納米脂肪聯(lián)合富血小板血漿治療大鼠壓力性損傷創(chuàng)面的實(shí)驗(yàn)研究

張 銘，于 浩，3，邵 陽(yáng)，宋國(guó)棟，陳銘銳，劉順利

1解放軍第九六〇醫(yī)院燒傷整形科，山東 濟(jì)南 250031；2濟(jì)南市中心醫(yī)院燒傷整復(fù)外科，山東 濟(jì)南 250013；3濰坊醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，山東 濰坊261053

壓力性損傷（PI）是由壓力或壓力聯(lián)合剪切力導(dǎo)致的皮膚和/或皮下組織的局部損傷，通常位于骨隆突處，但有時(shí)也與醫(yī)療器械或其他物體有關(guān)［1,2］。研究發(fā)現(xiàn)PI發(fā)生率逐年增加，遠(yuǎn)超人們想象，已經(jīng)成為家庭及社會(huì)嚴(yán)重的健康問(wèn)題［3,4］。我國(guó)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)顯示，PI患者約占慢性創(chuàng)面住院患者的9.2%［5］，大多數(shù)合并脊髓損傷、四肢癱瘓、外周血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、糖尿病、癌癥、心力衰竭、感覺(jué)麻痹或喪失以及其他限制患者活動(dòng)的疾?。?］。而且PI形成機(jī)制復(fù)雜，影響因素多，易遷延不愈并伴發(fā)感染、竇道，通常不能遵循正常創(chuàng)面愈合過(guò)程，難以依靠單一治療技術(shù)實(shí)現(xiàn)較快治愈，是慢性難愈合創(chuàng)面修復(fù)所面臨的難題之一［7,8］。多種治療技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用是目前臨床治療或改善PI創(chuàng)面的主要趨勢(shì)，但治療技術(shù)怎樣聯(lián)合更優(yōu)化仍需要大量的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用研究來(lái)闡明。

創(chuàng)面修復(fù)是一個(gè)復(fù)雜且有序進(jìn)行的生物過(guò)程，需要多種因素的共同參與，相互調(diào)控，高度協(xié)調(diào)，最終實(shí)現(xiàn)創(chuàng)面愈合［6］。經(jīng)過(guò)研究探索，目前治療PI的技術(shù)有多種［9-12］，其中干細(xì)胞療法及血小板濃縮制品具有較好的前景［13,14］。干細(xì)胞治療創(chuàng)面領(lǐng)域以納米脂肪較為先進(jìn)。納米脂肪富含脂肪干細(xì)胞（ADSCs）及細(xì)胞外基質(zhì)等成分,其中ADSCs具有多重分化及自分泌或旁分泌多種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、炎性因子的生物學(xué)能力，對(duì)創(chuàng)面具有綜合而全面的修復(fù)效果；并且納米脂肪制備工藝筒單、成本低、所需時(shí)間短，已被證明具有組織修復(fù)和再生作用［15］。有研究通過(guò)建立大鼠糖尿病模型［16］，使用自體納米脂肪治療后足全層皮膚缺損創(chuàng)面發(fā)現(xiàn)，納米脂肪處理組比PBS處理組更快實(shí)現(xiàn)創(chuàng)面愈合，可以顯著促進(jìn)創(chuàng)面再上皮化及血管生成。但在實(shí)際應(yīng)用中也存在一些問(wèn)題，例如由于慢性創(chuàng)面局部缺氧或宿主免疫反應(yīng)，ADSCs移植后長(zhǎng)時(shí)間存活率低，嚴(yán)重影響修復(fù)效果［16］。為克服這一問(wèn)題，有學(xué)者研究ADSCs與聯(lián)合治療全層皮膚破損創(chuàng)面，發(fā)現(xiàn)提升創(chuàng)面環(huán)境生長(zhǎng)因子濃度可明顯提高ADSCs的存活率，促進(jìn)血管生成，改善創(chuàng)面血運(yùn)，并能優(yōu)化再上皮化過(guò)程［17］。該研究說(shuō)明提高生長(zhǎng)因子的有效性或者維持生長(zhǎng)因子在體內(nèi)的持續(xù)作用可以使ADSCs 在創(chuàng)面修復(fù)上取得更好的效果，提示將納米脂肪與高濃度生長(zhǎng)因子或生長(zhǎng)因子制品聯(lián)合應(yīng)用于慢性難愈合創(chuàng)面，其中血小板濃縮制品是一良好聯(lián)合選擇。

