異丙腎上腺素誘導(dǎo)小鼠急性心肌梗死模型制備方法研究

錢 銘, 程 龍, 熊 媛, 楊 慧1, , 吉 利

(1. 南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院 藥學(xué)部, 江蘇 南京, 210008;2. 南京中醫(yī)藥大學(xué) 鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院, 江蘇 南京, 210008;3. 中國(guó)藥科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床藥學(xué)學(xué)院, 江蘇 南京, 210008;4. 南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院 老年醫(yī)學(xué)科, 江蘇 南京, 210008)

急性心肌梗死(AMI)因冠狀動(dòng)脈部分或完全阻塞,導(dǎo)致流向心肌的血液阻塞。冠狀動(dòng)脈閉塞時(shí),心肌缺血、缺氧引起心肌細(xì)胞死亡?；颊弑憩F(xiàn)為胸部不適或壓力增大,并可輻射至頸部、下頜、肩部或手臂。據(jù)調(diào)查[1]顯示, 2019年全世界有超過(guò)200萬(wàn)的AMI新發(fā)患者,相較于過(guò)去10年增加了7倍,急需進(jìn)一步基礎(chǔ)和臨床研究來(lái)應(yīng)對(duì)這種嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。建立合適的AMI動(dòng)物模型是推進(jìn)研究的重要環(huán)節(jié)。目前,常用的AMI模型構(gòu)建方法包括藥物誘導(dǎo)法和手術(shù)結(jié)扎法[2], 手術(shù)結(jié)扎法操作難度較大、存活率較低,且存在操作者手法上的差異。藥物誘導(dǎo)操作簡(jiǎn)單,對(duì)小鼠損傷較小,存活率高,且實(shí)驗(yàn)人員操作導(dǎo)致的差異較小[3-4]。常用的藥物為異丙腎上腺素(ISO), ISO是β受體激動(dòng)劑,可激動(dòng)小鼠心臟β受體,導(dǎo)致心臟血管劇烈收縮,血管灌注不足,大大降低平均動(dòng)脈壓和舒張壓,引起心臟功能障礙[5]。目前,國(guó)內(nèi)外多采用大鼠皮下注射ISO的方式誘導(dǎo)AMI模型,已有的報(bào)道[6-8]中小鼠ISO給藥劑量為10～160 mg, 給藥頻次和取材時(shí)間也各不相同,尚無(wú)統(tǒng)一的造模方式。由于高劑量ISO給藥的成模率較高[9], 因此本研究選用高劑量150 mg/kg ISO皮下注射的方式,探究不同ISO注射的次數(shù)和時(shí)間對(duì)心肌損傷的影響,以期明確ISO誘導(dǎo)的AMI模型的最佳造模方式,為臨床AMI的研究提供合適的造模方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

異丙腎上腺素(貨號(hào)15627)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,該藥物用于小鼠AMI模型的構(gòu)建。4%多聚甲醛固定液(BL539A)購(gòu)自中國(guó)Biosharp公司,用于小鼠心臟組織固定。

1.2 模型的構(gòu)建

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)8周齡雄性C57BL/6小鼠(購(gòu)自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司),體質(zhì)量約23 g。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境為12 h晝夜節(jié)律,自由飲食飲水,恒溫、恒濕。小鼠自購(gòu)買后,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為單次注射組及單次空白組, 2次注射組及2次空白組,每組各5只。設(shè)計(jì)2種不同方案誘導(dǎo)AMI模型,如圖1所示。ISO單次注射組: 小鼠一次皮下注射劑量為150 mg/kg的ISO(生理鹽水配置),分別于注射后2、4、8、16、24取小鼠血樣和心臟組織; 單次空白組給予相同體積的生理鹽水注射。ISO 2次注射組: 小鼠連續(xù)2 d間隔24 h皮下注射150 mg/kg的ISO, 于第2次注射后2、4、8、16、24、48、72 h取小鼠血樣和心臟組織; 2次空白組給予相同體積的生理鹽水注射。本研究涉及到的所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均通過(guò)了南京鼓樓醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(倫理號(hào)2023AE01032)。

