針刺對(duì)卵巢早衰患者血清激素及生殖道菌群的影響

卓緣圓,寧 艷,林彥廷,李藝彤,黃杏賢,譚利亞,吳家滿△

(1.深圳市中醫(yī)院,廣東 深圳 518033;2.南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳婦幼保健院,廣東 廣州 518028;3.廣州中醫(yī)藥大學(xué),廣東 廣州 510405)

卵巢早衰(Premature ovarian failure,POF)為女性在40歲之前出現(xiàn)卵巢功能減退[1],主要表現(xiàn)為促性腺激素水平升高和雌激素水平降低[2],伴有不同程度的潮熱多汗、面部潮紅與性欲低下等癥狀,對(duì)患者生活質(zhì)量與身心影響甚大[3]。卵巢早衰的病因和發(fā)病機(jī)制尚未明確,但隨著研究的深入,更多學(xué)者不僅僅單純地局限于下丘腦-垂體-性腺軸,更多地關(guān)注點(diǎn)集中在遺傳、免疫與代謝等因素[4-5]。

許多研究已證實(shí),針灸是治療POF的一種安全并有效的方法[6-7],目前的研究認(rèn)為針刺是通過激活多巴胺系統(tǒng)調(diào)控生殖軸、調(diào)整血清性腺激素和促使生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)恢復(fù)正常生理之動(dòng)態(tài)平衡[8]。女性生殖道菌群與人體免疫、代謝相關(guān),對(duì)生殖和后代健康有重大意義,相關(guān)的研究也越來(lái)越受關(guān)注。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)：與健康人群相比較,卵巢早衰患者生殖道菌群有顯著變化,這些變化與血清激素顯著相關(guān)[9]。筆者認(rèn)為針灸可能通過對(duì)生殖道菌群及其代謝產(chǎn)物的良性調(diào)控從而改善生殖道菌群的豐度及多樣性,進(jìn)一步激活“下丘腦-垂體-卵巢”的功能[10],從而治療POF。因此,本研究通過觀察針刺對(duì)POF患者血清激素及生殖道菌群的影響,初步探索針刺的療效機(jī)制,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究納入的20例卵巢早衰患者均來(lái)源于2020年3月—2020年9月在深圳市婦幼保健院中醫(yī)科門診的患者,同期通過面向社會(huì)公開招募健康受試者作為對(duì)照組。最終該試驗(yàn)獲得病例數(shù)為治療組20例、對(duì)照組20例,共40例樣本。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析,兩組患者的平均年齡和體重指數(shù)(BMI)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。見表1。該研究方案已獲得深圳市婦幼保健院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理號(hào)：SFYLS2020-012),所有參與者均自愿參加并簽署知情同意書。該研究在中國(guó)臨床試驗(yàn)注冊(cè)中心登記注冊(cè)(登記號(hào)：ChiCTR2000029576)。

表1 兩組臨床特征比較

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

POF診斷標(biāo)準(zhǔn)參照曹澤毅主編《中華婦產(chǎn)科學(xué)》[2](第3版)中診斷標(biāo)準(zhǔn)：患者最早期表現(xiàn)為生育力下降,中晚期出現(xiàn)排卵減少、月經(jīng)欠規(guī)律,甚至出現(xiàn)繼發(fā)性閉經(jīng)。患病前月經(jīng)改變的形式多樣：有月經(jīng)稀發(fā)、不規(guī)則子宮出血或閉經(jīng)等;雌激素缺乏的表現(xiàn)：有出汗、潮熱、外陰干澀、陰道燒灼不適感、尿頻、排尿困難、失眠、抑郁與記憶力下降等;40歲前絕經(jīng)。實(shí)驗(yàn)室檢查：第1次測(cè)定血清促卵泡生成素(FSH)>40 U/L,間隔1個(gè)月復(fù)測(cè)FSH持續(xù)升高,雌二醇(E2)<73.2 pmol/L。B超顯示子宮偏小或者正常,卵巢未見卵泡顯影。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)

①符合診斷標(biāo)準(zhǔn);②18歲≤年齡<40歲;③治療前至少3個(gè)月未使用過任何治療POF的藥物(應(yīng)急處理除外);④治療前至少1個(gè)月未接受治療POF的針灸操作;⑤治療前至少1個(gè)月未使用抗生素類藥物;⑥有性生活史且試驗(yàn)期間進(jìn)行性生活需全程佩戴安全套;⑦自愿參與本項(xiàng)研究并簽署知情同意書。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)

