甲基化酶WTAP通過調(diào)控FOXO1的表達參與腎缺血再灌注損傷

趙剛剛，李華鋒，張鴻毅，肖克兵，楊 輝，李子峰，傅崇德

1西安醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院泌尿外科，陜西 西安 710000；2西安航天總醫(yī)院泌尿外科，陜西 西安710100

急性腎損傷（AKI）是一種常見的腎功能突然喪失的臨床綜合癥，表現(xiàn)為血清肌酐顯著升高和尿量迅速減少，最終可逐漸發(fā)展為慢性腎病和終末期腎病，重癥患者可導致死亡［1］。腎臟缺血再灌注損傷（I/RI）是導致AKI的主要原因之一，在過去的幾十年里，有關(guān)腎臟的I/R損傷在該領(lǐng)域得到了廣泛的研究［2］。然而，腎臟I/RI的發(fā)病機制十分復雜，尚未完全闡明［3,4］。因此，更為透徹地了解腎I/RI的病理生理反應對預防和治療AKI具有重要的意義。

N6-甲基腺甘氨酸（m6A）是mRNA修飾物中含量最多的一種，存在于整個轉(zhuǎn)錄組四分之一的RNA中［5,6］，與各種生物過程有關(guān)如干細胞增殖與分化、心臟肥厚、DNA損傷和腫瘤發(fā)生等［7］，而這種RNA修飾在AKI和I/RI中的功能作用和調(diào)控機制研究較少。Wilms瘤1-相關(guān)蛋白（WTAP）是一種重要的m6A甲基化酶，可通過調(diào)節(jié)mRNA修飾來影響基因表達。WTAP在膀胱癌、急性髓系白血病等多種疾病中參與調(diào)控增殖、凋亡等過程［8,9］。值得注意的是，WTAP通過調(diào)節(jié)ATF4 mRNA的m6A修飾增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，促進了心肌I/R損傷［10］，但WTAP在AKI和腎I/R損傷中的作用目前仍未見報道。

叉頭蛋白O1（FOXO1）是叉頭轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，在哺乳動物中廣泛表達，具有調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡、自噬、氧化應激和能量代謝等功能［11］。FOXO1已被證明在腎I/R損傷中高表達，促進了線粒體相關(guān)的細胞凋亡，在維持腎小管上皮細胞線粒體功能發(fā)揮關(guān)鍵作用［12］。有關(guān)FOXO1的m6A修飾研究較少，有報道稱METTL14通過增加FOXO1的m6A修飾加重內(nèi)皮細胞炎癥和動脈粥樣硬化［13］。但FOXO1的m6A修飾在腎I/R損傷中的作用仍未見研究。

因此，本項目通過構(gòu)建腎I/R損傷小鼠模型和缺氧/復氧（H/R）誘導的腎小管上皮細胞損傷模型，體內(nèi)外探討WTAP介導的m6A修飾在腎I/R損傷中的作用，并明確該作用是否與調(diào)控FOXO1表達有關(guān)，旨在為腎I/R損傷和AKI的防治提供新的分子靶點。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物和細胞 實驗所用C57BL/6J小鼠購自空軍軍醫(yī)大學動物實驗中心；將6～8周齡小鼠常規(guī)條件下飼養(yǎng)，自由進食和飲水，實驗前禁食12 h，自由飲水；所有動物實驗經(jīng)西安醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準（XYYFY2022LSDW-001），實驗過程遵循“3R”原則；人腎小管上皮細胞（HK-2細胞）購自ATCC細胞庫。

1.1.2 主要試劑和儀器 凋亡（TUNEL）檢測試劑盒（南京諾唯贊醫(yī)療科技有限公司）；尿素氮（BUN）及血肌酐（Scr）試劑盒（南京建成科技有限公司）；m6A甲基化水平檢測試劑盒（武漢艾美捷科技有限公司）；CCK-8試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green混合液（TaKaRa）；蛋白裂解液和BCA蛋白定量檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；10%PAGE 凝膠劑盒（上海雅酶生物科技有限公司）；ECL 化學發(fā)光底物（西安米鼠生物科技有限公司）；m6A、WTAP、FOXO1、GAPDH 抗 體（ProteinTech）；LDH檢測試劑盒（南京諾唯贊醫(yī)療科技有限公司）。小動物麻醉系統(tǒng)（瑞沃德生命科技有限公司）；全自動血生化分析儀（中山新銳醫(yī)療設備科技公司）；實時定量PCR儀（蘇州雅睿生物技術(shù)有限公司）；化學發(fā)光機（北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司）；電泳儀、多功能酶標儀和凝膠成像分析儀（Bio-Rad）；倒置顯微鏡（上海維翰光電科技有限公司）；細胞培養(yǎng)箱（北京五洲東方科技發(fā)展有限公司）；厭氧箱（上海龍躍儀器設備有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 FOXO1 的甲基化位點預測 從NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）得到FOXO1的mRNA FASTA序列，將此序列復制到SRAMP（http://www.cuilab.cn/sramp/）網(wǎng)站“Predition”閱讀框內(nèi)，點擊“submit”進行預測。

