糖尿病視網(wǎng)膜病變不同分期患者血清δ樣蛋白4和環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白水平對微血管損傷的預(yù)測價值

郭 婧, 李蕓云, 劉思思, 沙 穎, 馬 凱, 王 紅

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院, 1. 北京同仁眼科中心, 2. 眼科學(xué)與視覺科學(xué)北京市重點實驗室, 北京, 100730)

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病患者最常見的眼部并發(fā)癥之一,也是失明的主要原因之一[1]。隨著全球糖尿病患者數(shù)量的不斷增加,DR所造成的醫(yī)療和社會負(fù)擔(dān)也日益加重。DR的發(fā)生與發(fā)展涉及多種因素,其中微血管損傷是其發(fā)病機制的重要環(huán)節(jié)之一。δ樣蛋白4(DLL4)是Notch信號通路中的一個關(guān)鍵成員,在血管生成和維持血管穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。研究[2]表明,在DR患者中, DLL4的表達受到調(diào)控,并可能在血管生成紊亂中起到關(guān)鍵作用。高血糖環(huán)境下, DLL4的表達可能受到抑制,導(dǎo)致異常的血管新生和血管滲漏,從而加劇視網(wǎng)膜病變的嚴(yán)重程度。環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)作為轉(zhuǎn)錄因子,在細(xì)胞增殖、分化和炎癥等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[3]。在DR中, CREB的激活與炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等病理過程密切相關(guān)。研究[4]顯示,高血糖環(huán)境可以通過激活CREB通路來誘導(dǎo)炎癥因子的產(chǎn)生,從而引發(fā)視網(wǎng)膜病變的發(fā)展。

DLL4和CREB作為調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和血管生成的關(guān)鍵因子,在多種疾病中發(fā)揮重要作用[5]。然而,在DR中DLL4和CREB的角色及其與微血管損傷的關(guān)聯(lián)尚未得到全面闡明。內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)、循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞(CEC)及循環(huán)祖細(xì)胞(CPC)作為血管生成和修復(fù)關(guān)系密切的細(xì)胞類型,在人體中,EPC和CPC主要發(fā)揮血管修復(fù)和再生的功能, CEC則代表著血管內(nèi)皮細(xì)胞已成熟。相關(guān)研究[6]發(fā)現(xiàn), DR患者會出現(xiàn)血管異常的生成和損傷,進而誘發(fā)EPC和CPC相關(guān)功能損傷,導(dǎo)致CEC釋放到循環(huán)中,造成這些細(xì)胞濃度水平改變。本研究探討不同DR分期患者血清DLL4、CREB水平及其與微血管損傷的潛在關(guān)系,現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審議和批準(zhǔn),選擇2020年2月—2023年2月收治的80例糖尿病患者作為研究對象,將所有患者依照DR分期分為無DR組(n=37)、非增生型DR組(n=19)和增生型DR組(n=24)。無DR組男20例,女17例,平均年齡(64.93±5.43)歲,平均體質(zhì)量(64.39±12.38) kg, 平均體質(zhì)量指數(shù)(BMI)為(22.01±3.84) kg/m2; 非增生型DR組男11例,女8例,平均年齡(64.99±4.94)歲,平均體質(zhì)量(65.12±12.31) kg, 平均BMI為(22.03±2.98) kg/m2; 增生型DR組男14例,女10例,平均年齡(65.01±4.89)歲,平均體質(zhì)量(64.98±11.94) kg, 平均BMI為(21.96±3.79) kg/m2。3組受試者一般資料比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05), 具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn): ① 符合糖尿病治療指南中相關(guān)糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)者; ② DR分型和診斷符合《我國糖尿病視網(wǎng)膜病變臨床診療指南(2014年)》[7]者; ③ 患者無精神疾病、免疫性疾病、感染性疾病或心腦血管疾病; ④ 患者依從性良好,可積極配合本研究; ⑤ 患者無青光眼等其他眼部疾病; ⑥ 患者對本研究知情并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn): ① 妊娠期或哺乳期女性; ② 合并外周或中樞神經(jīng)疾病史者; ③ 存在DR治療史者; ④ 入組前半年內(nèi)參與其他臨床試驗和研究者; ⑤ 臨床資料缺失或主動申請退出本研究者。

