電針血清外泌體促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞血管新生的研究

彭擁軍,徐疏影,呂鶴群,馮瑤婷

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,江蘇 南京 210029)

腦卒中是全球范圍內(nèi)致殘率、致死率最高的疾病之一,且隨著社會(huì)老齡化的發(fā)展,腦卒中的發(fā)病率在逐年增加。迄今為止,腦缺血唯一公認(rèn)的有效療法即為超早期溶栓,但由于時(shí)間窗受限,應(yīng)用的人群極為有限[1]。近年來,有研究表明,盡早促進(jìn)缺血灶的血管新生,增加新的側(cè)支循環(huán),恢復(fù)血流,可控制可逆性損傷的神經(jīng)元進(jìn)一步加重,同時(shí)也為神經(jīng)結(jié)構(gòu)的可塑性創(chuàng)造良好的微環(huán)境,有利于神經(jīng)功能的恢復(fù)[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn),缺血缺氧可使微小核糖核酸(miRNAs)的表達(dá)譜發(fā)生改變[3]。有研究者對(duì)miRNA與血管新生的關(guān)系做了相關(guān)研究,發(fā)現(xiàn)miRNAs與血管生成密切相關(guān),miRNA如miR-210 對(duì)血管新生具有強(qiáng)大的調(diào)控作用,進(jìn)而影響到缺血性疾病的轉(zhuǎn)歸。而近年來,有報(bào)道顯示miRNAs主要來源于外泌體[4]。

針灸治療腦缺血在臨床已被廣泛認(rèn)可。有研究發(fā)現(xiàn),針灸可促進(jìn)腦缺血后的血管新生[5-6],但具體作用機(jī)制尚不明確。因此,本研究擬通過建立人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)缺氧模型,從離體水平探討外泌體miR-210介導(dǎo)的缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)/血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)/Notch信號(hào)通路在電針促進(jìn)腦缺血后血管新生中的機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6～8周齡SPF級(jí)雄性大鼠,體質(zhì)量210～230 g,均購自揚(yáng)州大學(xué)。

1.2 倫理審查

本實(shí)驗(yàn)方案已通過南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究倫理審查通過(倫理號(hào)：2021DW-40-01)。

1.3 試劑與儀器

DMEM 培養(yǎng)基(美國Gibco公司);胎牛血清(美國Gibco公司);胰蛋白酶(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);CD34一抗(美國abcam公司);HIF-1α一抗(美國abcam公司);VEGF一抗(美國abcam公司);Notch 1一抗(美國abcam公司);低頻脈沖電針治療儀(G6805-Ⅱ型,上海醫(yī)療電子儀器有限公司)。

2 方法

2.1 電針外泌體的提取

參照Longa線栓法阻塞大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈,建立改良的急性局部腦缺血再灌注模型[7]。缺血1 h后實(shí)行再灌注。造模成功后5 min進(jìn)行電針干預(yù),針刺大鼠的“人中(Du26)”和“百會(huì)(Du20)”穴,并接電針治療儀,0.8～1.3 mA,采用疏密波,電針30 min,1次/d,共電針治療3 d。最后1次電針干預(yù)7 h后,采用超速離心法提取大鼠血漿樣本中的外泌體,用PBS重懸后-80 ℃冰箱放置保存?zhèn)溆?然后用PKH26試劑標(biāo)記并提取電針外泌體。

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

根據(jù)脂質(zhì)體Lipofectamine 2000說明書所述的實(shí)驗(yàn)步驟對(duì)miR-210模擬物(miR-210 mimic);miR-210抑制劑(miR-210 inhibitor);HIF-lα抑制劑(HIF-1α shRNA)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。siRNA 序列如下：miR-210 mimic：上游引物 5′-CUGUGCGUGUGACAGCGGCUGA-3′,下游引物5′-AGCCGCUGUCACACGCACAGUU-3′;miR-210 inhibitor：5′-AGCCGCUGUCACACGCACAGUU-3′,HIF-1α shRNA：上游引物：5′-GGAAAUGAGAGAAAUGCUUACUTT-3′,下游引物5′-AGUAAGCAUUUCUCUCAUUUCCTT-3′。

2.3 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)缺氧模型建立

將HUVEC接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi),釆用DMEM培養(yǎng)基加10%的新生牛血清,置于37 ℃,含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。放入37 ℃、通有混合氣體(5%CO2,94%N2,1%O2)的缺氧培養(yǎng)箱中。3 h后更換為正常培養(yǎng)液,并置于37 ℃、5%CO2飽和的常氧培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

2.4 分組及干預(yù)

2.4.1 對(duì)照組 HUVEC置于37 ℃、55%CO2飽和的常氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng),不作任何處理。

2.4.2 模型組 HUVEC缺氧模型。

2.4.3 電針外泌體組 HUVEC缺氧模型與電針外泌體共培養(yǎng)。

2.4.4 miR-210模擬物組 在缺氧的HUVEC細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-210模擬物。

2.4.5 miR-210抑制劑組 在缺氧的HUVEC細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-210抑制劑,并與電針外泌體共培養(yǎng)。

