基于NLRP3/Caspase-1/GSDMD信號通路探討針灸預(yù)防應(yīng)激性胃潰瘍細(xì)胞焦亡的作用機(jī)制

蘭永利 霍新慧 李 盼 韋 芳 阿力米熱·阿布都熱西提

（新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830054）

應(yīng)激性胃潰瘍（stress-induced gastric ulcers，SGU）被認(rèn)為是一種與應(yīng)激相關(guān)的黏膜損傷，一般是由胃黏膜缺血、血液灌注不足或再灌注損傷應(yīng)激所引起的[1]。引起SGU發(fā)生發(fā)展的因素有很多，由酒精刺激胃黏膜導(dǎo)致黏膜應(yīng)激反應(yīng)，從而使黏膜自身防御下降引起缺血、灌注不足是SGU發(fā)生的主要原因之一。而胃黏膜組織的正常生理功能關(guān)系著人們飲食生活的正常進(jìn)行，胃黏膜的病變損傷，會引起人們飲食方式和營養(yǎng)攝入的改變，從而導(dǎo)致健康水平下降。因此，提高胃黏膜自身保護(hù)防御能力，預(yù)防SGU的發(fā)生發(fā)展成為當(dāng)前的研究熱點。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，針灸預(yù)處理可通過調(diào)控炎癥反應(yīng)通路、氧化應(yīng)激等預(yù)防應(yīng)激性胃潰瘍[2]。而近來有研究得出結(jié)論，一種促炎性、程序性細(xì)胞的死亡形式是細(xì)胞焦亡[3]，細(xì)胞焦亡的經(jīng)典通路在胃黏膜損傷過程中發(fā)揮著重要作用，隨著應(yīng)激強(qiáng)度的增加，胃黏膜上皮細(xì)胞的增殖減少、焦亡增多，加重胃黏膜損傷。NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NLRP3）/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）/消皮素D（GSDMD）是細(xì)胞焦亡經(jīng)典通路，以NLRP3炎癥小體形成、Caspase-1激活、GSDMD切割為特征[4]。

在治療已經(jīng)發(fā)生的胃黏膜損傷方面，西醫(yī)治療手段療效已經(jīng)得到了廣泛的認(rèn)可，但其在預(yù)防方面并不具備優(yōu)勢?！爸挝床　笔侵嗅t(yī)特色，有研究證明，針灸在“治未病”方面發(fā)揮著較好的作用[5]，但目前尚未有研究基于細(xì)胞焦亡通路探索針刺與艾灸預(yù)防SGU的作用機(jī)制。本研究觀察針刺與艾灸預(yù)處理對SGU的預(yù)防作用及其對細(xì)胞焦亡經(jīng)典通路NLRP3/Caspase-1/GSDMD的干預(yù)作用，探討針刺與艾灸預(yù)防應(yīng)激性胃潰瘍的作用機(jī)制，為針灸進(jìn)一步應(yīng)用于臨床預(yù)防SGU提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠52只，雌雄各半，體質(zhì)量（180±20）g，購自新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，動物合格證號：SYXK（新）2018-0003。大鼠自由攝食、攝水，飼養(yǎng)室溫度：20～25℃，相對濕度：50%～54%，自然晝夜交替。在實驗開始前適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。實驗過程符合新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)（倫理批號：IACUC-20230227-3）。

1.2 藥物與試劑 無水乙醇，購自天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；阿司匹林腸溶片（拜耳醫(yī)藥有限公司，國藥準(zhǔn)字：J20130078），研磨成粉狀后，與生理鹽水按照2000 mg∶100 mL配置成阿司匹林混懸液；酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6、IL-18試劑盒（批號：YX-E21174、YX-E20958、YX-E21122、YX-E21189），購自上海優(yōu)選生物科技有限公司；Invent總蛋白提取試劑盒（批號：SD001/SN002），購自美國Invent公司；SDS-PAGE分離膠制備試劑盒（批號：BP112）、SDS-PAGE濃縮膠制備試劑盒（批號：BP108）、BCA蛋白含量檢測試劑盒（批號：BP104）、預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)（批號：BP117）、蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot）法專用型轉(zhuǎn)印濾紙（批號：BP202），購自中國Bio-Platform公司；ECL檢測試劑盒（批號：34580），購自美國Thermo公司。

1.3 主要儀器 一次性針灸針（華佗牌，規(guī)格0.25 mm×13 mm），購自蘇州醫(yī)療用品廠有限公司；艾灸條（規(guī)格4 mm×120 mm），購自南陽漢醫(yī)艾絨有限公司；大鼠固定支架，購自蘄春上工記艾灸器具開發(fā)有限公司；酶標(biāo)分析儀（型號：Infinite F50），購自上海優(yōu)選生物科技有限公司；蛋白印跡儀（型號：Yrdimes SW07D0567）、KETA M多用凝膠成像系統(tǒng)，購自臺灣威泰克有限公司；臺式恒溫振蕩器（型號：THZ-312），購自上海精宏實驗設(shè)備有限公司。