1.2.2 腎I/R損傷模型的構(gòu)建 選取16只雄性C57BL/6J小鼠（6～8 周，體質(zhì)量20～25 g），隨機分為假手術(shù)組（Sham）和腎臟缺血再灌注損傷組（I/R），每組8只小鼠；所有小鼠在造模前12 h 禁飲禁食；術(shù)前先稱量小鼠體質(zhì)量，并進行記錄；2%異氟烷麻醉（固定過程流量為3 L/min）；造模過程（1.5 L/min）進行麻醉，并行右腎切除術(shù)，然后用無損傷血管夾阻斷左腎動靜脈45 min，隨后恢復左腎動靜脈血流，建立腎臟缺血再灌注模型。整個建模過程中善待小鼠，熟練操作，最大限度減少對小鼠的傷害。

1.2.3 樣本收集 造模后24 h，采用苯巴比妥鈉腹腔注射麻醉，行腹部正中切口，切取左腎，將腎臟組織縱行剖開，一半放入4%多聚甲醛液中固定，另外一半再分成兩份，一份用于組織染色使用，另一份放入凍存管中并放入液氮罐保存。取材時極盡小鼠最大科研價值，結(jié)束后立即用CO2安樂死的方式處死小鼠，減輕其痛苦。

1.2.4 腎功能檢測 收集各組小鼠血液，分離血清后用根據(jù)試劑盒說明書，采用比色法，用全自動生化分析儀檢測肌酐及尿素氮水平。

1.2.5 腎組織病理學檢測 腎組織病理學檢測取各組小鼠腎組織4%甲醛固定48 h后石蠟包埋制作切片，切片厚度大約為5 μm，進行HE染色，在200倍熒光顯微鏡下觀察腎組織損傷情況。

1.2.6 免疫組織化學染色 包埋、切片和脫水同HE染色步驟。將3%雙氧水滴加于切片上，37℃阻斷內(nèi)源性過氧化物酶20 min；流水沖洗20 min；將切片浸沒在現(xiàn)配的檸檬酸鈉中進行抗原修復（微波爐高火6 min；中高火13 min）；自然晾至室溫；使用5%山羊血清室溫封閉15 min；吸去多余血清，滴加一抗，室溫過夜；PBS洗切片（3 次/5 min）；滴加二抗，37 ℃孵育40 min；PBS 洗切片（3次/5 min）；DAB顯色液滴加于切片上（顯色0.5～3 min）；鏡下控制，著色深立即終止；流水沖洗10 min；蘇木精染核3～5 min，自來水沖洗5 min；0.5%的鹽酸酒精分化1 s，自來水沖洗2 min：1%氨水返藍3 min，流水沖洗5 min；脫水封片步驟同HE染色，最后顯微鏡下拍照。

1.2.7 細胞凋亡染色 根據(jù)TUNEL 染色試劑盒說明書操作。4，6－二脒基－2－苯基吲哚二鹽酸鹽（DAPI）所染細胞核在紫外激發(fā)波下呈藍色（即為視野所見所有腎小管上皮細胞），陽性凋亡細胞核為綠色。使用Eclipse Ci-L熒光拍照顯微鏡選取切片的目的區(qū)域進行200倍成像。成像完成后使用Image-Pro Plus 6.0分析軟件，分別測量每張切片5個視野中陽性細胞數(shù)以及對應的總細胞數(shù)，并計算出陽性率（%）=陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.2.8 qRT-PCR法檢測mRNA水平 收集的組織/細胞用TRIZOL提取總RNA。TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA；然后根據(jù)實時定量PCR試劑盒說明書配制PCR反應體系，程序為：95 ℃預變性30 s，（95 ℃變性5 s，60 ℃延伸30 s）×40個循環(huán)，GAPDH作為內(nèi)參，2-△△Ct法計算基因表達水平。