1.2 方法

采集受試者空腹靜脈血,離心收集血清后采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測受試者血中DLL4及CREB水平,所有檢測均嚴(yán)格遵照試劑盒說明書進行操作。采集受試者空腹靜脈血,采用FACS Count流式細(xì)胞儀檢測患者EPC、CEC及CPC水平,所用檢測抗體均購自CST公司,嚴(yán)格按照流式細(xì)胞儀標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進行操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù),計數(shù)資料采用百分率表示,組間差異行卡方檢驗,計量資料采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間差異行LSD-t檢驗,多組間計量資料差異采用方差檢驗分析; 采用Spearman相關(guān)性檢驗分析不同DR分期患者血清DLL4和CREB水平的關(guān)系,并采用Logistics回歸模型分析DLL4和CREB水平對DR患者病情分期的影響; 采用線性回歸模型分析DLL4和CREB水平與微血管評估指標(biāo)的相關(guān)性,以病理檢測結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn),繪制受試者工作特征(ROC)曲線,分析DLL4和CREB對微血管損傷的預(yù)測價值。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組患者DLL4和CREB水平比較

無DR組、非增生型DR組、增生型DR組患者血中DLL4及CREB水平依次遞增,其中增生型DR組患者血中DLL4及CREB水平最高,無DR組患者DLL4及CREB水平最低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 見表1。

表1 3組患者血中DLL4及CREB水平比較 pg/mL

2.2 不同DR分期與DLL4和CREB水平的關(guān)系

DR分期與DLL4、CREB水平均呈顯著正相關(guān)(r=0.656、0.731,P=0.013、0.005)。

2.3 DLL4和CREB水平對DR患者分期的影響

高DLL4(OR=1.910, 95%CI: 1.311～2.782)、高CREB(OR=2.038, 95%CI: 1.374～3.022)是影響DR患者分期的獨立危險因素,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 見表2。

表2 DLL4和CREB水平對DR患者分期的影響

2.4 3組患者微血管損傷指標(biāo)比較

無DR組、非增生型DR組、增生型DR組患者血中EPC、CEC及CPC水平存在差異,其中增生型DR組患者血中EPC、CPC水平最低, CEC水平最高,無DR組EPC、CPC水平最高, CEC水平最低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 見表3。

表3 3組患者微血管損傷指標(biāo)比較 %

2.5 DLL4和CREB水平與微血管評估指標(biāo)的相關(guān)性

患者DLL4及CREB水平與EPC、CPC水平呈顯著負(fù)相關(guān), DLL4及CREB水平與CEC水平呈顯著正相關(guān),見表4、圖1。

圖1 DLL4和CREB水平與微血管評估指標(biāo)的相關(guān)性

表4 DLL4和CREB水平與微血管評估指標(biāo)的相關(guān)性

2.6 DLL4、CREB對微血管損傷的預(yù)測價值

DLL4、CREB預(yù)測DR患者微血管損傷的曲線下面積(AUC)均大于0.85, 見表5、圖2。

圖2 DLL4、CREB預(yù)測微血管損傷的ROC曲線

表5 DLL4和CREB對微血管損傷的預(yù)測價值

3 討 論

DR是一種由糖尿病引起的嚴(yán)重眼部并發(fā)癥,主要影響視網(wǎng)膜血管和組織,可能導(dǎo)致視力損害甚至失明[8]。DR的發(fā)生和發(fā)展涉及多種因素,包括高血糖、高血壓、血脂異常、糖尿病病程等。高血糖是DR發(fā)生的主要因素之一,長期的高血糖狀態(tài)導(dǎo)致視網(wǎng)膜微血管損傷,血管壁通透性增加,易導(dǎo)致滲漏和出血。高血糖還可誘發(fā)炎癥反應(yīng),激活細(xì)胞因子、促進生長因子的產(chǎn)生,加速視網(wǎng)膜病變的進展[9]。此外,高血壓和血脂異常也與DR密切相關(guān),這些因素進一步損害視網(wǎng)膜的微循環(huán)和組織結(jié)構(gòu)。DR的分期評估對于制訂個體化的治療策略和預(yù)防措施至關(guān)重要[10]。

