CD39小分子抑制劑ARL67156增強NK細胞對胃癌細胞的殺傷作用

龔 英，艾麗飛熱·艾麥提，何宗忠

1南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院檢驗醫(yī)學(xué)科，廣東 廣州 510515；2南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院輸血醫(yī)學(xué)科，廣東 廣州510010

胃癌是一種常見的惡性消化道腫瘤，我國每年約有40萬人死于該疾?。?,2］，胃癌治療后的平均總生存時間（mOS）為7.5～12月［3,4］。常見的胃癌治療手段有：傳統(tǒng)方式（包括：手術(shù)、放療、化療）和新療法（包括：靶向治療、免疫治療等）［5］。然而，傳統(tǒng)治療方式有諸多不足，比如：對腫瘤組織的特異靶向性差，不能夠有效區(qū)分正常組織和癌組織，常引發(fā)正常組織產(chǎn)生損傷，當(dāng)胃癌發(fā)生轉(zhuǎn)移后，很多傳統(tǒng)方法難以用于一線治療［5］。近年來，腫瘤免疫治療方法，因其靶向性好、特異性高、副作用小等優(yōu)點，逐漸在臨床胃癌治療中廣泛應(yīng)用起來［5］。胃癌腫瘤細胞表面表達多種腫瘤相關(guān)抗原，如：靶向腫瘤抗原Her2。臨床已應(yīng)用多種特異性靶向腫瘤相關(guān)的抗體治療胃癌，靶向Her2單克隆抗體已作為胃癌的一線治療藥物［6］。但是腫瘤逃逸的機制，如：表達腫瘤抗原減少、主要組織相容性復(fù)合體（MHC）-I類分子缺失、抑制性腫瘤微環(huán)境、阻礙免疫細胞進入到腫瘤組織內(nèi)等機制，常常引發(fā)胃癌腫瘤細胞對免疫療法的耐藥［7,8］。研發(fā)高效、特異、副作用低的腫瘤免疫新療法，是實現(xiàn)胃癌精準治療的迫切任務(wù)。

自然殺傷性細胞（NK細胞）是人體外周血的淋巴細胞，其特征性的表面分子是CD56和CD16，不表達CD3，具有很強的抗腫瘤和抗病毒的能力［9］。因其能夠識別MHC-I類分子缺失的腫瘤細胞，不依賴于MHC分子的限制性，并且其殺傷腫瘤效率高等特點，NK細胞常被用于腫瘤免疫治療［9］。NK細胞的功能受到其表面的活化性信號分子和抑制性信號分子的控制，當(dāng)NK細胞的抑制性信號減少的時候，活化性信號占主導(dǎo)地位時，NK細胞表現(xiàn)出很強的殺傷靶細胞的活力［10］。近年來，在白血病治療中，過繼NK細胞治療方法取得了令人滿意的結(jié)果，但是在實體瘤中，存在抑制性的腫瘤微環(huán)境，限制了NK細胞的功能［11］。如何提高NK細胞在實體腫瘤中的抗腫瘤活性，受到了越來越多的關(guān)注［12］。

CD39 是胞外2’3’磷酸核苷酸水解酶（2’3’Phosphonucleotide hydrolase），具有Ca2+、Mg2+離子依賴的胞外核苷酸水解酶活性，能夠?qū)⒓毎釧TP（eATP）和eADP水解生成eAMP，進而生成腺苷，腺苷通路通過抑制PI3K/PKA/AKT/FOXO1通路，減少Ca2+內(nèi)流，抑制免疫細胞釋放IFN-γ、穿孔素、顆粒霉素B等［13,14］。在B16F10和LWT1兩種轉(zhuǎn)移性肺癌小鼠模型中，CD39在腫瘤浸潤淋巴細胞亞群的NK 細胞、CD8+T、CD4+T、Treg細胞等表面高表達［15］；在CD39全基因敲除小鼠模型中，與對照組相比，轉(zhuǎn)移瘤的數(shù)量減少、病理組織切片顯示NK細胞在腫瘤組織內(nèi)部的浸潤程度顯著增高［15］；采用POM-1靶向CD39分子的抑制劑，能夠有效增強PD-1/CTLA-4免疫療法的效果，這些結(jié)果證明了CD39能夠限制免疫細胞的功能，進而促進肺癌的轉(zhuǎn)移［15］。近年來，腺苷通路在胃癌免疫調(diào)控中的研究收到了廣泛的關(guān)注［16,17］，也有研究報道證明了小分子靶向與siRNA沉默CD39能夠在體外增強T細胞、NK細胞殺傷卵巢腫瘤的現(xiàn)象［18,19］，但其增強NK細胞抗腫瘤的機制尚未證闡述清楚，并且尚未在體內(nèi)的安全性和有效性需要進一步探索［20］。因此，本研究旨在探討ARL67156靶向CD39的小分子抑制劑增強NK細胞抗腫瘤效應(yīng)的分子機制，并通過體內(nèi)實驗論證ARL67156增強NK細胞殺傷胃癌細胞的有效性，拓展用小分子藥物增強NK細胞殺傷胃癌的應(yīng)用，為推進NK細胞的免疫療法提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

