LncRNA SNHG8 通過抑制miR-494-3p 表達減輕腦缺血再灌注損傷

曹天然，劉青芳，潘美民，張雪紅

長沙市第一醫(yī)院1臨床試驗研究中心，2神經(jīng)醫(yī)學中心，湖南 長沙410005

腦卒中是全球范圍內(nèi)導致長期重度殘疾和死亡的最常見原因之一［1］。80%～85%的腦卒中病例是由腦缺血引起的，腦缺血通常由大腦大動脈栓塞或血栓栓塞性閉塞所致［2］。介入治療需要恢復血流，從而導致再灌注損傷。腦缺血再灌注損傷（CIRI）是指隨著血流灌注短期恢復，缺血缺氧引起的神經(jīng)損傷進一步加重的病理過程［3］。越來越多的證據(jù)表明，缺血常涉及一系列的神經(jīng)事件，如缺氧、氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)等［4］，最終導致缺血腦的急性壞死、凋亡和自噬［5］。目前，組織型纖溶酶原激活劑是治療CIRI的唯一有效方法［6］。因此，有必要且迫切地為腦卒中患者尋找新的有效治療靶點，探討腦缺血的潛在分子機制。

長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一種含有200多個堿基的非編碼RNA，可調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯、表觀遺傳機制、細胞分化和其他生理/病理活動［7］。許多研究表明，lncRNA還影響神經(jīng)系統(tǒng)的許多生理和病理過程，它們已被確定為腦卒中的潛在生物標志物［8］。例如，有證據(jù)表明，LncRNA SNHG8表達降低與腦缺血的進展密切相關(guān)［9］。LncRNA SNHG8不僅通過調(diào)節(jié)miR-425-5p保護小膠質(zhì)細胞免受缺血誘導的炎癥反應(yīng)，而且還緩解了體外和體內(nèi)腦微血管內(nèi)皮細胞的損傷［10］。有趣的是，lncRNA 的功能通常是通過調(diào)控microRNA 介導的，microRNA通過在轉(zhuǎn)錄后與3'UTR結(jié)合來調(diào)節(jié)mRNA表達［11］。例如，LncRNA CASC15 通過直接靶向抑制miR-338-3p的表達，然后促進CIRI的細胞凋亡和炎癥反應(yīng)［12］。因此，我們試圖進一步了解LncRNA SNHG8在CIRI中的發(fā)生機制。

MicroRNA（miRNA）是一類被廣泛研究的內(nèi)源性RNA，它們不被翻譯成蛋白質(zhì)，但在許多細胞過程中起著至關(guān)重要的作用，包括正常的生理和異常病理過程［13］。許多miRNA與腦缺血再灌注損傷有關(guān)。例如，已知miR-532-3p下調(diào)通過靶向NOX2而加重缺血/再灌注損傷［14］。Zuo等［15］發(fā)現(xiàn)miR-652可以通過抑制NOX2而保護缺血/再灌注損傷。此外，據(jù)報道，miR-494-3p 通過抑制BHLHE40的表達加劇CIRI后的腦損傷和神經(jīng)元損傷［16］。然而，LncRNA SNHG8是否能夠介導miR-494-3p表達而緩解腦缺血再灌注損傷，目前尚未見到相關(guān)報道。

1 材料和方法

1.1 細胞株

人胚腎細胞HEK-293T、小鼠小膠質(zhì)細胞BV2（武漢普諾賽生命科技有限公司）。

1.2 實驗動物

從湖南斯萊克景達實驗動物有限公司［SCXK（湘）2019-0004］購買SPF 級的6 周齡雄性C57BL/6J 小鼠（20～25 g）。將所有小鼠飼養(yǎng)在環(huán)境控制的房間中，在12小時的光照/黑暗循環(huán)下隨意獲取食物和水。實驗方案經(jīng)長沙市第一醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準后實施（2021倫審【臨研】第（61）號）。

1.3 主要試劑

胎牛血清、MEM培養(yǎng)基（武漢普諾賽生命科技有限公司）；Lipofectamine 3000TM轉(zhuǎn)染試劑盒、TRIzol試劑、細胞凋亡檢測試劑盒（Thermo Fisher Scientific）；異氟醚（上海麥克林生化科技有限公司）；6-0尼龍縫合線（Doccol）；戊巴比妥鈉、TTC溶液（Sigma-Aldrich）；4%多聚甲醛、RIPA裂解液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；PrimeScript?RT試劑盒、SYBR?Premix Ex TapTMⅡ試劑盒（TakaRa Bio）；ELISA檢測試劑盒IL-1β、IL-6和TNF-α（R&D）；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（Abcam）。

