UBE2W過表達(dá)促進(jìn)結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸細(xì)胞的增殖

王少鑫，崔立紅，李 輝，劉新堯，李曉偉，王曉輝

解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心消化內(nèi)科，北京100048

UBE2W是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種泛素結(jié)合酶（E2），在泛素化修飾中發(fā)揮作用。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞水平上UBE2W過表達(dá)后可以抑制TNF-α誘導(dǎo)的核因子κB（NF-κB）轉(zhuǎn)錄活性［1］，而NF-κB是重要的核轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)控通路，在各種生理或病理?xiàng)l件下會(huì)發(fā)生多種激酶翻譯后修飾，如泛素化、磷酸化及SUMO化等［2-4］，據(jù)此參與泛素化調(diào)節(jié)過程的UBE2W，可能通過對(duì)NFκB通路的調(diào)控，在炎癥、免疫以及腫瘤等疾病過程中發(fā)揮重要作用［5-7］。目前，關(guān)于UBE2W的研究多集中于分子結(jié)構(gòu)及蛋白相互作用方面，對(duì)于其具有的生物學(xué)功能，尤其炎癥性疾病中可能發(fā)揮的作用未見有報(bào)道。

目前對(duì)于UBE2W在炎癥性疾病中如何發(fā)揮作用知之甚少。本研究利用DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型模擬炎癥性腸病過程，觀察過表達(dá)UBE2W對(duì)小鼠結(jié)腸炎癥的影響，結(jié)果表明UBE2W可能通過促進(jìn)結(jié)腸細(xì)胞的增殖，加快炎癥狀態(tài)下結(jié)腸粘膜的修復(fù)過程，有利于小鼠結(jié)腸炎癥的恢復(fù)，對(duì)小鼠結(jié)腸具有保護(hù)作用，此研究發(fā)現(xiàn)對(duì)于炎癥性腸病的病情評(píng)價(jià)和預(yù)后判斷具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取24只雄性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量20～22 g，6周齡，將所有小鼠均飼養(yǎng)于SPF級(jí)無(wú)菌環(huán)境中。動(dòng)物建模實(shí)驗(yàn)在北京唯尚立德公司完成，所需試劑包括：DSS（MP），相對(duì)分子質(zhì)量為36 000～50 000；體內(nèi)轉(zhuǎn)染所需腺病毒由上海泰兒圖生物科技有限公司合成，分別為AAV2/9-CMV-bGI-EGFP-WPRE-pA和AAV2/9-CMV-bGI-Ube2w-myc-WPRE-pA。

1.1.2 試劑 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）需用的逆轉(zhuǎn)錄及PCR 擴(kuò)增試劑盒（TaKaRa），實(shí)驗(yàn)中所需引物具體序列見表1，均由Invitrogen 公司合成。免疫印跡實(shí)驗(yàn)（Western blotting）需用抗體包括：UBE2W 抗體（1∶500;Thermo Fisher）；α-Tubulin 抗 體（1∶2000;Sigma）。Myc抗體（1∶1000；Santa Cruz）。病理學(xué)免疫組化分析所需抗體：Ki67和BrdU（Sigma）。

表1 RT-PCR所需引物序列Tab.1 Primer sequences for real-time PCR analysis

1.1.3 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 人胚腎細(xì)胞293T 和結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116以及轉(zhuǎn)染所需質(zhì)粒myc-vector 和myc-ube2w均來(lái)源于軍事醫(yī)學(xué)研究院國(guó)家生物醫(yī)學(xué)中心。轉(zhuǎn)染試劑為L(zhǎng)ipofectamine 2000（Invitrogen）。CCK-8（Cell Counting Kit-8）試劑盒（Dojindo）。

1.2 方法

1.2.1 結(jié)腸炎動(dòng)物模型鑒定 選用14只C57BL/6雄鼠，隨機(jī)分成2組：一組給予2.5%DSS喂養(yǎng)5 d，后恢復(fù)正常飲水3 d（結(jié)腸炎組）；另一組持續(xù)給予正常飲用水喂養(yǎng)8 d（正常組）。兩組小鼠同時(shí)處死，建模過程中觀察小鼠體質(zhì)量變化，脫頸法處死小鼠后取兩組小鼠結(jié)腸末端置于RNAlater中，并于-80 ℃冰箱保存。