本實驗用的SPF級BALB/c Nude裸鼠（動物質(zhì)量合格編號：No.44822700022444，生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2020-0051），購自珠海百試通生物科技有限公司。所有動物均在最佳飼養(yǎng)條件，包括每籠3～4只小鼠的飼養(yǎng)密度，使用國家標準嚙齒類動物SPF級飼料及墊料，并給予高壓滅菌水。飼養(yǎng)環(huán)境溫度維持在23～25 ℃，濕度為55%～63%，光照周期為12 h光照/12 h黑暗，并定期更換墊料。所有小鼠均可自由飲食。

本實驗的設(shè)計與實施均受到南方醫(yī)科大學(xué)動物管理倫理委員會的監(jiān)督（實驗動物倫理審批號：SMUL2022080）。動物實驗將12只小鼠隨機分為3組：PBS組、NK細胞組、NK細胞+ARL67156組，4只/組。在飼養(yǎng)1周后，皮下注射1×106MKN-45細胞，至腫瘤生長至約100 mm3（注射腫瘤7 d）后，進行下一步實驗。

通過尾靜脈回輸方式，每只小鼠接受了1×107NK cells 200 接受的PBS液體，同時腹腔注射100 μL含有20 000 IU的IL-2，以維持NK細胞在體內(nèi)的活性。IL-2每隔1 d注射1次，腫瘤每隔1 d測量1次。在NK細胞+ARL67156 組中，每隔1 d 腹腔注射0.2 mg/kg ARL67156。

腫瘤大小使用游標卡尺進行測量，計算公式為：腫瘤體積=（ab2）/2，其中a為腫瘤長軸，b為腫瘤短軸。當(dāng)裸鼠體內(nèi)的MKN-45胃癌細胞腫瘤體積達到1000 mm3時，根據(jù)實驗倫理要求，設(shè)定此為實驗終點。隨后對小鼠進行麻醉處理，并使用頸椎脫臼法進行處死，取出腫瘤組織進行進一步分析。

1.2 材料

胃癌細胞系（MGC-803和MKN-45細胞，購自于Procell），RPMI 1640、PBS緩沖液、胎牛血清、青鏈霉素、胰酶-EDTA（Procell）。Miltenyi MACS NK細胞磁珠抗體陰性分選試劑盒（Miltenyi）。DMSO（Sigma-Aldrich）。淋巴細胞Ficoll 分離液（天津灝洋生物）。RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。Western blot 蛋白印跡兔源一抗抗體：抗NKG2D、磷酸化pvav1（Abcam），抗DAP10抗體（Santa Cruz），vav1、磷酸化pSyk、Syk 和β-Actin（Cell Signaling Technology），ECL 發(fā)光液（Thermo Scientific）。流式抗體：CD39-PE-CY7，CD56-PE，CD3-FITC，CD73-Percp，CD16-FITC，KIR3DL3-APC，KIR2DL2-APC-CY7，NKG2D-APC，CD57-FITC，CD107a-APC，IFN-γ-APC-CY7，布雷菲德霉素A（BFA）（BD Bioscience）；細胞內(nèi)固定和細胞內(nèi)細胞因子染色試劑盒，活細胞染料Cell Tracker?CM-DiI，Live/Dead Fixable V500-Aqua 死細胞染色試劑盒（Thermo Scientific Fisher）；IFN-γ雙抗體夾心法ELISA 試劑盒（Elabscience）；人白介素2（IL-2）（R&D System）。CD39小分子抑制劑ARL67156（Med Chem Express LLC），溶于滅菌水中，流式細胞儀（BD LSR Fortessa X-20）和FlowJo分析軟件（BD Biosciences）。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) 胃癌細胞系用RPMI 1640完全培養(yǎng)基（10%胎牛血清FCS，100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素）培養(yǎng)，細胞傳代用胰酶消化傳代。外周血NK細胞磁珠分離純化后，用RPMI 1640完全培養(yǎng)基（10%胎牛血清FCS，100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素，2 mmol/L L-谷氨酰胺，50 μmol/L 2-巰基乙醇），500 U/mL白介素2(IL-2)進行培養(yǎng)。所有細胞放置于37 ℃，5%CO2飽和濕度的恒溫細胞培養(yǎng)室中培養(yǎng)。