①先天因素生殖器官發(fā)育異常;②染色體核型異常者;③合并嚴(yán)重心腦血管、肝、腎、惡性腫瘤、造血系統(tǒng)及精神疾病者;④入組前1個(gè)月內(nèi)有生殖道感染性疾病或陰道用藥史;⑤拒絕簽署知情同意書者。

1.5 針刺治療

治療組采用中國(guó)針灸學(xué)會(huì)病例注冊(cè)登記研究聯(lián)盟卵巢早衰項(xiàng)目組推薦的針灸方案進(jìn)行針刺干預(yù)[11]。取穴分兩組交替使用：穴組1：百會(huì)、神庭、本神(雙)、肓俞(雙)、關(guān)元、大赫(雙)、卵巢(雙)、足三里(雙)、三陰交(雙)、太溪(雙)和太沖(雙);穴組2：腎俞(雙)、次髎(雙)。

患者取適當(dāng)體位(穴組1取仰臥位,穴組2取俯臥位),穴位進(jìn)行局部皮膚常規(guī)消毒。肓俞、關(guān)元、大赫、卵巢、足三里、腎俞：采用0.25 mm×40 mm環(huán)球牌一次性無(wú)菌不銹鋼針灸針(蘇州針灸醫(yī)療用品有限公司生產(chǎn),批號(hào)：160602)直刺25～30 mm。三陰交、太溪、太沖：采用0.25 mm×25 mm針灸針直刺15～20 mm;百會(huì)、本神和神庭：采用0.25 mm×25 mm針灸針向后平刺15～20 mm;次髎：采用0.25 mm×75 mm針灸針向正中線斜下刺入第2骶后孔中50～60 mm。所有腧穴均以得氣為度。留針30 min,穴組2連接電針,疏密波,以患者耐受為度。隔天治療1次,穴組1與穴組2交替使用,12次(1個(gè)月)為1個(gè)療程,共治療3個(gè)療程(3個(gè)月)。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 血清性激素水平 針刺前后分別收集所有研究對(duì)象(未閉經(jīng)者在月經(jīng)期2～3 d,閉經(jīng)者無(wú)時(shí)間限定)清晨空腹靜脈血5 mL,分離血清,采用全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行血清FSH、LH、E2和AMH水平的檢測(cè)。

1.6.2 生殖道菌群結(jié)構(gòu)與多樣性 采用一次性無(wú)菌采樣拭子取生殖道后穹隆處分泌物,在后穹隆處緩慢旋轉(zhuǎn)3～5周,立即折下采樣拭子前段,密封放置在2 mL無(wú)菌凍存管中,-80 ℃低溫冰箱保存。

采用16S rRNA擴(kuò)增子測(cè)序(16SrRNA Amplicon Sequencing)。用雙端引物擴(kuò)增構(gòu)建文庫(kù)后,基于Illumina Nova測(cè)序平臺(tái)測(cè)序,然后進(jìn)行雙末端(Paired- End)測(cè)序,在測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控,序列組裝,污染去除后,將序列聚類成為ASV(Amplicon sequence variants)并比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種注釋。進(jìn)一步計(jì)算菌群結(jié)構(gòu)與alpha和beta多樣性,并進(jìn)行組間差異的比較,分析樣本群落結(jié)構(gòu)的差異特征。采用5 LEfSe分析顯著差異細(xì)菌類群(以5 LEfSe>2分為篩選標(biāo)準(zhǔn))。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 治療組針刺前后血清性激素水平比較

治療組經(jīng)針刺治療后,血清FSH和LH水平較治療前降低,E2和AMH水平較治療前升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 治療組在針刺前后基礎(chǔ)血清性激素比較

2.2 生殖道菌群結(jié)構(gòu)和多樣性比較

2.2.1 生殖道菌群門水平相對(duì)豐度分析 治療組與對(duì)照組生殖道菌群門水平相對(duì)豐度比較：治療前,治療組變形菌門、放線菌門較對(duì)照組多,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),厚壁菌門、擬桿菌門兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);治療后,治療組變形菌門、放線菌門較對(duì)照組少,擬桿菌門、厚壁菌門較對(duì)照組多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

注：A為治療組(針刺前);B為治療組(針刺后);C為對(duì)照組。圖1 兩組生殖道菌群門水平相對(duì)豐度比較

注：A為治療組(針刺前);B為治療組(針刺后);C為對(duì)照組。圖2 兩組生殖道菌群復(fù)雜度比較

注：A為治療組(針刺前);B為治療組(針刺后);C為對(duì)照組。圖3 兩組生殖道差異菌屬的篩選

2.2.2 生殖道菌群復(fù)雜度比較(Alpha diversity) 治療組與對(duì)照組生殖道菌群Alpha多樣性比較：治療前,治療組生殖道菌群Shannon指數(shù)較對(duì)照組低,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);治療后,治療組生殖道菌群Shannon指數(shù)較針刺前升高,但與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