2.4.6 HIF-lα抑制劑組 利用陽離子脂質(zhì)體法在缺氧后的HUVEC細(xì)胞中轉(zhuǎn)染HIF-lα shRNA表達(dá)載體,并與電針外泌體共培養(yǎng)。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞凋亡

根據(jù)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞處理后,收集細(xì)胞培養(yǎng)基上清和細(xì)沉淀,離心后用PBS洗滌細(xì)胞2次,再離心;在50 μL的Binding Buffer中加入5μL 7-AAD染液,收集細(xì)胞中加入上述7-AAD染液,再加入 Binding Buffer 與AnnexinV-PE 混勻,1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.6 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖

將HUVECs接種在96孔板中,按照實(shí)驗(yàn)分組分別進(jìn)行處理,放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng) 24 h、36 h和48 h,培養(yǎng)結(jié)束后向每孔加入10 μL CCK-8溶液,培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h,用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度值,計(jì)算細(xì)胞活性。細(xì)胞生存率(%)=(OD實(shí)驗(yàn)組-OD空白組)/(OD對(duì)照組-OD空白組)×100%。

2.7 Matrigel基質(zhì)膠實(shí)驗(yàn)觀察血管生成能力

將整個(gè)培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中,放置30 min使膠凝固,在膠凝固的過程中,將各組細(xì)胞消化后,用無血清的培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度到6×105cell/mL,從培養(yǎng)箱中取出ibidi血管生成載玻片,每孔加入50 μL細(xì)胞懸液,放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜,24 h內(nèi)記錄細(xì)胞管狀結(jié)構(gòu)數(shù)量。

2.8 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)情況

采用Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞CD34、HIF-1α、VEGF和Notch 1蛋白表達(dá)量。離心收集各組干預(yù)48 h后的細(xì)胞,Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)含量,SDS-PAGE凝膠電泳,分別加入一抗、洗滌,二抗、洗滌,進(jìn)行發(fā)光檢測(cè),X光片壓片、顯影及定影。用目的條帶與β-tubulin條帶的灰度值比值作為蛋白樣本表達(dá)強(qiáng)度。

2.9 qPCR檢測(cè)相關(guān)mRNA表達(dá)情況

SYBR Green染料法實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)：①按照TRIzol法提取細(xì)胞中的總RNA和miRNA,RNA的濃度及純度鑒定,按照試劑盒說明書操作;②逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)RT-PCR;③Real Time PCR反應(yīng);④繪制融解曲線;⑤軟件操作反應(yīng)體系和程序。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 各組細(xì)胞凋亡情況

細(xì)胞經(jīng)處理后,與對(duì)照組比較,模型組的細(xì)胞凋亡率顯著上升,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較,經(jīng)細(xì)胞外泌體處理與經(jīng)miR-210模擬物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞凋亡率顯著下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與電針外泌體組比較,單純經(jīng)miR-210模擬物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),而經(jīng)miR-210抑制劑與HIF-lα抑制劑轉(zhuǎn)染的細(xì)胞凋亡率顯著上升,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

注：A.對(duì)照組;B.模型組;C.電針外泌體組;D.miR-210模擬物組;E.miR-210抑制劑組;F.HIF-lα抑制劑組。圖1 各組細(xì)胞凋亡情況

3.2 各組細(xì)胞活力比較

經(jīng)處理后24 h、36 h及48 h后,與對(duì)照組比較,模型組的細(xì)胞活力均顯著下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較,電針外泌體組與miR-210模擬物組的細(xì)胞活力顯著提高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與電針外泌體組比較,miR-210模擬物組的細(xì)胞活力稍有降低,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),而miR-210抑制劑組與HIF-lα抑制劑組的細(xì)胞活力均顯著下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組細(xì)胞活力比較

3.3 各組細(xì)胞血管生成能力比較

對(duì)照組為正常細(xì)胞血管結(jié)構(gòu),模型組細(xì)胞在鏡下顯示為未密封的多邊形結(jié)構(gòu),且平均管狀結(jié)構(gòu)數(shù)量顯著減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較,電針外泌體組與miR-210模擬物組管狀結(jié)構(gòu)數(shù)量顯著增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與電針外泌體組比較,miR-210抑制劑組與HIF-lα抑制劑組的管狀結(jié)構(gòu)數(shù)量均顯著減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖2、表2。

表2 各組細(xì)胞管狀結(jié)構(gòu)數(shù)量比較

注：A.對(duì)照組;B.模型組;C.電針外泌體組;D.miR-210模擬物組;E.miR-210抑制劑組;F.HIF-lα抑制劑組。標(biāo)尺=100 μm。圖2 各種細(xì)胞血管生成能力(100×)

3.4 Western blot 檢測(cè)蛋白含量比較

與對(duì)照組比較,模型組CD34、HIF-lα、VEGF及Notch 1蛋白的表達(dá)量均顯著增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較,電針外泌體組與miR-210模擬物組CD34、HIF-lα、VEGF及Notch 1蛋白的表達(dá)量均顯著,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),HIF-lα抑制劑組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與電針外泌體組比較,miR-210抑制劑組與HIF-lα抑制劑組CD34、HIF-lα、VEGF及Notch 1蛋白表達(dá)均顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖3、表3。