1.3.2 原代NK細胞純化和分離 本實驗已獲得南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院倫理委員會許可（倫理審查號：NFEC-2022-295），并依照1964年《赫爾辛基宣言》制定的倫理準則進行實驗。抽取健康志愿者（18～35歲）靜脈血20 mL，肝素抗凝，采用淋巴細胞液Ficoll進行密度梯度離心，分離得到單個核細胞（PBMC），采用Miltenyi MACS NK細胞磁珠抗體陰性分選試劑盒，分離純化得到原代NK細胞；外周血NK細胞磁珠分離純化后，用RPMI1640完全培養(yǎng)基，細胞濃度為1×106/mL。

1.3.3 CD39抑制劑與NK細胞共培養(yǎng) CD39小分子抑制劑ARL67156，用DMSO溶解，使用濃度100μmol/L。與NK細胞（細胞濃度為1×106/mL）共培養(yǎng)24 h后，用于NK細胞的殺傷能力、信號通路、細胞因子釋放實驗。

1.3.4 Western blot蛋白印跡實驗 1×106/mL NK細胞用100μmol/LARL67156處理和未處理的24 h后，用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌細胞3次，加入RIPA蛋白裂解液于冰上裂解30 min，10 000g離心20 min，取上清，BCA蛋白濃度測定試劑盒定量后，取各組蛋白進行SDS-PAGE（10%）電泳分離轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，分別加一抗，用含5%脫脂奶粉封閉后，4 ℃孵育緩慢搖動過夜，經(jīng)TBST洗滌3次，5 min/次；室溫用二抗（HRP標記，稀釋比例為1∶2000）孵育1～2 h，TBST清洗后，使用ECL發(fā)光試劑盒曝光，拍照，采用Image J進行蛋白條帶灰度定量。

1.3.5 ELISA法檢測干擾素（IFN-γ）的表達 1×104NK細胞（效靶比為1∶1）與胃癌腫瘤細胞在U型的96孔板中，共培養(yǎng)48 h后，雙抗體夾心法ELISA試劑盒檢測共培養(yǎng)后上清液中含有的IFN-γ濃度，A490nm值用酶標儀讀取，通過標準品繪制曲線后，計算出樣品中的IFN-γ濃度。

1.3.6 NK細胞與腫瘤細胞共培養(yǎng)后CD107a脫顆粒和胞內(nèi)細胞因子的流式細胞術(shù)檢測 為了測量NK細胞內(nèi)細胞因子的產(chǎn)生，1×105NK細胞與胃癌腫瘤細胞共培養(yǎng)4 h，同時加入0.5μL anti-CD107a-APC，培養(yǎng)基中加有10μg/mL BFA。然后收獲細胞，用PBS緩沖液洗滌，用熒光染料偶聯(lián)的抗CD3和抗CD56表面單克隆抗體在4 ℃下染色30 min。用PBS洗滌2遍后，使用細胞內(nèi)固定和破膜緩沖液進行細胞內(nèi)染色，然后用熒光染料偶聯(lián)的抗IFN-F進行染色，使用流式細胞儀采集數(shù)據(jù)和FlowJo軟件V 10.6分析流式結(jié)果數(shù)據(jù)。