血小板作為一種多功能細(xì)胞，激活后可釋放多種生長(zhǎng)因子，其濃縮制品已廣泛應(yīng)用于組織損傷修復(fù)領(lǐng)域，以富血小板血漿（PRP）最常見(jiàn)［18,19］。在難愈合PI創(chuàng)面治療中，PRP通過(guò)調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶以及肉芽組織中特定蛋白的表達(dá)，降低白細(xì)胞介素-8、腫瘤壞死因子-α等促炎因子水平，顯著加速創(chuàng)面愈合，縮短治療時(shí)間，且不增加并發(fā)癥［14］。另外PRP在創(chuàng)面修復(fù)領(lǐng)域已經(jīng)得到廣泛認(rèn)可，其除含有高濃度血小板外，還含有大量白細(xì)胞和纖維蛋白，激活后可以大量釋放多種生長(zhǎng)因子，高濃度的白細(xì)胞參與創(chuàng)面的炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)創(chuàng)面的抗感染能力，纖維連接蛋白為創(chuàng)面修復(fù)提供支架，可有效促進(jìn)難愈性創(chuàng)面的愈合［20］。但納米脂肪與PRP在PI創(chuàng)面中的應(yīng)用研究極少，幾乎處于空白階段，因此本研究進(jìn)行基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)，將納米脂肪與PRP聯(lián)合應(yīng)用于PI創(chuàng)面，觀察創(chuàng)面修復(fù)效果，以期獲得良好結(jié)果，豐富PI創(chuàng)面修復(fù)的思路與手段，為臨床應(yīng)用貢獻(xiàn)重要依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)健康雄性SD大鼠46只，其中4周齡40只，8周齡6只，由濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供，許可證號(hào)SCXK（魯）20190003。本研究經(jīng)解放軍第960醫(yī)院科研倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2021科研倫理審第110號(hào)），實(shí)驗(yàn)人員具備山東省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)從業(yè)人員資質(zhì)，所有實(shí)驗(yàn)內(nèi)容均符合中國(guó)倫理委員會(huì)有關(guān)動(dòng)物研究的指導(dǎo)原則。

1.2 主要試劑及儀器

主要試劑：磷酸鹽緩沖溶液（Servicebio），CD31抗體（Servicebio），anti-VEGF（Abcam），anti-MCP-1（Abcam），HRP酶標(biāo)二抗（Servicebio），HE染色試劑盒（Servicebio），Masson染色試劑盒（Servicebio）。

主要儀器：高強(qiáng)度釹鐵硼磁鐵（深圳鑫弘昌磁材有限公司），脂肪乳糜器（上海KIAPL），螺口注射器（鎮(zhèn)江康利醫(yī)療器械有限公司），臺(tái)式離心機(jī)（北京白洋醫(yī)療器械有限公司），凝膠電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 建立PI動(dòng)物模型 缺血再灌注損傷原理是目前PI形成的公認(rèn)機(jī)制［21,22］。參考該機(jī)制，仿照Strong團(tuán)隊(duì)的造模方式［23］，將40只背部備皮后的SD大鼠，于背正中線兩側(cè)相距10 mm處輕輕提起背部皮膚，兩側(cè)對(duì)稱(chēng)放置直徑15 mm、厚度5 mm、磁力2400 Gs的強(qiáng)力磁鐵，作壓迫處理。12 h磁鐵壓迫、12 h釋放為1個(gè)循環(huán)，共3個(gè)循環(huán)。處理后第1、5天取創(chuàng)面及創(chuàng)周組織行HE染色。若第1天皮膚結(jié)構(gòu)破壞，組織水腫，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，第5天出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，組織細(xì)胞變性壞死，即可確認(rèn)PI動(dòng)物模型建立成功（圖1）。

圖1 壓力性損傷模型制備Fig.1 Preparation of the rat model with pressure injury wound.A: Magnet compression treatment.B:Pressure injury wounds on the back of a rat.C:HE staining of normal skin tissue(Original magnification:×40).D:HE staining of wound tissue on the first day after modeling(×40).E:HE staining of wound tissue on day 5 after modeling(×40).