DLL4是Notch信號通路中的關(guān)鍵成員,屬于DSL家族的蛋白質(zhì)。Notch信號通路在細(xì)胞分化、增殖、凋亡等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用。DLL4在血管生成、神經(jīng)發(fā)育以及免疫調(diào)節(jié)等方面具有重要的生理功能[11]。在血管生成過程中, DLL4的主要作用是調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞的分化和血管分支的形成。在新生血管的末梢, DLL4通過與Notch受體相互作用,抑制附近血管內(nèi)皮細(xì)胞分化為血管平滑肌細(xì)胞,從而抑制新血管的擴張和分支。這種抑制機制有助于維持血管的結(jié)構(gòu)完整性和功能穩(wěn)定性,確保正常的血液循環(huán)[12]。CREB是一種轉(zhuǎn)錄因子,其在細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)和基因表達調(diào)控中扮演著重要角色。CREB的活化是通過多種信號通路調(diào)控的,其中包括cAMP信號通路、鈣信號通路、細(xì)胞因子受體通路等。CREB的主要功能之一是參與細(xì)胞的生存和適應(yīng)性反應(yīng),在細(xì)胞受到外界刺激或內(nèi)源性信號激活時, CREB被磷酸化,并形成激活態(tài)的磷酸化CREB[13]。激活的CREB可以結(jié)合到DNA上的cAMP響應(yīng)元件,從而啟動目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄,進而影響細(xì)胞的適應(yīng)性反應(yīng),如細(xì)胞增殖、分化和生存等。

DLL4在血管生成和維持血管穩(wěn)態(tài)方面具有重要作用,在糖尿病患者中,由于高血糖狀態(tài)的存在, DLL4的表達可能受到調(diào)節(jié)。研究[14]表明,高血糖環(huán)境可以降低DLL4的表達,導(dǎo)致異常的血管生成和血管滲漏,加劇視網(wǎng)膜病變的發(fā)展。DLL4的過度激活也可能參與了DR的發(fā)病機制,進一步加劇了病變的進展。在DR的發(fā)展中, DLL4的作用可能涉及多種機制: 首先, DLL4的降低可能導(dǎo)致血管新生不足,造成視網(wǎng)膜缺氧和血管異常; 其次, DLL4的異常激活可能加劇炎癥反應(yīng),導(dǎo)致炎性因子的過度產(chǎn)生,進而影響視網(wǎng)膜的病理過程[15]。因此, DLL4在DR中既可能是保護因子,也可能是促進因子,其具體作用可能取決于病變的發(fā)展階段和個體的差異。

CREB作為重要的轉(zhuǎn)錄因子,在糖尿病環(huán)境中, CREB的激活可能涉及多種信號通路,包括cAMP信號通路和炎癥通路。研究[16]顯示,在糖尿病患者中, CREB的活化與炎癥反應(yīng)密切相關(guān),高血糖狀態(tài)可以激活CREB, 進而誘導(dǎo)炎性因子的產(chǎn)生和炎癥過程的加劇。這些炎癥因子可以進一步損傷視網(wǎng)膜微血管,導(dǎo)致視網(wǎng)膜病變的發(fā)展, CREB在DR的炎癥調(diào)節(jié)中可能起到重要作用[17]。CREB的激活可能還與視網(wǎng)膜神經(jīng)損傷有關(guān), DR不僅涉及血管異常,還可能引發(fā)視網(wǎng)膜神經(jīng)元的損傷; CREB在神經(jīng)細(xì)胞的存活和可塑性調(diào)節(jié)中具有重要作用,因此在視網(wǎng)膜神經(jīng)損傷的發(fā)展中也可能發(fā)揮一定的作用[18]。