2.2.3 差異菌屬的篩選 治療組與對(duì)照組差異菌屬水平比較：治療前,治療組生殖道菌群奇異菌屬、鏈球菌屬和普雷沃氏菌屬較對(duì)照組少,加德納氏菌屬較對(duì)照組多,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 治療后,治療組奇異菌屬、羅伊氏乳桿菌屬和普雷沃氏菌屬較對(duì)照組多;雙歧桿菌屬、加德納氏菌屬和鏈球菌屬較治療前減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

針刺治療前,治療組和對(duì)照組共發(fā)現(xiàn)12個(gè)差異菌群。僅存在于治療組的生殖道的菌群有9個(gè)(亨蓋特梭菌科Hungateiclostridiaceae、梭菌科Fastidiosipila、熱纖梭菌Clostridia、巨球型菌屬M(fèi)egasphaera、微小微單胞菌Parvimonas、馬林魚科Marinifilaceae、嗅桿菌科Odoribacter、擬桿菌目g-Muribaculaceae和擬桿菌目f-Muribaculaceae);僅存在于對(duì)照組的生殖道菌群有3個(gè)(擬桿菌門P-Bacteroidota、擬桿菌門C-Bacterodia和擬桿菌門o-Bacterodiales)。見圖4。

注：A為治療組;C為對(duì)照組。圖4 兩組針刺干預(yù)前生殖道顯著差異細(xì)菌類群比較

針刺治療后,治療組顯著差異細(xì)菌類群的相對(duì)豐度與針刺前比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

臨床上發(fā)現(xiàn)很多早發(fā)性卵巢功能不全(Premature ovarian insufficiency,POI)的患者在初次就診時(shí)已是POF狀態(tài),因雌激素缺乏而引起的絕經(jīng)相關(guān)癥候群、生殖道萎縮、生育能力下降或喪失等生殖健康問題給患者的家庭帶來(lái)很大的影響。現(xiàn)代研究表明,FSH、LH水平的降低和E2水平的提高是目前治療卵巢早衰的關(guān)鍵[12]。中醫(yī)文獻(xiàn)中并無(wú)卵巢早衰病名,根據(jù)臨床表現(xiàn)將其歸于中醫(yī)學(xué)“經(jīng)水早斷”“經(jīng)閉”“血枯”等范疇[13],POF的主要癥狀表現(xiàn)是閉經(jīng),而中醫(yī)認(rèn)為閉經(jīng)的主要病因病機(jī)比較復(fù)雜,但以精血虧虛、血海不足和血無(wú)可下為主[14];目前,臨床上中醫(yī)多用中藥辨證論治聯(lián)合傳統(tǒng)中醫(yī)治法比如針刺、穴位埋線和耳針等調(diào)節(jié)卵巢功能[15-17]。針灸作為中醫(yī)特色技術(shù),可以疏通氣血、調(diào)節(jié)臟腑及沖任功能,改善機(jī)體狀態(tài),從而緩解POI患者的相關(guān)癥狀。其中,中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院針灸醫(yī)院房繄恭教授經(jīng)過多年臨床淬煉,總結(jié)治療POF的一套行之有效的針刺療法“調(diào)經(jīng)促孕十三針”[18],以“調(diào)沖任,補(bǔ)肝腎,安神志”為原則,選取百會(huì)、神庭寧心安神,結(jié)合天樞、關(guān)元與大赫等穴位調(diào)節(jié)沖任,外加太溪、腎俞與太沖等穴位調(diào)補(bǔ)肝腎,能有效改善患者的臨床癥狀,恢復(fù)正常月經(jīng)周期,改善卵巢反應(yīng),從而恢復(fù)女性生育能力。臨床研究表明[19-21],使用針刺可以降低血清FSH水平,升高血清E2水平,并有利于月經(jīng)的恢復(fù)。本試驗(yàn)結(jié)果也顯示,針刺可以顯著改善POF患者血清FSH、LH、E2以及AMH水平,緩解卵巢早衰患者臨床癥狀和減輕該疾患對(duì)患者日常生活的影響程度。