在另一組實(shí)驗(yàn)中，任選同籠10只6周齡雄鼠，隨機(jī)尾靜脈注射腺病毒AAV2/9-CMV-bGI-Ube2w-myc-WPRE-pA或AAV2/9-CMV-bGI-EGFP-WPRE-pA，每只各100 μL（1×1011），即UBE2W過表達(dá)組小鼠和對(duì)照組小鼠各5 只。注射3 周后所有小鼠喂養(yǎng)5 d 2.5%DSS，再正常飲水4 d處死。在此過程中記錄每天小鼠體質(zhì)量情況，小鼠處死前4 h 摻入BrdU，即腹腔注入BrdU（100 mg/kg）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取全結(jié)腸拍照、測(cè)定結(jié)腸長(zhǎng)度，然后固定于10%福爾馬林。

1.2.2 結(jié)腸炎癥嚴(yán)重度評(píng)價(jià) 根據(jù)病理平片測(cè)量小鼠全結(jié)腸潰瘍的數(shù)目與潰瘍大小進(jìn)行評(píng)分，最終結(jié)腸炎病理組織學(xué)評(píng)分為兩者評(píng)分之和［8］。

1.2.3 RT-PCR檢測(cè) 將小鼠結(jié)腸組織自冰箱中取出后放入預(yù)冷的研缽中研磨至粉末狀，然后進(jìn)行PCR常規(guī)操作流程，即提取總RNA、合成cDNA、反轉(zhuǎn)錄PCR，PCR循環(huán)條件為（95 ℃30 min、95 ℃5 s、60 ℃31 s），共為40個(gè)循環(huán)。

1.2.4 Western blotting 實(shí)驗(yàn) 首先進(jìn)行蛋白樣本的制備，具體過程為將凍存的結(jié)腸組織研磨呈粉末狀，再經(jīng)裂解液充分裂解、沸水變性等過程，以備Western blotting待用。將充分裂解處理后的組織樣本按Western blotting操作流程依次進(jìn)行SDS-PAGE電泳、PVDF膜轉(zhuǎn)印、一抗和二抗封閉雜交，及顯影過程。一抗分別為抗UBE2W兔多抗（1∶500），鼠抗Myc抗體（1∶1000），微管蛋白抗體（1∶2000）為內(nèi)參。

1.2.5 病理組織學(xué)實(shí)驗(yàn) HE染色按常規(guī)實(shí)驗(yàn)流程，包括結(jié)腸組織包埋，切片以及染色過程。免疫組織化學(xué)Ki67和BrDU染色過程為：將福爾馬林保存的結(jié)腸組織取出后進(jìn)行切片、二甲苯和酒精預(yù)處理、隨后經(jīng)H2O2孵育、抗原修復(fù)、Ki67和BrdU一抗和二抗孵育后DAB顯色，最后蘇木素染核、封片。

1.2.6 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將293T和HCT116細(xì)胞分別培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基和RPMI 1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱條件為室溫37 ℃，5%CO2。將細(xì)胞種于12孔板中，利用lipofectamine 2000每孔轉(zhuǎn)染質(zhì)粒mycvector或myc-ube2w（1.0 μg），轉(zhuǎn)染24 h后消化細(xì)胞接種于96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，在不同時(shí)間點(diǎn)24、48、72、96 h分別加入CCK-8試劑，孵育2 h，直至細(xì)胞呈紫色晶體，將孔板放入酶標(biāo)儀中，檢測(cè)吸光度值A(chǔ)450nm，記錄后生成細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0 分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較行t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用百分率表示，組間比較行卡方檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 評(píng)價(jià)UBE2W在結(jié)腸炎組織中的表達(dá)水平