1.2.9 Western blot法檢測蛋白表達情況 RIPA裂解液提取總蛋白。BCA試劑盒定量蛋白濃度。上樣進行聚丙烯酰氨凝膠電泳（80 V，30 min；120 V，60 min），300 mA電流轉(zhuǎn)膜90 min，50 g/L脫脂牛奶封閉1 h。孵育相應一抗進行4 ℃過夜；TBST 清洗后，室溫孵育二抗1 h；TBST清洗3次后進行顯影并拍照。

1.2.10 HK-2細胞H/R模型構(gòu)建和轉(zhuǎn)染 人腎小管上皮細胞株（HK-2）細胞用新鮮的含10%FBS 的DMEM/F12（1∶1）完全培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，選對數(shù)生長期的細胞根據(jù)實驗分組均勻鋪板。

HK-2細胞H/R模型構(gòu)建：細胞分為Control組和H/R組待細胞完全貼壁后，棄去培養(yǎng)液，加入不含F(xiàn)BS的無糖培養(yǎng)基，放入?yún)捬跸渲腥毖?4 h，除去細胞缺氧液，加入新鮮的DMEM/F12完全培養(yǎng)基于CO2細胞培養(yǎng)箱中復氧培養(yǎng)6 h。

細胞轉(zhuǎn)染：細胞以5×104/孔鋪于6 孔細胞培養(yǎng)板，待細胞貼壁長至70%左右時，換成無血清培養(yǎng)基，將Lipofectamine?2000 轉(zhuǎn)染試劑和si-NC、si-WTAP干擾片段混勻靜置5～10 min，將混合液體均勻加入每個孔中，4～6 h后進行換液，繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h后，收集細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.11 HK-2細胞活性檢測 將各組細胞懸液分別接種于96孔板中，每孔中含5×103個細胞，培養(yǎng)2～4 h后，設空白孔（完全培基和CCK-8總體積110 μL）和對照孔（含正常培養(yǎng)細胞、完全培基和CCK-8，總體積110 μL），周邊各孔加100 μL去離子水減少邊緣效應，各組細胞均處理完成后，在各孔中斜貼培養(yǎng)板滴加CCK-8 溶液10 μL，然后于37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～4 h（根據(jù)顯色情況調(diào)整時間），用酶標儀檢測各孔的A450nm值判斷細胞活性。

1.2.12 HK-2細胞培養(yǎng)液LDH釋放水平檢測 吸取各組細胞培養(yǎng)液500 μL，每組設置兩組重復，全自動血生化儀進行檢測。

1.2.13 Caspase3 活性檢測 收集細胞樣本后根據(jù)Abcam試劑盒說明書進行檢測。

1.2.14 甲基化RNA免疫共沉淀后實時定量PCR（Me-RIP qPCR）RNA 提取試劑盒提取總RNA，PolyA mRNA 純化試劑盒純化提取的總RNA。將小鼠抗人m6A 抗體和IgG 的抗體分別添加到免疫共沉淀（IP）緩沖液中，并與蛋白質(zhì)A/G 磁珠孵育1 h進行結(jié)合。然后將純化的mRNA以及磁珠-抗體復合物加入到含有核糖核酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的IP緩沖液中，于4℃下孵育過夜。將使用洗脫緩沖液洗脫下的RNA，用苯酚-氯仿法提取、純化后，用實時定量PCR分析。

1.2.15 統(tǒng)計學分析 所有數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism8.0.2軟件進行統(tǒng)計分析，每種實驗至少重復3 次，實驗結(jié)果以均數(shù)±標準差表示，兩組之間的比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠腎I/R損傷組織中WTAP的表達上調(diào)

