布魯菌抗原免疫層析檢測方法的建立與應(yīng)用

施遠(yuǎn)國，蔣永青，梁 彤，陳昌毅，李穎鑫，李 繁，柯艷坤，吳寒光，劉國華，何雪玉

(1.深圳市質(zhì)量安全檢驗檢測研究院，廣東 深圳 518000；2.深圳市綠詩源生物技術(shù)有限公司，廣東深圳 518172)

布魯菌病(Brucellosis)簡稱布病，是一種重要的人畜共患傳染病，在全國各地廣為流行，會嚴(yán)重影響畜牧生產(chǎn)與人民群眾的身體健康。妊娠母畜感染該病后，臨床上典型的癥狀是流產(chǎn)，主要發(fā)生在懷孕后期，且主要發(fā)生于頭胎母畜。公畜感染該病后會發(fā)生睪丸炎和附睪炎。布魯菌病一年四季均可發(fā)生，其傳染源主要為發(fā)病畜和帶菌畜。該病主要在家畜間傳播，以牛和羊為主。當(dāng)發(fā)病或帶菌母畜流產(chǎn)、分娩時，布魯菌會隨著流產(chǎn)胎兒、胎衣、羊水和子宮分泌物一起大量排出，成為致病性最強的傳染源[1]。一頭流產(chǎn)或正在分娩的發(fā)病母牛能夠向環(huán)境排放109～1013個布魯菌，這些細(xì)菌可感染60 000～600 000 頭懷孕動物。此外，發(fā)病畜或帶菌畜還會通過乳汁、糞便和尿液排出布魯菌，污染草場、畜舍、飲水、飼料、排水溝等，導(dǎo)致病原菌擴(kuò)散[2]。這些傳染源長期存在于環(huán)境中，導(dǎo)致布魯菌病防控難度加大，長期無法消滅，而且有愈演愈烈之勢。因此，對布魯菌病進(jìn)行準(zhǔn)確診斷，及時切斷傳染源，具有重要的公共衛(wèi)生意義。

目前，我國對布魯菌病防控使用的檢疫方法主要是抗體檢測[3]，但該方法的局限性在于難以判斷單頭畜體是否帶菌、排泄物是否含布魯菌。而布魯菌抗原檢測能方便、快速、準(zhǔn)確地判定流產(chǎn)胎兒、分娩羊水、胎衣與母畜陰道分泌物是否存在布魯菌，對布魯菌病的防控具有巨大的促進(jìn)作用。

因此，本研究利用抗布魯菌脂多糖(lipopolysaccharides，LPS) 的O 鏈C 抗 原的單抗16C5，建立并開發(fā)膠體金免疫層析法，研制出針對布魯菌病的檢測卡，以期用于布魯菌的快速檢測。該方法對被檢樣本量需求少、操作方便、反應(yīng)時間短，適合于廣大基層單位、養(yǎng)殖場及大量檢測樣本的快速初篩，對布魯菌病的防控和凈化具有巨大的促進(jìn)作用。

1 材料與方法

1.1 菌株

小腸結(jié)腸炎耶爾森菌O:9 全菌體，沙門菌O45-2(D 群)、C500(C1 群)和AE616(B 群)，大腸桿菌O157，均由深圳市綠詩源生物技術(shù)有限公司制備并提供。

1.2 主要試劑

布魯菌單克隆抗體16C5 由深圳市綠詩源生物技術(shù)有限公司制備并保存，氯金酸購自Sigma 公司，硝酸纖維素(nitrocellulose，NC) 膜購自Sartrious 科學(xué)儀器(北京) 公司，玻璃纖維購自懷遠(yuǎn)縣通成紙制品有限公司，聚氯乙烯(polyvinyl chloride，PVC)板購自南通浩杰特貿(mào)易有限公司，樣本滴管購自滄州盛豐塑膠制品有限公司，牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA) 購 自Roche公司，吸水紙購自懷遠(yuǎn)縣通成紙制品有限公司，稀釋液購自深圳市金燦華實業(yè)有限公司，布魯菌核酸實時熒光PCR 檢測試劑盒、布魯菌M5-90 疫苗株購自哈爾濱國生生物科技股份有限公司。

1.3 膠體金溶液的制備

取1 mL 1%氯金酸溶液，加入裝有99 mL超純水的錐形瓶中，制成0.01%氯金酸溶液，搖勻后放入智能加熱套內(nèi)加熱至沸騰，迅速加入1.6 mL 的1%檸檬酸三鈉溶液，搖勻，繼續(xù)加熱10 min 左右，直至溶液呈透亮的酒紅色。停止加熱，冷卻至室溫，用超純水恢復(fù)至原體積，分裝到棕色試劑瓶中，置于2～8 ℃下避光保存。