正常小鼠和結(jié)腸炎小鼠的結(jié)腸呈現(xiàn)明顯不同組織學(xué)表現(xiàn)（圖1A），結(jié)腸炎組小鼠其結(jié)腸長(zhǎng)度較正常小鼠明顯縮短，結(jié)腸表面完整性破壞，粘膜表明可見不同程度的粘膜脫落、潰瘍形成，粘膜明顯水腫增厚，在粘膜、甚至粘膜下層有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，符合結(jié)腸炎表現(xiàn)，病理組織學(xué)證實(shí)小鼠結(jié)腸炎模型構(gòu)建成功。RT-PCR結(jié)果顯示，結(jié)腸炎組中UBE2W的mRNA水平明顯低于正常組（P＜0.05，圖1B），而Western blotting檢測(cè)也呈現(xiàn)類似結(jié)果（P＜0.05，圖1C）。

圖1 UBE2W在結(jié)腸炎組織中表達(dá)減低Fig.1 UBE2W mRNA and protein expressions are decreased in mouse colitis tissue.A:Colon pathology in mice with DSS-induced colitis.B:UBE2W mRNA expression.C:UBE2W protein expression.*P＜0.05 vs normal group.

2.2 UBE2W過表達(dá)能夠減輕結(jié)腸炎小鼠體質(zhì)量丟失和結(jié)腸縮短程度

Western blotting檢測(cè)顯示，腺病毒感染小鼠可穩(wěn)定表達(dá)myc-UBE2W蛋白，模型構(gòu)建成功（圖2B）。UBE2W過表達(dá)組小鼠結(jié)腸炎過程中體質(zhì)量丟失明顯少于對(duì)照組（圖2C），在第9天和第10天最為明顯（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)測(cè)量小鼠全結(jié)腸長(zhǎng)度，結(jié)果顯示UBE2W過表達(dá)小鼠全結(jié)腸明顯長(zhǎng)于對(duì)照組（P＜0.05，圖2D）。

圖2 過表達(dá)UBE2W減輕了小鼠的結(jié)腸炎癥程度Fig.2 UBE2W overexpression decreases severity of colitis in mice.A: Establishment of mouse models of DSS-induced colitis.B:UBE2W protein expression.C:Body weight change of colitis mice.D:Colon length of colitis mice.*P＜0.05 vs control group.

2.3 UBE2W 過表達(dá)減輕小鼠結(jié)腸炎的粘膜損傷

HE染色結(jié)果顯示，在結(jié)腸炎恢復(fù)期兩組小鼠粘膜損傷程度明顯不同，UBE2W過表達(dá)組小鼠結(jié)腸粘膜潰瘍數(shù)目及潰瘍范圍均較對(duì)照組明顯減輕，粘膜層增厚不甚明顯，結(jié)腸炎癥程度評(píng)分少于對(duì)照組（P＜0.05，圖3）。

圖3 UBE2W 過表達(dá)減輕了DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸粘膜損傷Fig.3 UBE2W overexpression alleviates DSS-induced colonic mucosal damage in mice.A:HE staining.B:Histological scores in the two groups.*P＜0.05 vs control.

2.4 在細(xì)胞水平，過表達(dá)UBE2W能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖

293T細(xì)胞過表達(dá)Ube2w后在不同時(shí)間點(diǎn)吸光度值A(chǔ)450nm逐漸增加，在72 h和96 h時(shí)明顯高于載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖4），在HCT116細(xì)胞中亦呈現(xiàn)類似結(jié)果。

圖4 細(xì)胞水平上UBE2W的過表達(dá)加速了細(xì)胞增殖Fig.4 UBE2W overexpression promotes proliferation of 293T cells (A) and HCT116 cells(B).Growth curve was drawn based on the absorbance of the cell culture.*P＜0.05 vs Vector.

2.5 UBE2W過表達(dá)促進(jìn)結(jié)腸炎小鼠細(xì)胞增殖

免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，UBE2W過表達(dá)組小鼠結(jié)腸粘膜細(xì)胞Ki67 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯高于對(duì)照組（87.4%vs74.4%），UBE2W 過表達(dá)小鼠結(jié)腸細(xì)胞中BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)也明顯高于對(duì)照組（35%vs15.6%），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖5）。

圖5 過表達(dá)UBE2W促進(jìn)了小鼠結(jié)腸細(xì)胞增殖Fig.5 Overexpression of UBE2W promotes colon mucosal cell proliferation in colitis mice.A: Ki67 staining and positive cells(%).B:BrdU staining and positive cells(%).*P＜0.05 vs control.