1.4 主要儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；ABI7500 實時熒光定量PCR 儀（Thermo Fisher Scientific）；酶標儀（Biotek）；流式細胞檢測儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；高速冷凍型微量臺式離心機[大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）股份公司）]。

1.5 細胞培養(yǎng)與處理

HEK-293T細胞和BV2細胞在含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素溶液的MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。對于缺氧缺糖/再灌注（OGD/R）細胞模型，將全培養(yǎng)基換成無葡萄糖DMEM，將細胞置于37 ℃厭氧室（95%N2和5%CO2）中2 h，然后重新加入全培養(yǎng)基，保持正常培養(yǎng)狀態(tài)（37 ℃，5%CO2，飽和濕度）繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后收集細胞用于后續(xù)試驗。在對照組中，細胞沒有被剝奪氧和葡萄糖，正常培養(yǎng)。

1.6 細胞轉(zhuǎn)染

oe-SNHG8、miR-494-3p mimic 及相應(yīng)對照均購自GenePharma（中國上海）。轉(zhuǎn)染oe-NC或oe-SNHG8后再進行剝奪氧和葡萄糖處理，將細胞分為OGD/R+oe-NC 組或OGD/R+oe-SNHG8 組；將oe-SNHG8 與mimic NC或miR-494-3p mimic共同轉(zhuǎn)染后再進行剝奪氧和葡萄糖處理，將細胞分為OGD/R+oe-SNHG8+mimic NC組和OGD/R+oe-SNHG8+miR-494-3p mimic組。對于轉(zhuǎn)染，根據(jù)制造商的說明，將所需質(zhì)粒與LipofectamineTM3000混合，并轉(zhuǎn)染到指定細胞中。

1.7 小鼠腦缺血再灌注損傷模型建立

通過大腦中動脈閉塞手術(shù)建立腦缺血再灌注損傷模型［17］。用異氟醚（4%誘導濃度和2%維持濃度）麻醉小鼠，沿中線切開頸部皮膚，小心地分離左側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈和頸外動脈。接下來，將一根帶有圓形尖端的6-0尼龍絲從左側(cè)頸總動脈插入頸內(nèi)動脈的末端，以阻塞右大腦中動脈的起源。閉塞2 h后，去除尼龍線，讓血液通過左側(cè)頸內(nèi)動脈回流（再灌注），縫合皮膚切口。再灌注24 h后，腹腔注射1%戊巴比妥鈉（150 mg/kg）對小鼠實施安樂死，取小鼠大腦組織進行后續(xù)實驗。術(shù)前禁食12 h，自由飲水。術(shù)中保留大鼠自主呼吸，維持直腸溫36.5～37.5 ℃，術(shù)中和術(shù)后維持室溫25 ℃。Sham組只暴露左側(cè)頸總動脈，不結(jié)扎處理，其余均行相同手術(shù)操作。

1.8 小鼠神經(jīng)損傷評估

小鼠神經(jīng)損傷程度采用神經(jīng)功能缺失評分和大腦水腫程度確定。小鼠神經(jīng)功能缺失評分：血液再灌注后24 h，大鼠神經(jīng)功能缺失通過Longa評分標準確定［18］；大腦水腫程度通過標準的大腦濕重-大腦干質(zhì)量來確定［19］。大腦提取后迅速稱取質(zhì)量，隨后在100 ℃下干燥24 h，稱質(zhì)量。大腦的水腫程度通過公式：（濕質(zhì)量-干質(zhì)量）/濕質(zhì)量×100%。

1.9 TTC染色

將小鼠大腦組織樣品在冰箱中于-20 ℃冷凍30 min以進行切片。簡而言之，將大腦組織切成2.0 mm厚的冠狀切片。并使用2%TTC溶液在37 ℃下對這些切片染色20 min。然后，將切片浸入4%多聚甲醛中固定過夜。然后照相，與正常區(qū)域的紅色相比，腦損傷區(qū)域呈現(xiàn)白色。染色切片用AutoCAD分析軟件（San Rafael，CA）成像和分析。