1.3.2 制備納米脂肪 6只供體SD大鼠禁食禁飲8 h后，10%水合氯醛0.4 mL/100 g腹腔注射聯(lián)合異氟醚吸入麻醉成功，仰臥位固定大鼠四肢。雙側(cè)腹股溝區(qū)備皮、消毒后剪開(kāi)腹股溝處皮膚分離出皮下脂肪墊，放入預(yù)冷PBS中，剔除血管筋膜，洗滌3遍后充分剪碎，將剪碎的脂肪放入15 mL離心管中以800 g離心5 min，收集離心后的上層脂肪至10 mL螺口注射器內(nèi)，另一10 mL螺口注射器通過(guò)脂肪糜化器與其相連，反復(fù)推擠30次進(jìn)行乳化，再通過(guò)0.8 mm過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾，得到可以通過(guò)27G針頭注射的乳糜液即為納米脂肪［24］（圖2）。

圖2 納米脂肪的制備Fig.2 Preparation of nanofat.A:Extraction of inguinal fat from SD rats.B:Inguinal fat.C:Inguinal fat shearing.D: Adipose tissue after centrifugation.E: Emulsification through fat chime.F: Successfully prepared nanofat.

1.3.3 制備PRP 同法麻醉6只供體SD大鼠后，腹部備皮、消毒，仰臥位固定。無(wú)菌條件下打開(kāi)腹腔，充分暴露腹主動(dòng)脈，抗凝化的穿刺針輕柔勻速抽出血液，并立即注入2 mL枸櫞酸鈉真空采集管中，SD大鼠采血后采用過(guò)量麻醉法處死。將采取的SD大鼠全血分別留取1 mL，其余血液采用兩次離心法分離提取PRP［25］（圖3）。

圖3 兩次離心法分離提取PRPFig.3 Preparation of platelet-rich plasma (PRP) through centrifugation.A: Whole blood before centrifugation.B:After first centrifugation.C:After the second centrifugation.D:Final PRP.

1.3.4 創(chuàng)面處理 于造模成功后第1天，根據(jù)創(chuàng)面處理方式，NP組給予0.3 mL納米脂肪+0.3 mL PRP；N組給予0.3 mL納米脂肪+0.3 mL PBS；P組給予0.3 mL PRP+0.3 mL PBS；C組給予0.6 mLPBS處理，均采取創(chuàng)緣上下左右4點(diǎn)及中央基底部平均注射，處理后外敷無(wú)菌敷貼，包扎固定。

1.3.5 創(chuàng)面取材 創(chuàng)面處理后第5、10、14天按隨機(jī)數(shù)字表法每組抽取2只SD大鼠，上述方法麻醉后，在距創(chuàng)緣外2 mm處切取創(chuàng)周及全部創(chuàng)面組織。

1.3.6 創(chuàng)面愈合情況 創(chuàng)面處理后第1、3、5、7、10、14天拍照，運(yùn)用Image J軟件測(cè)量創(chuàng)面面積，計(jì)算創(chuàng)面愈合率。創(chuàng)面愈合率=（原始創(chuàng)面面積-剩余創(chuàng)面面積/原始創(chuàng)面面積）×100%。

1.3.7 HE染色 將創(chuàng)面標(biāo)本制備成厚度為5 μm的石蠟切片。再經(jīng)過(guò)脫蠟至水，行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察創(chuàng)面組織炎性反應(yīng)情況及結(jié)構(gòu)變化。

1.3.8 Masson 染色 創(chuàng)面標(biāo)本石蠟切片脫蠟至水，Masson染色試劑盒步驟染色，鏡檢并采集圖像，觀察創(chuàng)面膠原沉積及排列情況，并運(yùn)用Image J軟件計(jì)算各組創(chuàng)面的膠原相對(duì)表達(dá)量。每張切片在顯微鏡高倍鏡下（×400）隨機(jī)選擇5個(gè)視野，應(yīng)用Image J軟件計(jì)算膠原相對(duì)表達(dá)量，相對(duì)膠原表達(dá)量=（藍(lán)染的膠原纖維面積/視野總面積）×100%。

1.3.9 CD31、MCP-1免疫組織化學(xué)染色 創(chuàng)面標(biāo)本石蠟切片脫蠟復(fù)水，水洗后EDTA抗原修復(fù)，3%過(guò)氧化氫溶液消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，血清封閉后一抗anti-CD31（1∶300稀釋?zhuān)珿B113151）、anti-MCP-1（1∶2000稀釋?zhuān)琣b7202/R）孵育，放入濕盒內(nèi)4 ℃過(guò)夜。去除一抗后PBS沖洗，滴加二抗（HRP標(biāo)記）37 ℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹(shù)膠封片鏡檢。顯微鏡下觀察并隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡（×400）下不重疊的視野，計(jì)數(shù)新生血管數(shù)目以及MCP-1陽(yáng)性表達(dá)情況。