2 實驗方法

2.1 分組與預(yù)處理 采用數(shù)字編號法對52只SD大鼠進(jìn)行標(biāo)號，而后按照隨機(jī)數(shù)字法將其分為4組，分別為正常組、模型組、預(yù)灸組、預(yù)針刺組，每組13只。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，于每日上午10∶00開始進(jìn)行干預(yù)操作。正常組與模型組：支架固定，不做其他處理，20 min/次，1次/d，連續(xù)7 d；預(yù)灸組：支架固定，溫和灸懸灸中脘、足三里（雙），20 min/次，1次/d，連續(xù)7 d；預(yù)針刺組：支架固定，針刺中脘、足三里（雙），平補(bǔ)平瀉，留針20 min，1次/d，連續(xù)7 d。每次干預(yù)操作結(jié)束后，解除大鼠支架固定，回飼養(yǎng)室進(jìn)行正常喂養(yǎng)。大鼠中脘和足三里取穴參照《實驗動物常用穴位名稱與定位第2部分：大鼠》[6]確定穴位位置，中脘穴位于臍上約20 mm處，足三里穴位于膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，在腓骨小頭下約3 mm處。

2.2 造模 末次干預(yù)處理結(jié)束后，禁食不禁水1 d，次日開始對模型組、預(yù)灸組、預(yù)針刺組大鼠進(jìn)行SGU模型的制備。采用無水乙醇與阿司匹林混懸液灌胃法建立大鼠SGU模型，先予無水乙醇0.6 mL/100 g灌胃，1 h后再予阿司匹林混懸液200 mg/kg灌胃，每日無水乙醇與阿司匹林混懸液各灌胃1次，連續(xù)4 d。正常組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，不作處理。本研究所用造模方法已經(jīng)課題組前期實驗證實，方法可靠，造模成功率高[7]。

2.3 取材 造模結(jié)束后當(dāng)日22∶00開始禁食禁水，次日上午10∶00開始取材。各組大鼠采用10%水合氯醛麻醉；腹主動脈取血，離心半徑10 cm、3000 r/min離心20 min，收集上清液，-80 ℃冰箱中儲存待測；取出全胃，沿胃大彎剪開，用生理鹽水沖洗干凈，充分暴露胃黏膜組織，觀察并拍照；將每只大鼠胃組織分成兩部分，一部分于4%多聚甲醛中固定，另一部分儲存于-80 ℃液氮中。

2.4 指標(biāo)檢測

2.4.1 評定胃黏膜損傷指數(shù)（UI） 采用GUTH P H等[8]的方法評定UI。將沖洗干凈的胃黏膜組織平鋪于濾紙上，于10倍放大鏡下肉眼觀察，卡尺測量評估損傷程度：1分，損傷（包括糜爛點）長度小于1 mm；2分，損傷長度介于1～2 mm；3分，損傷長度介于2～3 mm；4分，損傷長度介于3～4 mm；5分，損傷長度大于4 mm；若損傷處寬度大于2 mm，則計分加倍。每只大鼠UI評分為胃黏膜各處損傷計分值之和。

2.4.2 蘇木精-伊紅（HE）染色法觀察胃黏膜組織病理 取應(yīng)用4 %多聚甲醛溶液固定的各組大鼠胃組織，經(jīng)脫水、石蠟包埋等常規(guī)操作，選取胃黏膜糜爛程度最明顯處切厚度為5 μm的薄片，脫蠟脫水、HE染色，于400倍光學(xué)顯微鏡下觀察胃黏膜組織的病理形態(tài)。