1.10 RT-qPCR檢測LncRNA SNHG8和miR-494-3p的表達

按照制造商的說明，使用Trizol試劑從細胞和大腦組織的大腦皮層梗死區(qū)域中提取總RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反向轉(zhuǎn)錄為cDNA。對濃度和純度符合要求的RNA 樣品，稀釋到合適的濃度，利用PrimeScript?RT試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄。采用ABI7500實時熒光定量PCR儀，使用SYBR?Premix Ex TapTMⅡ試劑盒，運用Applied Biosystems 7500HT系統(tǒng)進行PCR，并通過2-ΔΔCt方法分析數(shù)據(jù)。每個樣品重復3次，所有反應(yīng)引物如下表1所示。LncRNA SNHG8用GAPDH為內(nèi)參，miR-494-3p的相對表達用U6為內(nèi)參。數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCt法，公式如下：ΔΔCt=[Ct（目的基因）-Ct（內(nèi)參基因）]實驗組-[Ct（目的基因）-Ct（內(nèi)參基因）]對照組。

1.11 流式細胞儀檢測細胞凋亡

使用Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒對細胞進行凋亡分析。將各組細胞懸液調(diào)整密度為105/mL，每個樣品收集1 mL細胞懸液于10 mL離心管中，500 r/min 離心5 min，棄去培養(yǎng)液。PBS 洗滌，500 r/min離心5 min，棄上清。用100 μL的標記溶液重懸細胞，室溫下避光孵育10 min。加入5 μL的Annexin V-熒光素異硫氰酸酯（Annexin V-FITC）和5 μL的碘化丙啶（PI），輕輕混勻，室溫避光反應(yīng)10 min。流式細胞儀檢測FITC和PI熒光，分析細胞凋亡率。

1.12 ELISA檢測細胞中IL-1β、IL-6和TNF-α含量

收集細胞上清和小鼠大腦組織的大腦皮層梗死區(qū)域勻漿上清液對炎癥因子IL-1β、IL-6 和TNF-α進行ELISA分析。部分腦組織在冰上超聲勻漿30 min，將腦組織勻漿和各組細胞4 ℃、12 000 r/min離心10 min，收集其上清液。通過ELISA 試劑盒檢測IL-1β、IL-6 和TNF-α含量。所有操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.13 熒光素酶報告實驗檢測LncRNA SNHG8和miR-494-3p的靶向調(diào)控關(guān)系

根據(jù)生物信息學軟件Starbase 預測結(jié)果，設(shè)計LncRNA SNHG8和miR-494-3p結(jié)合位點的野生序列和突變序列。通過生工生物工程有限公司合成LncRNA SNHG8野生型Wt-SNHG8和3'UTR結(jié)合序列突變型Mut-SNHG8，將野生序列和突變序列片段克隆并分別與pmirGLO 載體結(jié)合，將Wt-SNHG8 或Mut-SNHG8 和mimic NC 或miR-494-3p mimic 使 用LipofectamineTM3000共轉(zhuǎn)染到HEK-293T細胞中。轉(zhuǎn)染48 h后，使用雙熒光素酶雙報告基因試劑盒進行熒光素酶活性檢測。

1.14 統(tǒng)計學分析

使用SPSS 23.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示。所有實驗獨立重復3次。數(shù)據(jù)若服從正態(tài)分布及各組間滿足方差齊性時，采用t檢驗或單因素方差分析；若數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布，則采用秩和檢驗進行分析驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 LncRNA SNHG8在腦缺血再灌注損傷小鼠中低表達，而miR-494-3p高表達

Sham組未觀察到梗死，I/R組出現(xiàn)明顯的梗死區(qū)（圖1）。神經(jīng)功能缺失評分結(jié)果顯示I/R組小鼠神經(jīng)嚴重損傷，而且腦水腫程度嚴重（P＜0.001，圖2、3）。ELISA檢測結(jié)果顯示，與Sham組相比，I/R組小鼠腦組織中炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達水平明顯增加（P＜0.001，圖4）。RT-qPCR 結(jié)果顯示，I/R 組中LncRNA SNHG8低表達（P＜0.01），而miR-494-3p高表達（P＜0.01，圖5）。

圖1 Sham組和I/R組小鼠腦組織TTC染色Fig.1 TTC staining of the brain tissue in Sham group and I/R group.

圖2 Sham組和I/R組小鼠神經(jīng)功能缺失評分Fig.2 Score of neurological deficit in Sham group and I/R group.***P＜0.001.

圖4 Sham組和I/R組小鼠腦組織中炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α表達水平Fig.4 Expression levels of inflammatory factors IL-1β,IL-6 and TNF-α in the brain tissue of Sham group and I/R group.***P＜0.001.

圖5 Sham組和I/R組小鼠腦組織中LncRNASNHG8和miR-494-3p表達Fig.5 Expression of LncRNASNHG8 and miR-494-3p in brain tissue of Sham group and I/R group mice.**P＜0.01.