1.3.7 NK細胞殺傷實驗流式細胞術(shù)檢測 NK細胞對胃癌腫瘤細胞的殺傷實驗采用4 h流式細胞術(shù)檢測。使用Cell Tracker。CM-DiI染料對胃癌腫瘤細胞進行標記，并孵育過夜。NK細胞與標記的腫瘤細胞以不同的效應(yīng)靶比共培養(yǎng)（0.25∶1，0.5∶1，1∶1和2∶1）。共孵育4 h后，使用Live/Dead Fixable V500-Aqua死細胞染色試劑盒測定腫瘤細胞活力，并使用流式細胞儀收集數(shù)據(jù)，F(xiàn)lowJo軟件進行分析測定。特異性細胞殺傷測定采用以下公式：（死亡腫瘤細胞%-自發(fā)腫瘤細胞死亡%）/（100%-自發(fā)腫瘤細胞死亡%）腫瘤細胞%。

1.3.8 動物實驗 SPF級BALB/c Nude裸鼠，1周適應(yīng)性喂養(yǎng)后，根據(jù)治療方式的不同，隨機分為3組，4只/組：PBS組、NK細胞組和ARL67156+NK細胞組。小鼠皮下注射1×106個MKN-45 胃癌細胞，皮下成瘤的注射的體積為0.2 mL。皮下注射7 d后，皮下成瘤體積約為100 mm3。人的原代擴增的NK細胞（1×107個）尾靜脈回輸，同時20 000 IU IL-2 每隔1 d腹腔注射；每隔1 d，按照0.2 mg/kg的劑量腹腔注射ARL67156。

1.3.9 統(tǒng)計學(xué)分析 所有統(tǒng)計學(xué)處理是采用GraphPad Prism9軟件進行分析的，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗。單因素方差分析用于多組間比較。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。所有實驗都獨立重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 NK細胞表達CD39的頻率

從外周血分離出外周血單個核細胞（PBMC）后，然后用磁珠抗體試劑盒純化出NK細胞后，純度在95%以上（n=6，圖1A）。用熒光抗體標記NK細胞上的CD39，得出外周血（25.97±5.69）%NK 細胞表達CD39分子（圖1B）。

2.2 CD39小分子抑制劑ARL67156激活活化信號受體并降低抑制性信號受體

對NK細胞信號通路檢測，與DMSO對照組相比，ARL67156處理后的NK細胞表達更多的磷酸化vav1（P=0.012）、磷酸化Syk（P=0.080）、NKG2D（P=0.038）、DAP10（P=0.025）等活化分子，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖2A、B）。同時，ARL67156分子能夠促進NK細胞表達NKG2D、CD57、CD16 活化受體，降低TIGIT、KIR2DL1 和KIR2DL1 抑制性的受體表達。然而，DMSO對照組和ARL67156處理后的NK細胞兩組間腺苷通路的受體CD39和CD73表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，圖2）。

圖2 CD39小分子抑制劑ARL67156上調(diào)NK細胞活化受體下調(diào)抑制性受體Fig.2 Modulation of NK cell receptors by small-molecule CD39 inhibitor ARL67156.A:ARL67156 activates NK cells through the vav1-Syk signaling pathway.Following stimulation with 100 μmol/L ARL67156,the expression of activation proteins NKG2D and DAP10 was upregulated in NK cells.B:Quantitative analysis of the protein bands in Western blotting normalized with β-actin(n=3).C:Flow cytometry showing upregulated expressions of the activation receptors NKG2D,CD57,and CD16 in ARL67156-treated NK cells.D:The suppressive receptors TIGIT,KIR2DL1,and KIR3DL3 are down-regulated in ARL67156-treated NK cells.E:Adenosine receptors CD39 and CD73 show no significant difference in NK cells treated with 100 μmol/L ARL67156 stimulation for 24 h.Data represents a single representative flow cytometry plot from 3 independent assays.*P＜0.05.

2.3 CD39小分子抑制劑ARL67156能夠促進NK細胞釋放IFN-γ并增強CD107a脫顆粒

與對照組相比，CD39抑制劑ARL67156能夠增強NK細胞內(nèi)的IFN-γ（MGC803組，P=0.033；MKN-45組，P=0.012）和CD107a（MGC803 組，P=0.015；MKN-45組，P＜0.01）的表達，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖3A～C）。ELISA檢測NK細胞與胃癌細胞靶細胞共培養(yǎng)上清中的IFN-γ，與未處理的NK細胞相比，NK細胞分泌出更多的IFN-γ（MGC803組，P＜0.01；MKN-45組，P＜0.01），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖3D、E）。