1.4 膠體金標(biāo)記抗體16C5 最佳pH 的測定

取1.5 mL 的透明離心管，采用pH 梯度法，分別加入1 mL 金溶液，再緩慢加入0.2 mol/L的碳酸鉀溶液，將膠體金溶液的pH 依次調(diào)為2.0、3.0、3.5、4.0、4.5 和5.0。隨后，每管分別加入等量的10 μg 布魯菌單抗16C5，調(diào)節(jié)每管單克隆抗體終濃度為10 μg/mL，振蕩混勻，室溫下靜置標(biāo)記20 min；當(dāng)膠體金顏色未出現(xiàn)變化，且碳酸鉀劑量最少時，即為膠體金和抗體16C5 結(jié)合的最佳pH。

1.5 金墊的制備

用金墊處理液浸泡玻璃纖維30 min，取出晾干，隨后置于相對濕度為10%～30%的室溫干燥房中烘干12～16 h。

1.6 噴金

將制備的金標(biāo)布魯菌抗體16C5 注入噴金儀中，調(diào)節(jié)噴金儀的參數(shù)為2.0 μL/cm，將膠體金溶液噴于處理好的玻璃纖維上。

1.7 樣本墊的制備

用樣本墊溶液浸泡玻璃纖維30 min，取出晾干，隨后置于相對濕度為10%～30%的室溫干燥房中烘干12～16 h。

1.8 膠體金試紙卡的制備

將反應(yīng)膜、金墊、樣本墊和吸水墊依次按順序粘貼在PVC 底板上；樣本墊的末端與金墊的始端相連，金墊的末端與反應(yīng)膜的始端相連，反應(yīng)膜的末端與吸水墊的始端相連，且金墊和吸水墊與反應(yīng)膜都有2 mm 的重疊，樣本墊與金墊有2 mm 的重疊。樣本墊的始端與用作底板的PVC 板的始端對齊，吸水墊的末端與用作底板的PVC 板的末端對齊；其中，反應(yīng)膜上有檢測線(T 線) 和質(zhì)控線(C 線)，T 線和C 線的劃線方向均為與長條狀試紙卡的長端相垂直的條狀帶；T 線位于靠近樣本墊末端的一側(cè)；C線位于靠近吸水墊首端的一側(cè)；組裝好的試紙卡如圖1 所示，將試紙卡用機器切成2.8 mm寬的小條，裝在特制的密封袋中，4～30 ℃環(huán)境中保存。

1.9 判定標(biāo)準(zhǔn)

陽性(+)：C、T 線均顯色，表示樣本含有布魯菌(圖2A)；陰性(-)：T 線不顯色，僅C線顯色，表示樣本不含有布魯菌，或其含量低于檢測閾值(圖2B)；無效：C 線不顯色，表明操作不正確，或檢測卡已失效(圖2C、2D)。

1.10 敏感性檢驗

將布魯菌M5-90 疫苗株用稀釋液進(jìn)行10 倍系列稀釋，布魯菌含量為105、106、107、108、109CFU/mL，用制備好的布魯菌抗原檢測試紙卡進(jìn)行檢測，以肉眼能觀察到T 線處有紅色沉淀線的最低布魯菌含量作為布魯菌抗原檢測試紙卡的敏感性。

1.11 特異性試驗

用布魯菌抗原檢測試紙卡分別檢測小腸結(jié)腸炎耶爾森菌O:9 全菌體，沙門菌O45-2(D群)、C500(C1 群)、AE616(B 群)，大腸桿菌O157 和布魯菌M5-90 疫苗株，來評價布魯菌抗原檢測試紙卡的特異性。

1.12 重復(fù)性試驗

用布魯菌抗原檢測試紙卡對布魯菌陽性樣本及陰性樣本分別進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗，每份樣本重復(fù)8 次，比較不同批次間及批次內(nèi)的重復(fù)性結(jié)果。

1.13 符合率試驗

用布魯菌抗原檢測試紙卡檢測臨床采集的18 份樣本，同時用布魯菌核酸實時熒光PCR檢測試劑盒對樣本進(jìn)行復(fù)檢，并比較檢測結(jié)果，評價兩種方法的符合率。