表3 各組細(xì)胞中CD34、HIF-lα、VEGF及Notch 1蛋白表達(dá)

注：A.對(duì)照組;B.模型組;C.電針外泌體組;D.miR-210模擬物組;E.miR-210抑制劑組;F.HIF-lα抑制劑組。圖3 各組細(xì)胞CD34、HIF-lα、VEGF及Notch 1蛋白表達(dá)情況

3.5 qPCR檢測(cè)mRNA表達(dá)的比較

與對(duì)照組比較,模型組miR-210、CD34、HIF-lα、VEGF及Notch 1 mRNA的表達(dá)量均顯著增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較,電針外泌體組與miR-210模擬物組miR-210、CD34、HIF-lα、VEGF及Notch 1mRNA的表達(dá)量均顯著,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),HIF-lα抑制劑組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與電針外泌體組比較,miR-210抑制劑組與HIF-lα抑制劑組miR-210、CD34、HIF-lα、VEGF及Notch 1 mRNA表達(dá)均顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表4。

表4 各組細(xì)胞中miR-210、CD34、HIF-lα、VEGF及Notch1 mRNA表達(dá)

4 討論

目前針對(duì)缺血性腦卒中的治療,重組組織型纖溶酶原激活劑(rt-PA)是唯一被FDA認(rèn)可的溶栓藥物,因其使用時(shí)間窗窄與副作用在臨床使用受限[8]。針灸已被世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦為治療腦缺血損傷的替代與補(bǔ)充療法[9]。臨床研究發(fā)現(xiàn),針灸可顯著提高腦缺血患者的肌力,緩解肌肉僵硬狀態(tài),提高患者平衡能力[10-12]。一項(xiàng)循證研究證明,針刺可減少急性缺血?jiǎng)游锬Ｐ偷哪X梗死體積,促進(jìn)神經(jīng)功能損傷的恢復(fù)[13]。有研究顯示,針灸可促進(jìn)腦缺血后細(xì)胞增殖,加速細(xì)胞遷移,促進(jìn)神經(jīng)再生[14]。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),針灸可能促進(jìn)血管新生、增加側(cè)支循環(huán)開放程度以緩解腦缺血損傷[15]。然其具體機(jī)制還需進(jìn)一步探索。

近年來,外泌體在機(jī)體中的重要作用被重新發(fā)現(xiàn),是一種具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)的微小膜泡,包含細(xì)胞特異的蛋白、脂質(zhì)和核酸,并能作為信號(hào)分子在細(xì)胞間傳遞信息。目前,外泌體已成為細(xì)胞間信息通訊的常見形式。大部分的細(xì)胞可通過外泌體攜帶miRNAs,以保護(hù)miRNAs免受內(nèi)源性RNA酶的降解。缺血缺氧環(huán)境可調(diào)控miRNAs的表達(dá)[3]。研究發(fā)現(xiàn),miR-210對(duì)血管新生具有強(qiáng)大的調(diào)控作用,從而影響到腦卒中的轉(zhuǎn)歸[16]。研究表明,miR-210過表達(dá)使內(nèi)皮細(xì)胞VEGF表達(dá)上調(diào),促使內(nèi)皮細(xì)胞遷移進(jìn)而形成毛細(xì)血管管腔樣結(jié)構(gòu)[17]。有研究發(fā)現(xiàn),HIF-1可上調(diào)缺血缺氧區(qū)VEGF的表達(dá),促進(jìn)新血管生成,當(dāng)HIF-1抑制劑可顯著下調(diào)VEGF的表達(dá),因此推測(cè)HIF-1是VEGF的上游調(diào)控基因,影響下游VEGF的表法[18]。Antonio D等研究發(fā)現(xiàn)VEGF可激活Notch信號(hào)通路,調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和分裂[19]。綜上,VEGF和Notch信號(hào)系統(tǒng)都參與血管新生,VEGF位于Notch信號(hào)的上游,而缺氧后HIF-1又能夠誘導(dǎo)VEGF的表達(dá),因此,HIF-1/VEGF/Notch信號(hào)通路可能是腦缺血后調(diào)控血管新生的重要通路。

本研究通過建立HUVECs缺氧模型,發(fā)現(xiàn)電針外泌體的作用與miR-210模擬物作用相似,均可降低缺氧后的細(xì)胞凋亡率,提高細(xì)胞活力,促進(jìn)缺氧缺血后的血管生成能力,同時(shí),電針外泌體可上調(diào)CD34、HIF-lα、VEGF及Notch 1的蛋白表達(dá)與miR-210、CD34、HIF-lα、VEGF及Notch 1 mRNA的表達(dá)情況,而轉(zhuǎn)染miR-210抑制劑與HIF-lα抑制劑后,細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞活力及血管生成能力均被顯著抑制,且血管新生因子的表達(dá)均被下調(diào)。表明電針治療腦缺血的作用機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)外泌體miR-210的表達(dá),從而促進(jìn)血管新生以緩解腦缺氧缺血后的神經(jīng)功能損傷,最終發(fā)揮了對(duì)腦組織的保護(hù)作用。