2.4.3 ELISA法檢測各組大鼠血清炎癥因子水平 取各組大鼠血清，嚴(yán)格遵照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18水平。

2.4.4 Western blot法檢測NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表達(dá) 取液氮凍存的每組3只大鼠100 mg胃黏膜組織，在培養(yǎng)皿中剪碎成3 mm×3 mm左右的小塊，使用0.5～1 mL冷RIPA裂解液勻漿，充分裂解后，離心20 min（4 ℃，離心半徑10 cm，10 000 r/min）取上清液，蛋白濃度采用BCA法測定。進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入對應(yīng)的NLRP3（1∶50）、Caspase-1（1∶50）、GSDMD（1∶50）一抗，4 ℃孵育過夜，用5%脫脂奶粉封閉液稀釋二抗（1∶8000），室溫?fù)u床振蕩反應(yīng)1～2 h，洗膜10 min×3次后，ECL發(fā)光法顯色。使用Gel-Pro Analyzer4軟件對結(jié)果進(jìn)行灰度分析。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 26.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗。本研究所有數(shù)據(jù)均符合或近似正態(tài)分布，采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，方差齊用LSD法分析，方差不齊用Dunnett's T3法分析，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 各組大鼠胃黏膜形態(tài)及UI值比較 正常組大鼠胃黏膜組織表面光滑；模型組大鼠胃黏膜組織表面出現(xiàn)顯著出血灶，UI值明顯高于正常組（P＜0.01）；預(yù)灸組和預(yù)針刺組大鼠胃黏膜組織表面只有少量出血灶，UI值明顯低于模型組（P＜0.01），提示艾灸或針刺預(yù)處理對預(yù)防胃黏膜損傷有效；與預(yù)針刺組相比，預(yù)灸組大鼠胃黏膜組織表面出血灶更少，UI值也更低（P＜0.05），提示艾灸預(yù)處理對SGU的預(yù)防效果優(yōu)于針刺預(yù)處理。詳見圖1、表1。

表1 各組大鼠胃黏膜UI值比較 單位：分

圖1 各組大鼠胃黏膜形態(tài)

3.2 各組大鼠胃黏膜組織病理形態(tài)比較 正常組大鼠胃黏膜組織未見病理改變，無紅細(xì)胞滲出；模型組大鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的胃黏膜損傷，有大量紅細(xì)胞滲出；預(yù)灸組和預(yù)針刺組大鼠胃黏膜組織基本正常，見少量紅細(xì)胞滲出。詳見圖2。

圖2 各組大鼠胃黏膜組織病理學(xué)形態(tài)（HE，×400）

3.3 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18水平比較 模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18水平均明顯高于正常組（P＜0.01）；預(yù)灸組和預(yù)針刺組大鼠上述炎癥因子水平均明顯低于模型組（P＜0.05，P＜0.01）；預(yù)灸組大鼠上述炎癥因子水平均明顯低于預(yù)針刺組（P＜0.05，P＜0.01）。詳見表2。

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18水平比較（） 單位：pg/mL

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18水平比較（） 單位：pg/mL

注： 與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與預(yù)針刺組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別動物數(shù)/只TNF-αIL-1βIL-6IL-18正常組13148.33±12.14 64.03±14.2287.33±14.58108.45±13.22模型組13311.12±11.28**137.18±9.11**202.90±16.17**214.60±13.42**預(yù)灸組13202.59±21.35##△△ 91.53±10.37##△ 124.43±12.29##△△141.48±16.17##△△預(yù)針刺組13267.84±25.32#106.76±9.89##174.81±16.56##186.12±14.48##

3.4 各組大鼠胃黏膜組織NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表達(dá)比較 模型組大鼠胃黏膜組織NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表達(dá)水平明顯高于正常組（P＜0.05）；預(yù)灸組和預(yù)針刺組大鼠胃黏膜組織上述蛋白表達(dá)均明顯低于模型組（P＜0.05）；預(yù)灸組大鼠胃黏膜組織Caspase-1蛋白表達(dá)水平明顯低于預(yù)針刺組（P＜0.05）。詳見表3、圖3。

表3 各組大鼠胃黏膜組織NLRP3、Caspase-1和GSDMD蛋白表達(dá)水平比較（）

表3 各組大鼠胃黏膜組織NLRP3、Caspase-1和GSDMD蛋白表達(dá)水平比較（）

注： 與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與預(yù)針刺組比較，△P＜0.05。

組別動物數(shù)/只NLRP3Caspase-1GSDMD正常組30.208±0.0010.193±0.0010.191±0.000模型組30.802±0.000*0.951±0.002*1.358±0.340*預(yù)灸組30.537±0.003#0.302±0.003#△0.242±0.011#預(yù)針刺組30.449±0.021#0.429±0.002#0.417±0.015#

圖3 各組大鼠胃黏膜組織NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白電泳圖

4 討論

胃黏膜組織的完整性對于胃維持正常的生理功能十分重要，胃黏膜在正常的生理條件下，依托自身完整的結(jié)構(gòu)來進(jìn)行防御和修復(fù)[9]。然而，近年來人們對自身胃組織的保護(hù)意識逐漸淡漠，導(dǎo)致胃黏膜的自我修復(fù)和防御機(jī)能下降，引發(fā)炎性反應(yīng)，導(dǎo)致應(yīng)激性胃潰瘍的發(fā)病率越來越高[10]。