2.4 CD39小分子抑制劑增強NK細胞殺傷胃癌細胞

殺傷實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，CD39抑制劑ARL67156處理后的NK細胞與胃癌細胞共培養(yǎng)后，約有15%更多的胃癌細胞死亡（MGC803、MKN-45），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖4A、B）。

2.5 CD39小分子抑制劑在體內(nèi)增強NK細胞抗腫瘤能力

在皮下成瘤7 d 后，相對于對照組，ARL67156 CD39小分子抑制協(xié)同NK細胞回輸組在第9天可以觀察到，腫瘤體積顯著變小，隨著時間的增加，在各組間的差異越顯著，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001，圖5）。

圖5 CD39抑制劑ARL67156增強NK細胞體內(nèi)殺傷胃癌細胞的能力Fig.5 ARL67156 enhances tumoricidal activity of NK cells against gastric tumor cells in nude mice.Balb/c nude mice bearing subcutaneous MKN-45 gastric carcinoma cell xenograft received intravenous administration of 1×107 NK cells on day 7 and intraperitoneal IL-2 at 20000 IU every other day,with or without 0.2 mg/kg ARL67156 administration.A:Schematic representation of the in vivo mouse experiment.B:Tumor masses measured on day 19 after tumor cell injection.C: Tumor growth curve.D: Tumor weight measured from 3 experimental groups.****P＜0.0001,**P＜0.01.

3 討論

CD39是腺苷通路的重要分子，能夠?qū)TP水解為ADP進而被CD73分子作用下變成腺苷，在腫瘤微環(huán)境中，大量的腺苷分子對NK細胞和T細胞具有很強的抑制作用，腺苷與免疫細胞表面的腺苷受體結(jié)合后，靶向PI3K/PKA/FOXO1通路，減少Ca2+內(nèi)流、限制IFN-γ、顆粒霉素B等釋放，損害免疫細胞的抗腫瘤功能，控制腫瘤發(fā)生耐藥、逃逸、轉(zhuǎn)移等［13］。CD39分子抑制劑能夠減輕腫瘤微環(huán)境中的細胞外ATP（eATP）降解，提高eATP的濃度，從而通過ATP受體P2X7分子，激活巨噬細胞，增強巨噬細胞吞噬淋巴瘤細胞的能力［21］。但是CD39分子抑制劑，是否能夠增強NK細胞殺傷胃癌細胞的能力尚未有研究報道［22］。本研究證明了CD39小分子抑制劑ARL67156，能夠特異性阻斷CD39分子，通過活化vav1和Syk信號通路，上調(diào)NKG2D、CD57和CD16等活化分子、降低TIGIT、KIR等抑制信號分子的表達、進而全面提升NK細胞釋放IFN-γ、CD107a脫顆粒的能力，增強NK細胞殺傷胃癌細胞的能力。

Zhu等［18］在不明原因復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)（URSA）患者的臨床樣本和細胞模型探討URSA中CD39和CD73對蛻膜自然殺傷細胞（dNK）和胎兒外滋養(yǎng)細胞（EVT）的調(diào)控作用，以及CD39/CD73通過TGF-B-mTOR-HIF-1a通路調(diào)控的可能機制。采用ARL67156與NK細胞共培養(yǎng)后，能夠抑制CD39使dNK細胞進入活化狀態(tài)，毒性增加，凋亡減少，細胞因子分泌改變，上調(diào)NKG2D、NKp44和NKp30活化受體的表達。這些結(jié)果與本研究的結(jié)論一致，ARL67156能夠激活NK細胞。Qian等［23］發(fā)現(xiàn)，CD38和CD39在NK細胞上共表達，并且高表達CD39分子同時表達PD-1等抑制性受體，用ARL67156處理后的NK細胞能夠促進HIV患者的CD4+T細胞和CD8+T細胞的增殖和活力，這可能是因為ARL67156能夠增強NK細胞釋放細胞因子進而增強T細胞的活性。Brauneck等［24］發(fā)現(xiàn)急性髓系白血病（AML）患者NK細胞的CD39分子，與TIGIT、PD-1同時高表達；該研究通過阻斷抗體的方式封閉NK細胞上的TIGIT和CD39，與單獨采用TIGIT的組別相對比，TIGIT和CD39雙阻斷的NK細胞能夠殺傷更多的AML腫瘤細胞。這些結(jié)果充分顯示了，ARL67156或者通過抗體阻斷CD39能夠顯著增強NK細胞釋放細胞因子的能力，進而增強NK細胞的抗腫瘤能力，為靶向抑制CD39在臨床腫瘤治療提供理論依據(jù)。