圖1 AMI小鼠模型構(gòu)建流程圖

1.3 小鼠生化指標(biāo)檢測(cè)

通過(guò)摘眼球取血的方式,收集小鼠血樣置于1.5 mL EP管中,血液靜置2 h后,置于4 ℃離心機(jī)中4 000轉(zhuǎn)/min離心5 min, 將上清轉(zhuǎn)移到另一個(gè)1.5 mL EP管中。在生化儀中檢測(cè)每個(gè)樣本中肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)、心肌肌鈣蛋白T(cTnT)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、降鈣素原(CT)的含量。

1.4 小鼠心臟蘇木素-伊紅(H&E)染色

取小鼠心臟后,置于4%多聚甲醛固定液中,石蠟包埋,沿心臟橫切面切取5 μm厚度切片。石蠟切片在二甲苯-無(wú)水乙醇-75%酒精中脫臘, H&E染色,無(wú)水乙醇-二甲苯脫水,封片后在切片掃描儀中進(jìn)行圖像采集。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 單次ISO刺激對(duì)小鼠心肌損傷的影響

小鼠單次皮下注射ISO, 于注射后不同時(shí)間點(diǎn)取小鼠血樣。生化檢測(cè)結(jié)果顯示,與空白組相比, CK在2 h時(shí)濃度最高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 而后隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低至正常水平; CK-MB無(wú)顯著變化; LDH于2 h應(yīng)激性升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 降低后于8 h開(kāi)始再次升高,并在16 h達(dá)到最高濃度,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01), 隨后濃度降低,見(jiàn)表1。

表1 單次注射ISO小鼠血清生化指標(biāo) U/L

2.2 2次ISO刺激對(duì)小鼠心肌損傷的影響

小鼠連續(xù)2次間隔24 h皮下注射ISO 150 mg/kg, 在末次注射后不同時(shí)點(diǎn)取小鼠血樣,結(jié)果顯示, CK、CK-MB和LDH均在注射后16 h升高至最高濃度,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01), 隨后濃度降低。此外,在2 h時(shí), CK、CK-MB和LDH均有一過(guò)性的升高,見(jiàn)表2。

表2 2次注射ISO小鼠血清生化指標(biāo) U/L

2.3 AMI模型小鼠生化指標(biāo)改變

本研究選擇連續(xù)2次皮下注射ISO 150 mg/kg建立小鼠AMI模型,末次注射16 h后取樣進(jìn)行后續(xù)研究,并設(shè)模型組(2次注射ISO 150 mg/kg)和對(duì)照組(給予相同體積的生理鹽水注射)。結(jié)果顯示,相較于對(duì)照組,模型組小鼠的血清中cTnT、AST和ALT均升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。但炎癥指標(biāo)IL-6、PCT和CRP比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 見(jiàn)表3。

表3 2次注射ISO后16 h小鼠血清生化指標(biāo)

2.4 AMI模型小鼠心臟病理性改變

連續(xù)2次皮下注射ISO 150 mg/kg建立小鼠AMI模型后,本研進(jìn)一步探究小鼠心肌組織病理結(jié)構(gòu)變化,H&E染色結(jié)果顯示,對(duì)照組小鼠室間隔心肌細(xì)胞排列整齊、致密; 模型組小鼠心肌組織發(fā)生病理學(xué)改變,室間隔細(xì)胞排列紊亂、疏松,心肌細(xì)胞腫脹,細(xì)胞膜溶解(圖2)。相較于對(duì)照組,模型組室間隔厚度增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01), 見(jiàn)表4。