本研究采用無水乙醇聯(lián)合阿司匹林混懸液灌胃的方法建立應(yīng)激性胃潰瘍模型，其中無水乙醇可引起胃黏膜上皮細(xì)胞變性壞死[11]，阿司匹林會使環(huán)氧合酶的活性降低，使胃黏膜黏液、血流量降低，防御力下降[12]，從而導(dǎo)致胃黏膜急性損傷，進(jìn)而引起應(yīng)激性胃潰瘍。使用兩種藥物造模相較于單一藥物造模對胃黏膜組織的刺激性更大，從而可以減少造模時間和提高成功率。本研究結(jié)果表明，模型組大鼠UI值明顯高于正常組，出現(xiàn)嚴(yán)重的胃黏膜損傷，有大量紅細(xì)胞滲出，表明SGU模型制備成功。

中醫(yī)學(xué)未病先防理念與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)所認(rèn)為的提前激發(fā)胃黏膜自身防御和修復(fù)機(jī)制理念不謀而合，而針灸可通過激發(fā)人體正氣，減少胃黏膜的損傷[13]。有研究表明，針灸治療胃黏膜損傷有獨特的優(yōu)勢[14]。尤其是灸法，以溫?zé)嶂Υ碳碚{(diào)節(jié)自身免疫代謝，應(yīng)用灸法可使胃黏膜的自我保護(hù)得到激發(fā)，使黏液達(dá)到最佳水平，修復(fù)和保護(hù)胃黏膜，來達(dá)到避免胃黏膜損傷的目的[15-16]。

作為足陽明胃經(jīng)合穴的足三里，在《針灸大成》中治療脾胃系統(tǒng)疾病時出現(xiàn)的頻率最高[17]，《四總穴歌》中的“肚腹三里留”也證實了足三里對于治療脾胃病的獨特療效?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，針刺足三里能促進(jìn)胃腸蠕動，提高胃血流量，保護(hù)胃黏膜[18]，且足三里作為保健要穴，常灸足三里可以提高機(jī)體自我防御能力。中脘為胃之募穴，是胃氣所聚之處，文獻(xiàn)顯示，電針足三里、中脘對于改善胃黏膜損傷有顯著療效[19]。

細(xì)胞焦亡是一種伴隨著炎癥反應(yīng)的新型細(xì)胞程序性死亡[20]。在NLRP3/Caspase-1/GSDMD經(jīng)典焦亡通路中，NLRP3是炎癥反應(yīng)的核心[21]，會通過作用形成NLRP3炎癥小體，最終使Caspase-1活化?；罨蟮腃aspase-1使無活性的炎癥因子前體成熟和分泌，切割GSDMD的N端序列，使其結(jié)合到膜上產(chǎn)生膜孔，引起細(xì)胞的滲透性腫脹、質(zhì)膜破裂以及IL-1β和IL-6等炎癥因子大量釋放，使炎癥反應(yīng)擴(kuò)大[22]。有研究證明，NLRP3、Caspase-1、GSDMD等蛋白大量表達(dá)是細(xì)胞焦亡的重要標(biāo)志[23]。TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18為炎癥因子，炎癥因子的大量釋放，會促使炎癥反應(yīng)發(fā)生，進(jìn)而引起胃黏膜的損傷。本研究結(jié)果表明，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18水平，胃黏膜組織NLRP3、Caspase-1及GSDMD蛋白表達(dá)水平均明顯高于正常組，而預(yù)灸組和預(yù)針刺組大鼠上述指標(biāo)均明顯低于模型組，其中預(yù)灸組在改善血清炎癥因子、降低Caspase-1蛋白表達(dá)水平方面更具優(yōu)勢。結(jié)果說明艾灸、針刺預(yù)處理可能通過抑制NLRP3蛋白的表達(dá)，從而降低NLRP3炎性小體合成，進(jìn)而抑制焦亡標(biāo)志蛋白的形成，減少炎性反應(yīng)發(fā)生，使胃黏膜防御和自我修復(fù)力增強(qiáng)，而艾灸預(yù)防胃黏膜損傷的效果優(yōu)于針刺。

綜上，針刺和艾灸都可以預(yù)防應(yīng)激性胃潰瘍，提高胃黏膜自我修復(fù)和防御，減輕胃黏膜損傷程度，其可能的作用機(jī)制是對NLRP-3/Caspase-1/GSDMD細(xì)胞焦亡經(jīng)典通路的調(diào)控。本課題組猜測，艾灸因其以溫?zé)嶂Υ碳ぃ碳ぷ饔贸志?、滲透力強(qiáng)，因此作用效果優(yōu)于針刺，但具體情況還有待進(jìn)一步研究。下一步課題組擬對焦亡蛋白進(jìn)行研究，更加深入地探討細(xì)胞焦亡通路在應(yīng)激性胃潰瘍中的具體效應(yīng)機(jī)制，為艾灸、針刺預(yù)處理的作用效果對比尋求充分的實驗基礎(chǔ)。