全自動血生化分析儀檢測了小鼠腎I/R損傷后的血清肌酐和血尿素氮的水平，與sham組相比，I/R組血清肌酐、尿素氮顯著升高（P＜0.001，圖1A、B）；HE染色結(jié)果顯示，與sham組相比，I/R組腎組織產(chǎn)生病理性改變，表現(xiàn)為腎小球皺縮，腎小囊腔和腎小管腔擴張，上皮細胞腫脹壞死，細胞核缺失，細胞碎片堆積（圖1C）；qRT-PCR 結(jié)果顯示，與sham 組比較，I/R 組WTAP 的mRNA水平顯著升高（P＜0.001，圖1D）；Western blot結(jié)果顯示，與sham組比較，I/R組WTAP蛋白的表達水平顯著上升（P＜0.001，圖1E）；IHC結(jié)果顯示I/R后WTAP陽性面積顯著增多（圖1F）。

圖1 WTAP在小鼠腎I/R損傷組織中的表達情況Fig.1 Expression of WTAP in mouse renal I/R injury tissues.A: Serum creatinine level in mice with renal I/R injury.B: Blood urea nitrogen level in mice with renal I/R injury.C: Pathological changes of the kidney in mice with renal I/R injury(HE staining,original magnification:×400).D:WTAP mRNA level in the kidney of mice with renal I/R injury.E:Changes of WTAP protein expression after renal I/R injury in mice.F:Expression of WTAP after renal I/R injury in mice(IHC,×200).***P＜0.001.

2.2 HK-2細胞H/R損傷后WTAP表達上調(diào)

CCK-8細胞活性檢測結(jié)果顯示，與Control組比較，H/R組細胞活性顯著降低（P＜0.01，圖2A）；全自動血生化儀檢測了細胞培養(yǎng)液中LDH的釋放水平，與Control組比較，H/R組LDH的釋放水平顯著降低（P＜0.001，圖2B）；qRT-PCR檢測了WTAP的mRNA水平，結(jié)果顯示，與Control組比較，H/R組WTAP的mRNA水平顯著升高（P＜0.001，圖2C）；Western blot結(jié)果顯示，與Control組比較，H/R 組WTAP 蛋白水平顯著升高（P＜0.001，圖2D）。

圖2 WTAP在HK-2細胞H/R損傷中的表達情況Fig.2 Expression of WTAP in HK-2 cells with H/R injury.A:Changes of HK-2 cell viability after H/R injury.B:LDH release in HK-2 cells after H/R injury.C:WTAP mRNA level in HK-2 cells with H/R injury.D:Protein expression level of WTAP in HK-2 cells with H/R injury.**P＜0.01,***P＜0.001.

2.3 體外證明沉默WTAP對HK-2細胞H/R損傷作用的影響

通過轉(zhuǎn)染siRNA對WTAP進行沉默，qRT-PCR鑒定干擾效果。與si-NC+H/R組相比，si-WTAP+H/R組WTAP的mRNA著降低（P＜0.0001，圖3A）；與si-NC+H/R組相比，si-WTAP+H/R組WTAP蛋白水平顯著降低（P＜0.0001，圖3B、C）；細胞活性結(jié)果顯示，與si-NC+H/R組相比，si-WTAP+H/R組細胞活性顯著升高（P＜0.01，圖3D）。TUNEL染色結(jié)果顯示，與si-NC+H/R組相比，si-WTAP+H/R組細胞凋亡率顯著降低（P＜0.01，圖3E、F）；Caspase-3活性結(jié)果顯示，與si-NC+H/R組相比，si-WTAP+H/R組Caspase-3活性顯著降低（P＜0.001，圖3G）。與si-NC+H/R組相比，si-WTAP+H/R組LDH釋放水平顯著降低（P＜0.001，圖3H）。

圖3 沉默WTAP對HK-2細胞H/R損傷的影響Fig.3 Effect of WTAP silencing on cell damage in HK-2 cells with H/R exposure.A:WTAP mRNAexpression level in HK-2 cells with H/R injury after WTAP silencing.B,C: Protein expression level of WTAP in HK-2 cells with H/R injury after WTAP silencing.D:Cell viability changes in HK-2 cells with H/R injury after WTAP silencing.E:TUNEL staining of HK-2 cells with H/R injury after WTAP silencing(×200).F:Statistical diagram of HK-2 cells with H/R injury by TUNEL staining after WTAP silencing.G:Changes of Caspase3 activity in HK-2 cell with H/R injury after WTAP silencing.H:LDH release in HK-2 cells with H/R injury after WTAP silencing.**P＜0.01,***P＜0.001,****P＜0.0001.