靶向CD39分子的治療在腫瘤免疫中有多種方式，如：抗體阻斷法、siRNA/shRNA基因敲低法、基因敲除法、小分子抑制劑法等［13,14］。靶向CD39的抗體已經(jīng)進入了Phase I/II 期臨床試驗，但是有研究表明單獨用阻斷CD39的抗體的抗腫瘤效果不佳，需要與PD-1抑制劑聯(lián)合用藥后，能夠有比較好的抗腫瘤效果，能夠激活體內(nèi)的CD8+T和NK細胞抗腫瘤［19,25］。siRNA能夠有效降低CD39 分子在腫瘤和免疫細胞上的表達，降低CD39分子后，卵巢癌細胞對T細胞和NK細胞的殺傷能力抑制作用明顯減弱，盡管該研究在卵巢癌細胞體外殺傷模型中，比較了用100 μmol/L的ARL67156小分子抑制劑處理NK細胞和siRNA敲低CD39后NK細胞殺傷力，CD39 siRNA能更加有效的增強NK細胞的殺傷力，但是siRNA體內(nèi)給藥存在困難，難以在臨床胃癌治療中應(yīng)用［26,27］?；蚯贸鼵D39的NK細胞能夠釋放更多的IFN-γ釋，但尚未應(yīng)用于臨床腫瘤治療中，并且基因敲除的步驟仍然比較復(fù)雜，不能夠大規(guī)模的批量化生產(chǎn)基因敲除的NK細胞［22,27］。然而，特異性靶向CD39蛋白的小分子抑制劑，已進入了臨床腫瘤免疫治療的試驗，化合物穩(wěn)定性較好，能夠廣泛在臨床疾病治療中應(yīng)用，在多種實體腫瘤中，聯(lián)合PD-1免疫療法，能夠取得令人滿意的抗腫瘤結(jié)果［21,22,28］。因此，本課題中的ARL67156小分子抑制劑聯(lián)合NK細胞，能夠成為胃癌的臨床治療一種潛在的有效的備選治療方法。

NK細胞是一群天然免疫細胞，具有很強的抗腫瘤抗病毒的特性。該細胞因沒有T細胞受體（TCR），而且當(dāng)NK細胞與主要組織相容復(fù)合物（MHC）-I類分子結(jié)合后，NK細胞的功能被抑制，所以不會攻擊自身的正常組織細胞，因此NK細胞被廣泛地用于腫瘤免疫治療中［11］。然而，在腫瘤微環(huán)境中，有很多負調(diào)節(jié)性的因素（如：缺氧、低PH、高濃度的腺苷，等），極大地限制NK細胞殺傷腫瘤的能力［29,30］。本研究采用CD39 抑制劑ARL67156預(yù)處理NK細胞，阻斷CD39分解NK細胞周圍的ATP，從而讓NK細胞有更多的ATP分子用于抗腫瘤活動，實驗結(jié)果證明，ARL67156抑制劑能夠誘導(dǎo)NK細胞上調(diào)活化分子（NKG2D、DAP10）、下調(diào)TIGIT、KIR等抑制性受體、釋放更多的IFN-γ、增強CD107a脫顆粒能力，由此提升NK細胞殺傷胃癌細胞的能力。本研究的創(chuàng)新之處在于，闡釋了ARL67156分子通過vav1-Syk的信號通路激活NK細胞，上調(diào)NKG2D、DAP10活化分子，進而促進NK細胞脫顆粒并釋放IFN-γ，并從體內(nèi)和體外實驗證明了ARL67156小分子抑制劑增強NK細胞殺傷胃癌細胞的能力，為此，ARL67156聯(lián)合NK細胞療法能夠為臨床胃癌的治療潛在有效的備選方案。這些結(jié)果，豐富了NK細胞殺傷實體腫瘤的理論，能夠為臨床采用CD39小分子抑制劑聯(lián)合NK細胞治療的策略提供依據(jù)，推動中國的精準腫瘤治療的發(fā)展。