1.3.10 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè) 將創(chuàng)面標(biāo)本置于研缽中，剪碎、研磨至粉末狀，冰上裂解30 min后離心，收集上清液，BCA法測(cè)試樣本蛋白濃度。測(cè)定后PBS稀釋?zhuān)c上樣緩沖液混合，100 ℃變性5 min。制備分離膠及濃縮膠，置于電泳槽中后上樣，先在80 V恒壓下電泳至溴酚藍(lán)染料從濃縮膠進(jìn)入分離膠，再將電流調(diào)至120 V恒壓繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)達(dá)凝膠底部為止。轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉，一抗anti-VEGF（1∶2000 稀釋?zhuān)琣b7202）、內(nèi)參抗體GAPDH（1∶1000稀釋?zhuān)琓A-08）4 ℃孵育過(guò)夜。棄去一抗，TBST搖床洗滌，加入二抗孵育60 min，再洗滌，ECL化學(xué)發(fā)光成像，采集圖像分析。運(yùn)用Image J圖像分析軟件對(duì)獲得每個(gè)特異性條帶積分灰度進(jìn)行半定量分析，目的條帶量分別除以其內(nèi)參條帶量，得到的數(shù)值即為內(nèi)參校正后的各樣品中目的蛋白相對(duì)含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。資料符合正態(tài)分布時(shí)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，不符合正態(tài)分布用四分位數(shù)表示。各組符合正態(tài)分布且方差齊時(shí)，組間比較采用方差分析檢驗(yàn)，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)；各組不符合正態(tài)分布或方差不齊時(shí)，組間比較采用Kruskalwallis 非參數(shù)檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PRP血小板計(jì)數(shù)

PRP 中血小板計(jì)數(shù)為（2219.3±312.5）×109/L，正常血血小板計(jì)數(shù)約為（360.6±62.1）×109/L，達(dá)到PRP制備要求。

2.2 創(chuàng)面愈合觀察

NP組SD大鼠背部PI創(chuàng)面痂皮脫落時(shí)間短于其他3組，處理后第5天即出現(xiàn)少部分脫落，創(chuàng)面愈合快。處理后第3、5、7、10、14天，NP組創(chuàng)面愈合率均明顯高于C組（圖4）。第7、10、14天創(chuàng)面愈合率高于N組及P組；第10、14天N組、P組高于C組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。整個(gè)觀察期間，N組、P組創(chuàng)面愈合率大致相同，兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表1）。

表1 各組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)壓力性損傷創(chuàng)面愈合率的比較Tab.1 Comparison of wound healing rates among the groups at each time point(%,Mean±SD)

圖4 各處理組大鼠壓力性損傷創(chuàng)面愈合情況觀察Fig.4 Gross observation of pressure injury wound healing in each treatment group.Wound healing was better in NP group than in N group,P group and control group at all the time points.

2.3 組織學(xué)檢測(cè)

2.3.1 HE染色 根據(jù)HE染色結(jié)果，第5天NP組可見(jiàn)部分痂皮脫落，皮下組織疏松，可見(jiàn)壞死組織溶解形成的不規(guī)則空泡，周?chē)罅垦仔约?xì)胞聚集，其余各組痂皮未脫落，N組、P組真皮層及肌層可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，C組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)不明顯，皮下組織可見(jiàn)明顯空腔。第10天，NP組、N組及P組痂皮已脫落，肉芽組織生長(zhǎng)，真皮層增厚且較前致密，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較前減輕，可見(jiàn)脂肪細(xì)胞及新生血管形成，而C組痂皮未完全脫落，皮下組織疏松，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯。第14天，NP組表皮再生，部分角化，真皮增厚，表皮與真皮連接致密，可見(jiàn)部分皮膚附屬器及脂肪細(xì)胞形成，纖維組織排列較其他組有序，N組、P組亦可見(jiàn)表皮再生，與真皮層連接尚可，可見(jiàn)新生脂肪細(xì)胞，未見(jiàn)明顯皮膚附屬器新生，纖維組織排列不齊，C組部分創(chuàng)面仍未上皮化，真皮層增厚程度較其余3組輕，組織層次不明顯，連接疏松，纖維組織排列紊亂（圖5）。