2.2 過表達LncRNA SNHG8抑制OGD/R模型小膠質(zhì)細胞的炎癥反應(yīng)

RT-qPCR 結(jié)果顯示（圖6），LncRNA SNHG8 在OGD/R 組中的表達明顯降低（P＜0.01），過表達后LncRNA SNHG8的表達明顯升高（P＜0.01）。ELISA結(jié)果顯示，與Control組相比，OGD/R組細胞內(nèi)炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達水平明顯增加（P＜0.01）；與OGD/R+oe-NC組相比，OGD/R+oe-SNHG8組IL-1β、IL-6和TNF-α的含量明顯減少（P＜0.01），OGD/R組與OGD/R+oe-NC之間差異性不顯著（圖7）。

圖6 LncRNASNHG8在各組細胞中的表達水平Fig.6 Expression level of LncRNA SNHG8 in microglial cells of each group.**P＜0.01.

圖7 各組細胞中炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α表達水平Fig.7 Expression levels of inflammatory factors IL-1β,IL-6 and TNF-α in cells of each group.**P＜0.01.

2.3 過表達LncRNA SNHG8抑制OGD/R模型小膠質(zhì)細胞的凋亡

流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示（圖8），與Control組相比，OGD/R組細胞凋亡率明顯增加（P＜0.01）；與OGD/R+oe-NC組相比，OGD/R+oe-SNHG8組細胞凋亡率明顯降低（P＜0.01）。OGD/R組與OGD/R+oe-NC之間差異沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖8 各組細胞凋亡率比較Fig.8 Comparison of apoptosis rates among the groups.**P＜0.01.

2.4 LncRNASNHG8靶向負調(diào)節(jié)miR-494-3p

通過生物信息學網(wǎng)站Starbase 預測了LncRNA SNHG8和miR-494-3p結(jié)合的靶位點（圖9），并且設(shè)計了野生型LncRNA SNHG8（Wt-SNHG8）和突變型LncRNA SNHG8（Mut-SNHG8）。雙熒光素酶報告實驗結(jié)果（圖10）顯示，與mimic NC 相比，miR-494-3p mimic組明顯減弱了Wt-SNHG8的熒光素酶信號（P＜0.01），而對Mut-SNHG8的熒光素酶信號沒有顯著性差異（P＞0.05）。與OGD/R+oe-NC組比較，轉(zhuǎn)染OGD/R+oe-SNHG8的小膠質(zhì)細胞中miR-494-3p的表達水平顯著降低（P＜0.01，圖11）。

圖9 生物信息學預測LncRNA SNHG8和miR-494-3p的靶向調(diào)控位點Fig.9 Bioinformatic prediction of the targeted regulatory sites of LncRNASNHG8 and miR-494-3p.

圖10 雙熒光素酶報告實驗Fig.10 Luciferase reporter assay.**P＜0.01.

圖11 miR-494-3p在兩組細胞中的表達水平Fig.11 Expression level of miR-494-3p in two groups of cells.**P＜0.01.

2.5 過表達miR-494-3p逆轉(zhuǎn)了oe-SNHG8對OGD/R模型小膠質(zhì)細胞炎癥反應(yīng)和凋亡的抑制作用

RT-qPCR檢測顯示，進一步過表達miR-494-3p的OGD/R模型小膠質(zhì)細胞中miR-494-3p的水平降低（P＜0.01，圖12）。與OGD/R+oe-SNHG8+mimic NC相比較，OGD/R+oe-SNHG8+miR-494-3p mimic炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的含量增加（P＜0.05，圖13），細胞凋亡率增加（P＜0.01，圖14）。

圖12 miR-494-3p在兩組細胞中的表達水平Fig.12 Expression level of miR-494-3p in two groups of cells.**P＜0.01.

圖13 兩組細胞IL-1β、IL-6和TNF-α含量比較Fig.13 Comparison of the contents of IL-1β,IL-6 and TNF-α between the two groups.*P＜0.05.

圖14 兩組細胞凋亡率比較Fig.14 Comparison of apoptosis rate between the two groups.**P＜0.01.

