,美國),PEG 4000(Merck,德國),HiTrap protein G、硝酸纖維素膜(Amersham,美國),蛋白Marker(Fermentas,美國),外泌體抽提試劑盒(翊圣生物,41201ES25),層析柱(Phamacia,美國),蛋白質電泳轉移儀(Bio-Rad,美國),NanoDrop超微量分光光度計(Thermo Fisher Scientific,美國),透射式電子顯微鏡 HT-7700 (Hitachi,日本)。

1.2 實驗方法

1.2.1 結核分枝桿菌培養(yǎng):取新鮮雞蛋18～20個,清潔外殼,在75%酒精中浸泡1 h,使用無菌鑷子打開雞蛋的一端,將蛋液全部倒入無菌三角燒瓶中,用無菌玻璃棒充分攪拌均勻。改良羅氏培養(yǎng)基制備方法為稱量磷酸二氫鈉1.2 g、硫酸鎂0.12 g、天門冬素1.8 g、枸櫞酸鈉0.3 g、氯化鈉5 g、純甘油6 mL、輔酶A 400 U、三硫酸腺苷40 mg、蒸餾水300 mL,加熱溶解,冷卻后加入15 g新鮮馬鈴薯粉,逐漸加熱至沸騰,不斷攪拌,約20 min后(56 ℃)加入全蛋液500 mL、人血清20 mL以及10 g/L孔雀綠水溶液20 mL,玻璃棒攪拌均勻,按6 mL/管分裝至15×16 mm玻璃試管中,置于血清凝固器中使培養(yǎng)基凝固成斜面(90 ℃,1 h),無菌試驗合格后備用。結核分枝桿菌H37Rα菌株接種于改良羅氏培養(yǎng)基中,生長20 d后收集菌體。

1.2.2 單核巨噬細胞RAW264.7培養(yǎng):RAW264.7完全培養(yǎng)90%RPMI1640+10% FBS+100U/mL青霉素+0.1 mg/mL鏈霉素將RAW264.7細胞復蘇后,離心,棄去上清液,加入完全培養(yǎng)基重懸細胞,轉移至10 cm培養(yǎng)皿中,在37 ℃的細胞培養(yǎng)箱中,定時觀察并更換新鮮培養(yǎng)基,培養(yǎng)24～48 h。

1.2.3 結核分枝桿菌H37Rα菌株刺激肺泡巨噬細胞系RAW264.7的實驗分組與設計:建立結核分枝桿菌(MTB)刺激的巨噬細胞模型。實驗分為感染組與非感染組,以感染復數(shù)(MOI)為 10 的比例將感染組的巨噬細胞 RAW264.7 用H37Rα菌株進行感染刺激。分別配制含有10%胎牛血清(FBS)+1%雙抗(青、鏈霉素)的DMEM細胞培養(yǎng)基與僅含10%胎牛血清(FBS)的DMEM細胞培養(yǎng)基。非感染組空白培養(yǎng)基刺激巨噬細胞,實驗組以H37Rα刺激細胞。在37 ℃、50 mL/L CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后收集H37Rα菌株感染的巨噬細胞模型。

1.2.4 外泌體抽提

1.2.4.1 外泌體抽提試劑盒:取10 mL細胞上清液,加入2.5 mL外泌體抽提試劑(41201-A),采用渦旋震蕩混勻1 min,于4 ℃靜置2 h;10 000 g、4 ℃離心60 min,棄上清液,收集沉淀(盡可能吸盡上清);取100 μL 1×PBS均勻吹打沉淀物,使其充分混勻,并轉移到新的1.5 mL離心管中;12 000 g、4 ℃離心2 min,所得外泌體沉淀用100 μL 1×PBS 重懸。BCA法蛋白定量后調整蛋白濃度為0.5 mg/mL。

1.2.4.2 電鏡檢測:取10 μL新鮮外泌體溶液,以30 g/L磷鎢酸染色5 min,染色后的外泌體滴于銅網膜上,于65 ℃烤干,在透射電鏡下觀察。

1.2.5 Western-blot檢測:取50 μL外泌體,加入等體積的WB專用蛋白裂解液,加入上樣緩沖液,將其加熱至100 ℃并保持10 min使蛋白質變性,之后冷卻至室溫。配制濃度為12%分離膠和5%的濃縮膠,上樣進行電泳,將蛋白質根據(jù)大小進行分離。通過Trans-blot turbo轉移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉在室溫下封閉1.5 h,然后加入TGS101、CD63、CD81抗體,并在4 ℃孵育,過夜。將PVDF膜置于保鮮膜上,用TBST溶液洗滌PVDF膜3次,每次10 min。然后加入相應的二抗,室溫下反應1.5 h。用TBST溶液再次洗滌PVDF膜3次,每次10 min。然后移入凝膠成像分析儀中,用化學光敏模式曝光顯影。