3 討論

NF-κB在感染等免疫應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用。泛素化作為一種常見的蛋白質(zhì)修飾形式，其活化過程參與了包括細(xì)胞增殖、凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和炎癥、免疫等幾乎一切生命活動(dòng)的調(diào)控過程［9-12］。UBE2W是在前期實(shí)驗(yàn)室對(duì)NF-κB相關(guān)泛素調(diào)節(jié)酶進(jìn)行通量化篩選時(shí)偶然發(fā)現(xiàn)的一種新型E2合成酶［13］。目前研究發(fā)現(xiàn)UBE2W可以與ataxin-3協(xié)同作用調(diào)節(jié)泛素連接酶；與FANCL相互作用并調(diào)節(jié)Fanconi貧血蛋白FANCD2的單泛素化；還能夠與TRIM5α相互作用錨定Lys63連接的泛素鏈并限制逆轉(zhuǎn)錄過程；UBE2W缺失則可以逆轉(zhuǎn)Rnf4突變細(xì)胞對(duì)DNA損傷的超敏反應(yīng)。但關(guān)于UBE2W在炎癥中的作用僅限于本實(shí)驗(yàn)室的前期發(fā)現(xiàn)，UBE2W參與NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)，低水平UBE2W還可能增加小鼠結(jié)腸炎易感性［14］。那么前期結(jié)果是否可以推測(cè)UBE2W就能夠保護(hù)小鼠、減輕結(jié)腸炎癥過程呢？為進(jìn)一步驗(yàn)證此假設(shè)，本研究利用結(jié)腸炎小鼠模型，觀察過表達(dá)UBE2W后小鼠的結(jié)腸炎癥變化，并進(jìn)行了病理組織學(xué)分析，探討引起炎癥變化的可能機(jī)制。

本研究采用腺病毒感染的方式，將UBE2W整合到小鼠體內(nèi)建立小鼠體內(nèi)UBE2W 過表達(dá)模型，并經(jīng)Western blot驗(yàn)證成功，證實(shí)腺病毒感染可以在體內(nèi)將外源轉(zhuǎn)染的UBE2W穩(wěn)定過表達(dá)，腺病毒轉(zhuǎn)染可以作為建立體內(nèi)動(dòng)物模型的重要工具。在結(jié)腸炎癥反應(yīng)過程中，粘膜屏障功能破壞，如粘膜破損、炎癥反應(yīng)及粘膜上皮細(xì)胞的修復(fù)均被認(rèn)為是炎癥性腸病重要的病理生理基礎(chǔ)。在結(jié)腸粘膜屏障功能破壞后，腸腔內(nèi)細(xì)菌移位可產(chǎn)生反復(fù)的炎癥反應(yīng)，粘膜損傷后大量炎性產(chǎn)物、壞死物質(zhì)覆著于破損粘膜表面，在恢復(fù)期時(shí)結(jié)腸炎癥粘膜周圍組織細(xì)胞會(huì)不斷增殖、以修復(fù)破損粘膜。DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型重塑了炎癥性腸病的病理生理過程。本研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸炎小鼠的結(jié)腸組織中UBE2W表達(dá)減少，提示低水平UBE2W可能加重結(jié)腸炎，而UBE2W過表達(dá)小鼠在結(jié)腸炎恢復(fù)期時(shí)結(jié)腸粘膜破損明顯減輕，此結(jié)果提示高水平UBE2W可能促進(jìn)了結(jié)腸粘膜的恢復(fù)過程。但在此過程中，UBE2W如何保護(hù)結(jié)腸粘膜，從而減輕炎癥反應(yīng)，其中的機(jī)制尚不清楚。為探求可能的原因，本研究在細(xì)胞水平上檢測(cè)了過表達(dá)Ube2w對(duì)細(xì)胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Ube2w能夠加速細(xì)胞增殖，而且在小鼠結(jié)腸組織中增殖相關(guān)抗原Ki67及摻入處于增殖狀態(tài)的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)亦明顯高于對(duì)照組，因此本研究細(xì)胞和動(dòng)物水平均證實(shí)高水平UBE2W能通過加速細(xì)胞增殖，進(jìn)而促進(jìn)了結(jié)腸炎癥的恢復(fù)。這一結(jié)果也提示UBE2W減輕了小鼠結(jié)腸炎癥，可能成為一種炎癥性腸病的病情評(píng)價(jià)和判斷預(yù)后的新型標(biāo)志物。