表4 2次注射ISO后16 h小鼠心室壁厚度改變 μm

A: 對(duì)照組; B: 模型組。

3 討 論

心血管疾病是發(fā)達(dá)國(guó)家和發(fā)展中國(guó)家的主要死亡原因,每年約占全世界死亡總數(shù)的20%[10]。由于發(fā)展中國(guó)家,特別是城市地區(qū)生活方式改變,AMI發(fā)病率不斷上升,在心血管疾病死亡中的占比越來(lái)越大[10-11]。因此,有必要建立合適、便捷、可重復(fù)的AMI動(dòng)物模型,不僅可以有助于研究心血管疾病的發(fā)病機(jī)制和病理生理學(xué),也可以為新藥的研發(fā)提供評(píng)價(jià)藥效的重要工具。AMI是由于冠狀動(dòng)脈供血與心肌需求不平衡而導(dǎo)致的心肌壞死的急性狀態(tài),圍繞此原理,目前國(guó)內(nèi)外制備AMI動(dòng)物模型的方法包括藥物誘導(dǎo)法、手術(shù)結(jié)扎法、低溫冷凍法、冠狀動(dòng)脈微栓塞法等。其中較常用的方法是手術(shù)結(jié)扎法和藥物誘導(dǎo)法[2, 12]。手術(shù)結(jié)扎法主要應(yīng)用于大鼠及更大體積的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,通過(guò)結(jié)扎實(shí)驗(yàn)動(dòng)物冠狀動(dòng)脈左前降支造成心室AMI[13]。據(jù)報(bào)道[14], 在手術(shù)過(guò)程中,由于麻醉劑、氣管插管、開(kāi)胸、肺損傷、傷口感染、心力衰竭等多種因素造成的動(dòng)物死亡率高達(dá)40%。此外,這種方法所造成的梗死面積的大小變異性也較大,結(jié)扎位置的輕微變化即可導(dǎo)致梗死面積較大的差異,結(jié)扎位置偏上和進(jìn)針過(guò)深則易造成較大的梗死面積和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的死亡,結(jié)扎位置偏下或進(jìn)針過(guò)淺則易導(dǎo)致模型不成功[15-16], 不穩(wěn)定性對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)展和結(jié)果可造成嚴(yán)重影響。冷凍法是通過(guò)超低溫造成與冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法相似的AMI效果,但其造成的損傷集中在心外膜,與正常臨床上AMI集中在心內(nèi)膜有所不同[16-17], 不能很好的模擬臨床上AMI患者的病理狀態(tài)。冠狀動(dòng)脈微栓塞法一般用于大型動(dòng)物,該技術(shù)使用定制的導(dǎo)管選擇性地插入左冠狀動(dòng)脈,通過(guò)導(dǎo)管注入微球引起栓塞。這個(gè)過(guò)程同時(shí)產(chǎn)生多個(gè)微梗死,類似于經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療后的臨床栓塞,雖然該技術(shù)不需要胸外科手術(shù),但實(shí)驗(yàn)操作難度較大,對(duì)研究人員技術(shù)要求較高[18]。

藥物誘導(dǎo)法操作便捷,可以避免氣管插管、冠狀動(dòng)脈結(jié)扎等手術(shù)操作對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造成的創(chuàng)傷和感染,實(shí)驗(yàn)周期短,因此有較高的實(shí)用性、可靠性和較低的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡率,造模成功率高[19]。藥物誘導(dǎo)法使用ISO、阿霉素、血管加壓素等藥物[20]。阿霉素是臨床上的一種蒽環(huán)類抗腫瘤藥,具有心臟毒性,因此用作心肌損傷模型的制備,但有研究報(bào)道阿霉素腹腔注射胃腸道毒性大,易導(dǎo)致注射部位皮膚壞死,模型死亡率較高[4]。ISO是一種合成兒茶酚胺和β腎上腺素能激動(dòng)劑,廣泛用于誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性心血管疾病,在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中引起心肌嚴(yán)重應(yīng)激,導(dǎo)致心肌梗死樣壞死[21]。ISO誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物心肌病理生理變化與人類AMI的病理生理變化相似[10], 且與其他動(dòng)物模型相比, ISO誘導(dǎo)心肌損傷動(dòng)物模型具有死亡率低、可重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)[22]。因此ISO誘導(dǎo)的動(dòng)物模型是一個(gè)容易較常使用的標(biāo)準(zhǔn)化的AMI動(dòng)物模型,相關(guān)研究將其用于評(píng)價(jià)AMI藥物的療效。但目前ISO誘導(dǎo)心肌損傷動(dòng)物模型相關(guān)研究主要集中于大鼠,給藥方式有皮下注射、腹腔注射等,具體藥物劑量不一,且小鼠相關(guān)研究較少[6-9]。故本研究探討了ISO不同給藥次數(shù)以及給藥時(shí)間對(duì)小鼠AMI模型造模程度的影響。