2 結果

2.1 外泌體電鏡及NTA檢測:外泌體的電鏡檢測結果見圖1(目次后)。透射電鏡下提取的兩組外泌體均呈圓形或類圓形,部分呈鵝卵石樣,粒徑20～140 nm,其具有典型的杯狀形態(tài)和脂質雙層結構。將分離后的外泌體按1∶100比例重懸到1 mL無菌水中,應用NTA分析記錄外泌體的直徑和大小分布。NTA檢測顯示感染組外泌體粒徑峰值124 nm,非感染組外泌體粒徑峰值133 nm。

2.2 Western-blot檢測外泌體表面蛋白TGS101、CD63、CD81:蛋白免疫印跡驗證提取外泌體的特征蛋白,Western-blot技術對感染組與非感染組的外泌體表面的標志性蛋白TGS101、CD63、CD81進行了檢測。H37Rα感染組和非感染組的外泌體表面標志性蛋白檢測結果均為陽性,見圖2(目次后)。

3 討論

外泌體是一種由活細胞分泌、直徑為30～150 nm、由雙層脂質膜構成的小囊泡[5]。它在機體內廣泛分布,分布于外周血、腹水、大小便、唾液、腦脊液以及各類體液等[6-7]。外泌體所攜帶的各種蛋白質、脂肪、DNA和RNA等重要信息,不僅在細胞與細胞間的物質和信息傳遞中起重要作用,更有望成為多種疾病的早期診斷標志物[8-9]。外泌體的提取與分離方法通常包括密度梯度離心、超速離心、體積排阻、免疫磁珠、聚合物沉淀以及試劑盒等方法[10-11]。超速離心法[12]是最早的外泌體分離技術,通過高速離心機將細胞上清液中的外泌體分離出來。該方法分離得到的外泌體純度較高,但是產量較低,不適用于大規(guī)模研究;密度梯度離心法通過將細胞上清液置于不同密度的梯度介質中,利用外泌體在不同介質中的密度差異而逐漸沉淀,然后收集沉淀物中的外泌體,該方法分離得到的外泌體產量較高,但是純度較低;免疫磁珠法[13]利用外泌體表面抗原與特異性抗體結合的原理,將外泌體與免疫磁珠特異性結合,并通過磁場將免疫磁珠與外泌體分離,該方法分離得到的外泌體純度較高,但是需要特殊的設備和試劑;聚合物沉淀法利用某些聚合物的電荷吸附作用,將細胞上清液中的外泌體吸附并沉淀下來,然后收集沉淀中的外泌體,該方法分離得到的外泌體產量較高,但是純度較低。選擇合適的方法是進行外泌體相關研究的關鍵。本研究采用結核分枝桿菌H37Rα穩(wěn)定減毒株進行研究。為確保實驗的安全性和高效性,本研究特別選擇了免疫磁珠法,其原理主要基于外泌體的生物學特性以及膜蛋白和外泌體特異性標記物的相互作用。試劑盒使用了免疫磁珠這一高親和力材料,它具有特異性結合外泌體膜蛋白的能力,外泌體膜蛋白與試劑盒材料發(fā)生結合形成復合物,通過離心后復合物會沉降,從而與上清液分離。

本研究中感染組的外泌體均可觀察到典型的杯狀形態(tài)和雙層膜結構,且外泌體的粒徑大小分布圖均為單一主峰,無明顯的雜峰,說明提取的外泌體粒徑分布均勻,質量穩(wěn)定。此外,外泌體還有一些標志性的蛋白質組成,為其鑒定提供了更為充足的證據(jù)。通過Western-blot技術檢測非感染組和感染組的外泌體的跨膜蛋白CD9和CD81,均為陽性,說明所提取的細胞外囊泡的表面標志蛋白符合外泌體的表征。

本研究采用建立結核分枝桿菌H37Rα菌株刺激的肺泡巨噬細胞模型,利用試劑盒法成功分離并提取出外泌體,并對外泌體的形態(tài)特征進行分析和鑒定。通過測定其生物特異性標志蛋白以及形態(tài)學分析,表明提取的外泌體含量和純度均較高,為今后進一步深入研究巨噬細胞來源的外秘體在結核病中的免疫應答提供了重要依據(jù),以確保今后有關試驗的順利開展。