3 討論

缺血性中風是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，是全球死亡和長期殘疾的主要原因［20,21］。由顱內(nèi)動脈閉塞或顱外頸動脈閉塞引發(fā)的急性缺血性腦卒中約占總腦卒中的85%［22］。在缺血性中風后的幾個小時內(nèi)，神經(jīng)元會永久受損并經(jīng)歷細胞死亡［23］。因此，拯救受損神經(jīng)元的治療選擇很重要；然而，迄今為止，只有少數(shù)治療藥物被報道可以緩解中風后的神經(jīng)功能障礙。臨床治療，例如組織纖溶酶原激活劑介導的溶栓，通常受到治療時間窗口狹窄和長期效果不足的限制［24,25］。在缺血性中風情況下，小膠質(zhì)細胞發(fā)揮著雙刃劍的作用，吞噬組織碎片并分泌促炎和抗炎介質(zhì)，這可能會加劇缺血性損傷或誘導修復［26］。小膠質(zhì)細胞活化和增殖的損傷已被證明可增加缺血性損傷引起的梗死面積和細胞凋亡［27］。研究發(fā)現(xiàn)，MSC-Exos（間充質(zhì)干細胞來源的外泌體）可以降低OGD/R 誘導的BV-2 細胞凋亡［28］；在OGD/R 模型中，BV2細胞凋亡率升高，兒茶素（100μmol/L）也可以有效地抑制細胞凋亡［29］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)CIRI小鼠動物模型中，LncRNA SNHG8低表達，而miR-494-3p高表達。過表達LncRNA SNHG8可抑制OGD/R模型小膠質(zhì)細胞的炎癥反應(yīng)和細胞凋亡。LncRNA SNHG8靶向負調(diào)控miR-494-3p的表達。過表達miR-494-3p逆轉(zhuǎn)了oe-SNHG8對OGD/R模型小膠質(zhì)細胞凋亡和炎癥反應(yīng)的抑制作用。從機制上講，我們的結(jié)果表明：LncRNA SNHG8通過抑制miR-494-3p表達，抑制炎癥反應(yīng)和細胞凋亡，從而改善腦缺血再灌注損傷。

近年來，一些lncRNAs 已被證明在CIRI 中失調(diào)［30,31］。LncRNA是腦卒中等缺血性損傷后腦血管內(nèi)皮中新發(fā)現(xiàn)的一類調(diào)節(jié)因子［32］。lncRNA已成為治療缺血性腦卒中的新靶點［33,34］。例如，抑制LncCHRF通過調(diào)節(jié)miR-126/SOX6 軸來減少缺血性損傷［35］。敲低LncRNAAK038897可通過調(diào)節(jié)DAPK1的miR-26a-5靶向來預防腦缺血再灌注損傷［36］。因此，lncRNA作為腦缺血再灌注損傷進展中的新治療靶點具有巨大的潛力。例如，沉默MALAT1可以抑制OGD-R誘導的細胞凋亡［37］。此外，Zhang等［9］報道lncRNASNHG8通過miR-449c-5p/SIRT1/FoxO1途徑抑制小膠質(zhì)細胞活化和血腦屏障通透性，從而引起對缺血性腦損傷的保護作用。在本研究中，我們通過調(diào)節(jié)LncRNA SNHG8表達證明了過表達LncRNASNHG8對腦缺血再灌注損傷具有保護作用。

為了識別LncRNA SNHG8的下游靶標，我們通過StarBase生物信息學網(wǎng)站分析發(fā)現(xiàn)LncRNA SNHG8與miR-494-3p存在結(jié)合位點。MicroRNA（miRNA）是長度約為18～21個核苷酸的短非編碼RNA，可以通過靶向其3'非翻譯區(qū)（3'-UTR）來調(diào)節(jié)mRNA翻譯［38］。超過20%的miRNA在缺血性腦中異常表達，提示miRNA參與缺血性腦卒中的發(fā)病機制和發(fā)展［39］。miR-424的過表達可以通過抑制小膠質(zhì)細胞活化來減少缺血性腦損傷［40］。增加miR-224-3p表達可通過降低FAK家族相互作用蛋白（FIP200）的表達來減輕腦缺血/再灌注損傷［41］。miR-494-3p加劇CIRI后的腦損傷和神經(jīng)元損傷［16］，這與我們的研究結(jié)果相似。在本研究中，熒光素酶報告基因檢測顯示miR-494-3p是CIRI中LncRNA SNHG8的直接靶基因，過表達LncRNA SNHG8抑制miR-494-3p的表達，證明LncRNA SNHG8可以負向調(diào)控miR-494-3p的表達。此外，本實驗還發(fā)現(xiàn)，進一步過表達miR-494-3p，部分逆轉(zhuǎn)了oe-SNHG8對OGD/R模型小膠質(zhì)炎癥反應(yīng)和細胞凋亡的抑制作用。

總之，LncRNA SNHG8 通過抑制miR-494-3p 表達，抑制炎癥反應(yīng)和細胞凋亡，從而改善腦缺血再灌注損傷。這些結(jié)果表明LncRNASNHG8參與腦缺血再灌注損傷的進展，為腦缺血再灌注損傷的治療提供了一個新的潛在靶點。