cTnT、CK-MB、LDH等指標(biāo)是AMI發(fā)生心肌損傷的標(biāo)志物[23-24], 也是評(píng)價(jià)本試驗(yàn)造模成功與否的指標(biāo)。據(jù)報(bào)道, ISO單次皮下注射1 d后,小鼠心臟短暫性收縮功能增強(qiáng),舒張功能不變,約10%心肌細(xì)胞膜損傷,但損傷的心肌細(xì)胞很少出現(xiàn)壞死; 循環(huán)中cTnT水平升高,表明心肌細(xì)胞受到損傷[25]。本研究選取了ISO較適宜的中間劑量150 mg/kg進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)單次皮下給藥后小鼠血清中CK、CK-MB和LDH都在2 h出現(xiàn)了應(yīng)激性的升高,隨后降低,僅LDH在16 h時(shí)出現(xiàn)2次升高。而連續(xù)2次皮下給藥除在2 h時(shí)出現(xiàn)應(yīng)激性升高外, CK、CK-MB和LDH均在16 h達(dá)到了最高濃度,且2次給藥后最高濃度高于單次給藥后最高濃度。因此, 2次連續(xù)給藥的方式要優(yōu)于單次給藥。在2次給藥后16 h, 血清中cTnT、ALT和AST也顯著升高。ISO誘導(dǎo)的心肌梗死與人類心肌梗死具有相似的形態(tài)學(xué)改變。據(jù)報(bào)道[7], ISO誘發(fā)的心肌壞死發(fā)生在左心室心內(nèi)膜下區(qū)和室間隔。本研究通過(guò)病理結(jié)果發(fā)現(xiàn), ISO刺激16 h時(shí)的小鼠心肌組織發(fā)生顯著病理學(xué)改變,室間隔厚度增加,細(xì)胞排列紊亂、疏松,心肌細(xì)胞的細(xì)胞腫脹,細(xì)胞膜溶解。上述結(jié)果表明在2次給藥方式下,選擇16 h取材優(yōu)于其他時(shí)點(diǎn),此時(shí)的模型損傷指標(biāo)升高更顯著、更穩(wěn)定,探究藥物治療研究的窗口更大。

相對(duì)其他造模方法, ISO皮下注射誘導(dǎo)AMI模型實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單,對(duì)其他臟器無(wú)明顯毒性,無(wú)創(chuàng),動(dòng)物存活率高,重復(fù)率高,缺點(diǎn)是不能精確定位損傷部位,但相較于其他模型顯著的實(shí)驗(yàn)局限性, ISO誘導(dǎo)的AMI模型較為成熟穩(wěn)定[3]。本研究通過(guò)進(jìn)一步探索該模型給藥次數(shù)和取材時(shí)點(diǎn),發(fā)現(xiàn)在小鼠模型中,連續(xù)2 d間隔24 h皮下注射150 mg/kg劑量的ISO,可以比較成功地建立小鼠AMI模型,且發(fā)現(xiàn)造模后16 h取材優(yōu)于其他時(shí)點(diǎn),這為臨床研究AMI的發(fā)病進(jìn)程和作用機(jī)制提供更簡(jiǎn)易、高效的模型制備方法。