2.4 小鼠腎I/R 損傷組織和HK-2 細胞H/R 損傷中FOXO1 的mRNA和蛋白表達上調(diào)

與Sham組相比，在腎I/R損傷組織中，F(xiàn)OXO1的mRNA和蛋白的表達水平都顯著升高（P＜0.001，圖4A、B）；IHC 結(jié)果顯示I/R 后，F(xiàn)OXO1 陽性面積較多（圖4C）；與Control組相比，H/R組細胞中FOXO1的mRNA和蛋白的表達水平也顯著升高（P＜0.001，圖4D、E）。

圖4 FOXO1在小鼠腎組織I/R損傷和HK-2細胞H/R損傷中的表達情況Fig.4 FOXO1 expression in renal tissue of mice with I/R injury and in HK-2 cells with H/R injury.A: FOXO1 mRNA level in mouse renal tissue.B:FOXO1 protein expression in mouse renal tissue.C:Expression of FOXO1 in mice after renal I/R injury(IHC,×400).D:FOXO1 mRNA level in HK-2 cells with H/R injury.E:Changes of FOXO1 protein expression in HK-2 cells with H/R injury.***P＜0.001,****P＜0.0001.

2.5 WTAP可直接作用于FOXO1 mRNA并與m6A調(diào)控有關(guān)

首先根據(jù)SRAMP（http://www.cuilab.cn/sramp/）網(wǎng)站預測可知，F(xiàn)OXO1具有多個m6A甲基化位點（圖5A）。與si-NC+H/R組相比，si-WTAP+H/R組FOXO1 mRNA和蛋白水平都顯著下降（P＜0.01圖5B、C）；RIPqPCR 檢測結(jié)果顯示，與IgG 組相比，WTAP 抗體組FOXO1 的mRNA 水平顯著上升（P＜0.05，圖5D）；MeRIP-qPCR 結(jié)果顯示，與si-NC+H/R 組相比，si-WTAP+H/R 組m6A-FOXO1 水平顯著降低（P＜0.001，圖5E）。

圖5 WTAP通過FOXO1發(fā)揮作用及其m6A水平Fig.5 WTAP functions through FOXO1 and its m6A levels.A:Prediction of m6A modification site of FOXO1 using SRAMP.B:Changes of FOXO1 mRNA level after WTAP knockdown.C:Expression level of FOXO1 protein after WTAP knockdown.D:RIP experiment showing the interaction between WTAP and FOXO1.E:m6Alevel of FOXO1 detected by MeRIP-qPCR.**P＜0.01,***P＜0.001,****P＜0.0001.

3 討論

RNA修飾是一類重要的表觀遺傳修飾，通過影響RNA的穩(wěn)定性和翻譯來調(diào)節(jié)基因表達［14-16］。RNA甲基化占所有RNA修飾的60%以上，包括m6A、m5C、m3U、m7G等，其中m6A修飾是mRNA中最常見的RNA甲基化類型［17-20］。WTAP 是m6A 修飾中的“閱讀者”，和METTL3、METTL14都是重要的甲基轉(zhuǎn)移酶［21］。I/R損傷發(fā)生在各種組織和器官中，包括心臟、肝臟、肺、腎臟、皮膚等［22-26］。有關(guān)I/R損傷的m6A修飾還未得到廣泛的研究。Song等［27］證明m6A修飾與心肌I/R損傷的發(fā)病機制密切相關(guān)，在心肌I/R損傷小鼠中，METTL3蛋白的表達水平顯著升高，心肌細胞活性顯著降低；在新生兒心肌細胞的H/R損傷模型中，上調(diào)METTL3可降低自噬流，促進心肌細胞凋亡，而沉默METTL3可增強心肌細胞活力。m6A的甲基化調(diào)控也參與了腎I/R損傷的發(fā)生發(fā)展。Xu等［1］的研究證明低表達METTL14，小鼠腎組織和HK-2 細胞的I/R 損傷都被抑制，并與甲基化YAP1和YAP1-TEAD通路有關(guān)。WTAP在I/R損傷中的作用目前只在心肌中被研究，其在腎I/R損傷中是否發(fā)揮作用還處于未知階段［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，WTAP在小鼠腎I/R損傷和HK-2細胞H/R損傷中都高表達，提示W(wǎng)TAP 在腎缺血再灌注損傷中起促進作用。沉默WTAP后，與對照組相比，HK-2細胞活性增加，凋亡率降低，證明降低WTAP的表達可以減輕HK-2細胞的H/R損傷，可能通過凋亡通路發(fā)揮作用。