本研究結(jié)果顯示,增生型DR組患者血中DLL4及CREB水平最高,無DR組DLL4及CREB水平最低; 相關(guān)性檢驗分析顯示, DR患者不同分期與DLL4和CREB水平呈顯著正相關(guān); 多因素回歸分析表明,糖尿病患者血中高DLL4及高CREB水平是影響DR患者不同分期的獨立危險因素。在DR發(fā)展過程中,血管生成異常和微循環(huán)障礙是重要的病理特征, DLL4在正常情況下能夠調(diào)控血管生成的平衡,但在高血糖狀態(tài)下,其表達可能受到調(diào)控,導(dǎo)致異常的血管生成和血管滲漏,從而加劇視網(wǎng)膜病變。相關(guān)研究[19]發(fā)現(xiàn)DR患者體內(nèi)的CREB水平與內(nèi)皮生長因子水平呈正相關(guān), CREB活化后參與血管內(nèi)皮細(xì)胞形成,誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加,在很多的血管屏障破壞的疾病中發(fā)揮重要的作用; 因此, CREB也可能通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能而影響微循環(huán)的穩(wěn)定性。此外, DLL4和CREB都參與調(diào)節(jié)炎癥和免疫反應(yīng),在糖尿病狀態(tài)下,炎癥因子的產(chǎn)生和免疫系統(tǒng)的活化都會加劇視網(wǎng)膜病變的發(fā)展。

微血管損傷情況分析顯示,增生型DR組患者血中EPC、CPC水平最低, CEC水平最高,無DR組EPC、CPC水平最高, CEC水平最低; 線性回歸模型分析顯示,患者DLL4及CREB水平與EPC、CPC水平呈顯著負(fù)相關(guān), DLL4及CREB水平與CEC水平呈顯著正相關(guān); ROC曲線分析表明, DLL4和CREB預(yù)測DR患者微血管損傷的AUC均大于0.85。EPC、CEC和CPC是與血管生成和修復(fù)相關(guān)的細(xì)胞類型,在正常情況下, EPC和CPC具有血管修復(fù)和再生的潛能,而CEC則是成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞的代表。在DR發(fā)展過程中,異常的血管生成和損傷可能導(dǎo)致EPC和CPC的功能受損,同時CEC可能被釋放到循環(huán)中,從而影響這些細(xì)胞的水平。DLL4和CREB的異常表達可能在這一過程中發(fā)揮作用,通過調(diào)節(jié)血管生成和修復(fù)的平衡,影響EPC、CPC和CEC的水平。

DLL4和CREB的水平與EPC、CPC以及CEC的相關(guān)性可能反映了其在微血管損傷中的調(diào)節(jié)作用。DLL4和CREB的異常表達可能導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和功能改變,從而影響EPC、CPC和CEC的分化和釋放。DLL4和CREB在預(yù)測DR患者微血管損傷方面具有較高的診斷能力,這可能是因為其在調(diào)節(jié)血管生成、修復(fù)和炎癥反應(yīng)等過程中的多重作用。這些分子的異常表達可能成為DR微血管損傷的早期標(biāo)志,從而有望在臨床實踐中作為潛在的生物標(biāo)志物,有助于及早識別和干預(yù)病情。DLL4和CREB不僅參與了血管生成和炎癥調(diào)節(jié)等過程,還可能在微血管損傷方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用,影響EPC、CPC和CEC的水平。

綜上所述,隨著DR患者分期增加,血清DLL4和CREB水平呈顯著升高趨勢,且DLL4和CREB對其微血管損傷具有較高的預(yù)測價值。