目前，關(guān)于慢性炎癥與腫瘤相關(guān)已逐漸被研究證實(shí)，在多種因素共同作用下通過轉(zhuǎn)錄因子途徑、可溶性介質(zhì)（化學(xué)因子、細(xì)胞因子）和腫瘤組成部分（如腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞）調(diào)控炎癥反應(yīng)，持續(xù)炎癥反應(yīng)又可能增加基因不穩(wěn)定，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生［15］。本研究結(jié)果表明UBE2W能夠加速結(jié)腸細(xì)胞增殖、促進(jìn)炎癥恢復(fù)，對(duì)炎癥性腸病的病情評(píng)價(jià)具有重要意義，但關(guān)于其促進(jìn)細(xì)胞增殖的相關(guān)機(jī)制尚未明確，有報(bào)道結(jié)腸炎過程中可通過諸多通路如Notch通路、ERK通路、STAT3相關(guān)通路、NF-kB通路以及Wnt通路等參與細(xì)胞增殖的調(diào)控［16-20］，腸道菌群失調(diào)、免疫細(xì)胞功能不穩(wěn)定也可能通過影響細(xì)胞增殖在結(jié)腸炎進(jìn)展中發(fā)揮作用。盡管現(xiàn)尚無(wú)資料證實(shí)UBE2W在結(jié)腸炎和正常人結(jié)腸組織中表達(dá)存在差異，但有研究表明，克羅恩?。–D）患者中高表達(dá)的miRNA與轉(zhuǎn)錄后修飾酶之間存在相互作用，可能解釋了CD發(fā)病的部分機(jī)制，其中hsa-miR-181d的高表達(dá)下調(diào)了UBE2W mRNA水平［21］，而hsa-miR-181d已被證明參與TGF誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、癌細(xì)胞遷移、癌變和轉(zhuǎn)移，且在結(jié)腸癌中高表達(dá)［22,23］。TGF-beta作為一種由腸上皮細(xì)胞和粘膜T細(xì)胞分泌的調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，可通過促進(jìn)分泌性免疫球蛋白A（IgA）產(chǎn)生，增強(qiáng)腸道免疫屏障，發(fā)揮抗炎和黏膜保護(hù)作用。因此，推測(cè)UBE2W可能通過miRNAs介導(dǎo)調(diào)控TGF-β信號(hào)通路在炎癥性腸病甚至癌變中發(fā)揮作用，hsa-miR-181d參與ube2w轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)表達(dá)水平，使UBE2W作為泛素調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)成員參與IBD發(fā)生過程。目前尚未有關(guān)于UBE2W在人結(jié)腸炎和結(jié)腸癌中的臨床報(bào)道，也為進(jìn)一步的深入研究提供了線索和思路。

結(jié)合最新研究報(bào)道，UBE2W作為一種DNA損傷修復(fù)中至關(guān)重要的蛋白質(zhì)編碼基因，高表達(dá)UBE2W可能促進(jìn)了乳腺癌腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移［24］；而UBE2W的下調(diào)能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡及精子形成減少［25］；且可能作為關(guān)鍵基因參與青春期重度抑郁癥的分子調(diào)節(jié)［26］。這些新發(fā)現(xiàn)均提示UBE2W在參與炎癥反應(yīng)過程外，在腫瘤和自身免疫性疾病中也發(fā)揮作用。至于在炎癥誘導(dǎo)腫瘤中UBE2W如何發(fā)揮作用，是否加速了結(jié)腸惡性腫瘤的進(jìn)展，還有待進(jìn)一步證實(shí)。