POF患者生殖道菌群與健康受試者相比存在差異[9],POF患者生殖道內(nèi)新陳代謝紊亂、免疫反應(yīng)升高,可能是導(dǎo)致生殖道微生物群落出現(xiàn)不平衡、不穩(wěn)定狀態(tài)的原因[22]。在調(diào)節(jié)生殖道菌群方面,本研究中POF患者變形菌門有高于健康受試者的趨勢(shì),其中屬變形菌門的假單胞菌因其易形成生物被膜,阻礙機(jī)體免疫細(xì)胞的吞噬以及抗菌藥物的作用,導(dǎo)致某些患者體內(nèi)的病原體無(wú)法被完全清除,從而引起生殖道菌群微生態(tài)失調(diào)[23]。有研究發(fā)現(xiàn)放線菌門豐富度偏高與細(xì)菌性陰道炎密切相關(guān)[24],而針刺可以減少變形菌門、放線菌門的相對(duì)豐度,增加擬桿菌門、厚壁菌門的相對(duì)豐度,由此,猜測(cè)針刺可能通過改善生殖道菌群,調(diào)節(jié)生殖道免疫功能從而改善卵巢功能。針刺后擬桿菌門豐度增加,可能與針刺調(diào)節(jié)POF患者多糖、高脂肪和蛋白質(zhì)的代謝有關(guān),針刺能改善生殖道潛在病原體定植和感染使宿主受益[25]。陰道厚壁菌門以乳桿菌屬為主,而乳桿菌作為人體內(nèi)常見的益生菌,可抑制致病菌生長(zhǎng),從而維持陰道微生態(tài)平衡[26]。針刺后,E2水平較治療前升高,雌激素促進(jìn)細(xì)胞增生和增加糖原的產(chǎn)生[27],糖原可以被陰道內(nèi)的乳桿菌轉(zhuǎn)化為乳酸,造成了陰道內(nèi)pH值水平下降,引起微環(huán)境的變化,有助于維持陰道的酸性環(huán)境。研究發(fā)現(xiàn),奇異菌屬、加納德菌、變形菌為主時(shí)宮頸發(fā)生病變的風(fēng)險(xiǎn)顯著升高[25]。針刺后生殖道變形菌門減少,可說明針刺可調(diào)節(jié)POF患者生殖道致病菌的產(chǎn)生以及潛在致命毒素的分泌,減少慢性生殖道的感染風(fēng)險(xiǎn)[28]。目前的研究認(rèn)為,鏈球菌易在孕期上行進(jìn)入胎盤后黏附并侵入絨毛膜,引起胎膜早破、早產(chǎn)等并發(fā)癥的發(fā)生[28],加德納氏菌屬易引起陰道黏膜炎癥,破壞生殖道屏道環(huán)境導(dǎo)致育齡期婦女子宮內(nèi)膜炎甚至流產(chǎn)[29]。本試驗(yàn)POF患者經(jīng)針刺治療后奇異菌屬、羅伊氏乳桿菌屬均較治療前增加,雙歧桿菌屬、加德納氏菌屬和鏈球菌屬較治療前有下降趨勢(shì),說明針刺能一定程度上改善這些菌群所致的不良妊娠結(jié)局。

對(duì)于物種差異與標(biāo)志物種分析,發(fā)現(xiàn)了健康受試者與POF患者治療前生殖道菌群的差異菌,這與前期相關(guān)課題的研究結(jié)論是一致的[9],但針刺前后alpha多樣性指數(shù)之Shannon指數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,一是考慮在臨床試驗(yàn)中人體生殖道菌群個(gè)體差異較大相關(guān),另一方面可能與本試驗(yàn)針刺干預(yù)過程僅3個(gè)月,療程偏短有關(guān),后續(xù)研究考慮應(yīng)延長(zhǎng)療程至半年甚至更長(zhǎng),以期獲得更為理想的研究結(jié)果。女性生殖道微生物含量低,多樣性高,在取材和檢驗(yàn)時(shí)易受其他菌群污染影響結(jié)果。本研究?jī)H僅對(duì)生殖道菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步分析,因針刺前后差異菌群結(jié)果不理想,未能進(jìn)一步做差異菌群對(duì)POF的功能預(yù)測(cè)分析,且未對(duì)生殖道分泌物樣品行分子水平的檢測(cè),期望后續(xù)研究能增加檢測(cè)及分析方法或進(jìn)行宏基因組測(cè)序以進(jìn)一步驗(yàn)證針刺改善POF的潛在機(jī)制。

綜上所述,針刺不僅能改善POF的臨床癥狀,而且能下調(diào)POF患者促炎菌群變形菌門、放線菌門相對(duì)豐度,上調(diào)抑炎菌群擬桿菌門、厚壁菌門相對(duì)豐度。其機(jī)制可能與改變生殖道菌群結(jié)構(gòu)及調(diào)節(jié)有益菌屬而修復(fù)生殖道屏障相關(guān),但所發(fā)揮的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究,為針刺治療POF提供更可靠的理論依據(jù)。