2.3.2 Masson染色 第5天，NP組、N組、P組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較C組明顯，NP組膠原沉積較其他3組具有顯著差異（P＜0.05）。第10天，NP組膠原沉積量明顯增加，主要位于真皮深層及皮下組織，局部呈團(tuán)塊狀，排列趨向有序，較其余組具有顯著差異（P＜0.05），N組及P組膠原沉積量均較前明顯增加，較C組差異明顯（P＜0.05）。第14天，NP組膠原沉積較多，呈條索樣，排列有序，較其他3組具有顯著差異（P＜0.05），N組、P組膠原沉積較前增多，局部呈團(tuán)塊或條索樣，排列趨向有序，較C組差異明顯（P＜0.05，表2），C組膠原沉積較前明顯增多，但排列紊亂、松散（圖6）。

2.4 免疫組織化學(xué)染色

2.4.1 CD31免疫組化 第5天，NP組PI創(chuàng)面可見(jiàn)明顯管腔結(jié)構(gòu)，成形的微血管數(shù)目較其他3組多（P＜0.05），N組、P組也可見(jiàn)染色陽(yáng)性的內(nèi)皮細(xì)胞，多數(shù)呈血管結(jié)構(gòu)（圖7），兩組新生血管數(shù)目大致相同，與C 組比較均具有明顯差異（P＜0.05）。第10天，各組創(chuàng)面新生血管數(shù)目均明顯增多，以NP組最多，C組新生血管數(shù)目最少（P＜0.05）。第14天，各組創(chuàng)面新生血管數(shù)目均較前減少，但NP組血管數(shù)目仍居首位，與其余組具有明顯差異（P＜0.05），N組、P組較C組的血管數(shù)目差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖8）。

圖7 各組不同處理后第5、10、14天壓力性損傷CD31免疫組化檢測(cè)創(chuàng)面血管新生情況Fig.7 Immunohistochemistry for CD31 for detecting wound angiogenesis on the 5th,10th and 14th days in each group(×40,×400).On the 5th,10th and 14th days after treatment,the number of angiogenesis was the highest in NP group,similar between N group and P group,and was the lowest in the control group.

圖8 不同時(shí)間點(diǎn)各組壓力性損傷創(chuàng)面血管新生情況Fig.8 Angiogenesis of pressure injury wounds in each group at different time points.*P＜0.05.

2.4.2 MCP-1免疫組化 第5天，單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）免疫組化結(jié)果顯示：4 組均可見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)（圖9）。NP組MCP-1相對(duì)表達(dá)量高于其余3組（P＜0.05），N組、P組相對(duì)表達(dá)量大致相同，均高于C組（P＜0.05，圖10）。

圖9 處理后第5天各組壓力性損傷創(chuàng)面MCP-1免疫組化檢測(cè)炎性反應(yīng)情況Fig.9 Immunohistochemistry for MCP-1 for assessing inflammation in the wounds in each group on the 5th day after treatment(×40,×400).The expression of MCP-1 was the highest in NP group,similar between N group and P group,and the lowest in C group.

圖10 處理后第5天各組壓力性損傷創(chuàng)面MCP-1表達(dá)情況Fig.10 Expression of MCP-1 in pressure injury wounds of each group on the 5th day after treatment.*P＜0.05.

2.5 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)

第5天，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，NP組VEGF表達(dá)高于其余組（P＜0.05）。第10天，NP組VEGF表達(dá)仍高于其他3組（P＜0.05），N組表達(dá)比P組弱，與C組大致相同。處理后第14天，NP組VEGF表達(dá)依舊高于其余3組，N組與P組趨于一致，但均與C組比較有明顯差異（P＜0.05），C組表達(dá)最少（圖11）。

圖11 不同時(shí)間點(diǎn)各組壓力性損傷創(chuàng)面血管生長(zhǎng)因子表達(dá)情況Fig.11 Expression of vascular growth factor in pressure injury wounds of each group at different time points.*P＜0.05.

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NP組創(chuàng)面愈合速度明顯快于其余3組，可能源于納米脂肪聯(lián)合PRP治療時(shí)，ADSCs依托納米脂肪的ECM成分、PRP的纖維蛋白結(jié)構(gòu)，可以更穩(wěn)定的保留并更早的發(fā)揮作用。此外，PRP中血小板激活也可分泌大量細(xì)胞因子，如VEGF、血小板源性生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、白細(xì)胞介素等，促進(jìn)細(xì)胞增殖、新生血管形成、軟組織修復(fù)以及間充質(zhì)干細(xì)胞分化，加速創(chuàng)面愈合［26］。創(chuàng)面表面觀察及HE染色顯示，創(chuàng)面愈合早期注射納米脂肪、PRP后，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較對(duì)照組明顯，痂皮較快脫落。這一方面源于注射納米脂肪后，其中的油脂、液體成分以及ECM等成分引起創(chuàng)面組織發(fā)生生物學(xué)反應(yīng)，引起單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞大量增殖；另一方面是PRP中本身含有高濃度的白細(xì)胞，能夠調(diào)控創(chuàng)面組織的炎性反應(yīng)，增強(qiáng)抗感染能力［27,28］。