1.14 臨床樣本的檢測

用布魯菌抗原檢測試紙卡檢測某地區(qū)送檢的72 份臨床樣本，確診送檢樣本是否含有布魯菌，分析布魯菌的陽性檢出率。

2 結(jié)果與分析

2.1 膠體金標(biāo)記抗體16C5 最佳pH 的測定

經(jīng)測定，膠體金標(biāo)記抗體16C5 最佳的pH為4.5(圖3)。

2.2 敏感性試驗

當(dāng)布魯菌M5-90 疫苗株稀釋為105CFU/mL時，檢測線處仍呈現(xiàn)肉眼可見的清晰的紅色沉淀線(圖4)，說明本研究制備的試紙卡對布魯菌抗原有較高的敏感性。

圖3 膠體金標(biāo)記抗體16C5 最佳pH 結(jié)果

圖4 布魯菌抗原檢測試紙卡敏感性檢測結(jié)果

2.3 特異性試驗

特異性試驗顯示，布魯菌抗原檢測試紙卡對布魯菌M5-90 疫苗株檢測為陽性(T 線顯色)，而對沙門菌O45-2(D 群)、C500(C1 群)、AE616(B 群)、大腸桿菌O157、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌檢測均為陰性(T 線不顯色)，結(jié)果表明該試紙卡特異性較好(圖5)。

2.4 重復(fù)性試驗

用布魯菌抗原檢測試紙卡對布魯菌陽性樣本和陰性樣本分別進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗，結(jié)果顯示，針對同一份樣本，無論批間還是批內(nèi)，檢測結(jié)果均一致，重復(fù)性為100%，圖6 為批內(nèi)重復(fù)性檢測結(jié)果。因此，本研究建立的布魯菌抗原檢測試紙卡具有良好的重復(fù)性。

圖5 布魯菌抗原檢測試紙卡特異性檢測結(jié)果

圖6 布魯菌抗原檢測試紙卡批內(nèi)重復(fù)性檢測結(jié)果

2.5 符合率試驗

用布魯菌抗原檢測試紙卡臨床檢測18 份樣本，同時用布魯菌核酸實時熒光PCR 檢測試劑盒對樣本進(jìn)行復(fù)檢，比較檢測結(jié)果(表1)。結(jié)果顯示，兩種檢測方法的符合率為94.4%[(12+5)/18]，敏感性為83.3%(5/6)，特異性為100%[(0+12)/12]，表明兩種方法有很高的符合率。

2.6 臨床樣本的檢測

用布魯菌抗原檢測試紙卡檢測某地區(qū)送檢的72 份臨床樣本。結(jié)果顯示，布魯菌陽性樣本2 份，陰性樣本70 份；布魯菌的陽性檢出率為2.8%，表明養(yǎng)殖戶對布魯菌的防控具有很高的認(rèn)知。

3 討論

布魯菌病是一種由布魯菌引起的人畜共患傳染病，遍布全球各地，對畜牧業(yè)和人類公共衛(wèi)生造成了巨大的威脅[4]。目前，在布魯菌病的一般檢測診斷方法中，細(xì)菌分離等方法是檢測布魯菌病的金標(biāo)準(zhǔn)，但是耗時長；酶聯(lián)免疫吸附試驗和一些分子生物學(xué)方法要求有專業(yè)實驗室作為進(jìn)行病原診斷的保障[5-7]。隨著社會的不斷進(jìn)步，人民物質(zhì)生活的不斷豐富，高速的發(fā)展導(dǎo)致進(jìn)出口檢驗檢疫額度不斷增加。這要求研究人員開發(fā)一些新技術(shù)去解決敏感性低、易發(fā)生交叉反應(yīng)、耗時長、不易操作等問題。

本研究利用抗布魯菌LPS 的O 鏈C 抗原的單抗16C5，建立開發(fā)膠體金免疫層析法，研制出針對布魯菌病的檢測試紙卡。該試紙卡與布魯菌核酸實時熒光PCR 檢測試劑盒的符合率為94.4%，敏感性為83.3%，特異性為100%，表明該試紙卡特異性強、敏感性高，能快速檢測出未表現(xiàn)明顯臨床癥狀的感染牛，以切斷布魯菌病的流行和蔓延。布魯菌抗原檢測試紙卡的研制成功為我國布魯菌的控制與根除提供了很好的技術(shù)支持。用制備好的試紙條對某地區(qū)送檢的72 份臨床樣本進(jìn)行布魯菌檢測，結(jié)果顯示布魯菌的陽性檢出率為2.8%，表明養(yǎng)殖戶對布魯菌的防控具有很高的認(rèn)知。

綜上所述，本研究制備的布魯菌抗原檢測試紙卡能夠快速、準(zhǔn)確地檢測感染布魯菌的家畜。建議相關(guān)部門盡快將該方法納入布魯菌病診斷的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中，以提高我國獸醫(yī)的檢測能力，促進(jìn)家畜布魯菌病的防控。