FOXO1作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，是細胞代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者。已有多項研究證明FOXO1參與I/R損傷的進展［28］。FOXO1可促進腦I/R損傷的進展［29］；Wang等［12］發(fā)現(xiàn)FOXO1下調(diào)可抑制腎的I/R損傷；我們的研究結(jié)果也與此相一致，在小鼠腎I/R損傷和HK-2細胞的H/R 損傷中，F(xiàn)OXO1 的表達都顯著升高，由此說明FOXO1的表達會加重腎I/R損傷。在缺血再灌注損傷誘導的急性腎損傷中不可避免地存在細胞凋亡。細胞凋亡是受多種基因調(diào)控的程序性細胞死亡；在凋亡信號調(diào)控下，線粒體膜電位之間的轉(zhuǎn)運孔被打開，膜電位崩解，最終導致細胞凋亡［30］。大量研究表明，Caspases是參與調(diào)控細胞凋亡的重要蛋白［31］。當線粒體膜通透性改變時，啟動Caspase 9的表達，Caspase 3作為最后的效應器元件被激活，Cleaved Caspase 3 是其活化形式，進入內(nèi)源性凋亡通路，阻礙PARP 發(fā)揮正常功能，導致細胞凋亡［32］。Wang等［12］在HK-2細胞H/R損傷研究中，用FOXO1的抑制劑AS1842856進行預處理，結(jié)果顯示與對照組相比，TUNEL 陽性染色的百分比降低，pro-Caspase3的裂解減少，說明FOXO1在HK-2細胞的H/R損傷中促進了細胞凋亡。本次研究結(jié)果顯示，在小鼠腎I/R損傷后，TUNEL陽性腎小管上皮細胞數(shù)目增加，說明損傷后凋亡加重；同時，通過體外研究HK-2細胞的H/R 損傷，Caspase3 活性檢測結(jié)果顯示H/R 損傷后Caspase3活性顯著增加，進一步證明了腎I/R損傷的機制與凋亡有關(guān)；以上研究結(jié)果與前人相一致，都證明了FOXO1在急性腎損傷中起促凋亡的作用。

m6A修飾在多種生物過程中發(fā)揮著重要作用，但有關(guān)FOXO1 這一重要轉(zhuǎn)錄因子的m6A 修飾研究甚少。目前相關(guān)學者報道了FOXO1的m6A修飾在內(nèi)皮細胞炎癥和動脈粥樣硬化中的作用。內(nèi)皮細胞炎癥過程中，F(xiàn)OXO1的m6A修飾水平顯著升高；METTL14敲低之后，F(xiàn)OXO1 的表達顯著降低；MeRIP 實驗證實METTL14可直接與FOXO1 mRNA結(jié)合，增加其m6A修飾，促進其表達，誘導內(nèi)皮細胞炎癥反應和動脈粥樣硬化斑塊形成［13］。雖然本研究采用SRAMP（http://www.cuilab.cn/sramp/）網(wǎng)站預測了FOXO1有多個高水平的m6A修飾位點，但仍需進一步的實驗證明。通過MeRIP實驗檢測了HK-2細胞H/R損傷中，F(xiàn)OXO1的m6A修飾水平顯著升高；沉默WTAP，F(xiàn)OXO1的m6A修飾水平顯著降低。以上結(jié)果提示，WTAP可直接作用于FOXO1 mRNA，增加其m6A 修飾，調(diào)控其表達，誘導HK-2細胞凋亡。

綜上所述，在I/R損傷的小鼠腎組織和H/R損傷的HK-2 細胞中，WTAP 和FOXO1 表達均上調(diào)；沉默WTAP可明顯抑制和HK-2細胞的H/R損傷，其機制可能是沉默WTAP，減弱了FOXO1的m6A修飾，降低了FOXO1及凋亡相關(guān)蛋白的表達，從而抑制細胞凋亡，對腎I/R損傷起到保護作用。本研究證明WTAP-FOXO1可能成為治療腎I/R損傷的潛在靶點，抵抗H/R損傷。但由于HK-2 細胞屬于腎小管上皮細胞，WTAPFOXO1軸能否參與調(diào)控腎I/R損傷中其他類型細胞的功能，還需進一步探討。