Masson染色發(fā)現(xiàn)，NP組膠原相對(duì)表達(dá)量高于其余組，且排列更有序。這與雷肖璇等［29］實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的，該實(shí)驗(yàn)將人ADSCs聯(lián)合PRP治療組小鼠皮膚全層損傷創(chuàng)面，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合組有較多新生膠原纖維，單純ADSCs及對(duì)照組創(chuàng)面組織中膠原纖維較少，但單純應(yīng)用納米脂肪、PRP也具有一定促進(jìn)作用。納米脂肪聯(lián)合PRP治療PI創(chuàng)面，其中的ADSCs依托PRP持續(xù)、均勻地釋放各種生長(zhǎng)因子，更好地向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，增加ECM和膠原的合成，有利于創(chuàng)面愈合。有研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs聯(lián)合PRP應(yīng)用于糖尿病足潰瘍創(chuàng)面時(shí)，能夠顯著促進(jìn)肉芽組織形成及膠原表達(dá)，這與調(diào)控Notch信號(hào)通路有關(guān)；此外，該通路還能積極調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、血管生成及炎性反應(yīng)，促進(jìn)創(chuàng)面愈合［30］。本實(shí)驗(yàn)納米脂肪聯(lián)合PRP治療促進(jìn)PI創(chuàng)面膠原表達(dá)的具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)中MCP-1免疫組化檢測(cè)顯示，第5天NP組PI創(chuàng)面單核細(xì)胞趨化因子表達(dá)最高，N組及P組次之，C組最低。MCP-1是創(chuàng)面修復(fù)早期潛在的重要介質(zhì)之一，對(duì)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞向創(chuàng)面募集有關(guān)鍵作用［31］。這與創(chuàng)面處理后第5天標(biāo)本HE染色觀察到的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況是一致的，說(shuō)明納米脂肪、PRP 均可通過(guò)促進(jìn)MCP-1表達(dá)，適當(dāng)增強(qiáng)PI創(chuàng)面愈合早期炎性反應(yīng)，有助于創(chuàng)面修復(fù)，而且兩者聯(lián)合效果更佳。

VEGF被認(rèn)為是促進(jìn)創(chuàng)面血管生成最常見(jiàn)、最有效的因子，與其受體VEGF-R結(jié)合，可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，分化為功能性血管［32］。本實(shí)驗(yàn)中VEGF蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)表明納米脂肪聯(lián)合PRP應(yīng)用，與其余3組比較，可以顯著促進(jìn)PI創(chuàng)面VEGF表達(dá)，有利于血管生成，為創(chuàng)面修復(fù)提供充足的氧氣及營(yíng)養(yǎng)，加速創(chuàng)面愈合。VEGF蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果與CD31免疫組化結(jié)果交相呼應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同處理的大鼠PI 創(chuàng)面進(jìn)行CD31免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)納米脂肪聯(lián)合PRP治療的PI創(chuàng)面血管新生情況優(yōu)于其余組，新生血管數(shù)目顯著高于單獨(dú)應(yīng)用納米脂肪、PRP以及PBS處理組，這與VEGF的功能有關(guān)。VEGF激活金屬蛋白激酶，活化成血管細(xì)胞遷移、分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，形成新生血管，亦可作為中間介質(zhì)，介導(dǎo)一些細(xì)胞成分、細(xì)胞因子發(fā)揮作用，促進(jìn)血管生成，對(duì)于創(chuàng)面修復(fù)具有重要作用［33］。

綜上所述，與單純納米脂肪、單純PRP以及PBS處理組比較，納米脂肪聯(lián)合PRP治療PI創(chuàng)面，相同時(shí)間具有更高的創(chuàng)面愈合率，皮膚結(jié)構(gòu)恢復(fù)速度更快，膠原表達(dá)量更多，也可以通過(guò)增強(qiáng)創(chuàng)面VEGF的表達(dá)，促進(jìn)創(chuàng)面血管新生，重建創(chuàng)面血運(yùn)，兩者具有明顯協(xié)同作用。