六味地黃丸減輕絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥及疲勞的作用機(jī)制:基于抑制表觀調(diào)控分子BRD4通路

阮紅良，佘冬梅，孫紹裘

1湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨傷科，湖南 長沙 410007；2湖南省中醫(yī)骨傷科臨床研究中心，湖南 長沙410007

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（PMOP）是一種與衰老有關(guān)的常見?。?］，約20%的女性患有PMOP。既往的發(fā)病機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，由于絕經(jīng)后雌激素及褪黑激素等缺乏，致使骨代謝失衡骨量減少，骨小梁微結(jié)構(gòu)破壞［2］，大約10%的女性有不同部位的骨折［3］。疲勞是PMOP的主要癥狀，也是加重臨床癥狀或骨質(zhì)疏松性骨折的重要原因，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量原因之一［4,5］。因此，開展骨質(zhì)疏松臨床與基礎(chǔ)研究，對于早期診斷和防治PMOP至關(guān)重要。

中醫(yī)論治PMOP多屬于腎陰虛證，臨床表現(xiàn)為膝軟無力，患部痿軟微熱，或五心煩熱，失眠多夢等癥候。疲勞是PMOP的主要癥狀之一，屬于多臟器虛損與脾腎肝虛損最為密切?！端貑枴ふ{(diào)經(jīng)論篇》曰:“有所勞倦，形氣衰少”。中醫(yī)理論和現(xiàn)代分子醫(yī)學(xué)研究表明，諸多疲勞癥狀也是加重臨床癥狀或骨質(zhì)疏松性骨折的重要原因［6］。有文獻(xiàn)報道，六味地黃丸能提高臨床患者骨密度，改善臨床疲勞癥狀，其臨床療效與絕經(jīng)后腎氣漸虛，腎陰陽失調(diào)，人體免疫機(jī)能失調(diào)有關(guān)［7,8］。目前尚無研究明確闡明六味地黃丸預(yù)防和治療PMOP腎虛疲勞的分子作用機(jī)制。

新近研究表明，多種表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄因子參與了PMOP 的發(fā)生發(fā)展過程并起著重要調(diào)控作用［9］。溴結(jié)構(gòu)域蛋白4（BRD4）是表觀調(diào)控蛋白BET家族成員之一［10］，已有研究發(fā)現(xiàn)BRD4是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，其可以與乙?；旧|(zhì)結(jié)合，參與細(xì)胞分裂循環(huán)過程中的基因穩(wěn)定表達(dá)，在成骨細(xì)胞分化過程中BRD4也發(fā)揮重要作用［11,12］。盡管目前BRD4分子研究的線索支持其可能在PMOP的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要調(diào)控作用，但BRD4是否和PMOP中醫(yī)病機(jī)及癥候分類存在內(nèi)在聯(lián)系尚不清楚。此外，BRD4是否有望成為中醫(yī)藥的干預(yù)靶標(biāo)也鮮見報道。鑒于六味地黃丸在治療PMOP及抗疲勞方面具有較好的臨床應(yīng)用前景，本研究通過去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠模型探討B(tài)RD4表達(dá)與六味地黃丸干預(yù)PMOP及疲勞的關(guān)系，以期從BRD4/MAPK/NF-κB轉(zhuǎn)錄因子角度探討六味地黃丸防治骨質(zhì)疏松癥的科學(xué)依據(jù)及其作用機(jī)制，為補(bǔ)腎中藥在廣大的骨質(zhì)疏松癥患者中的推廣應(yīng)用提供一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級雌性SD大鼠60只，6～8月齡，購自武漢華聯(lián)科生物科技有限公司模式動物中心，動物合格使用許可證號SYXK（河北?。?021-006。寄養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，喂養(yǎng)環(huán)境溫度設(shè)置21～25 ℃，濕度10%～30%；大鼠自由進(jìn)食和飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)后開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本研究經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)倫理委員會審批同意實(shí)施（202104100009）。

1.2 藥物與試劑

六味地黃丸[ 北京同仁堂（國藥準(zhǔn)字ZI9993068）]，參照文獻(xiàn)報道的方法計算配制六味地黃丸（385.7 mg/（kg·d）［13］，用純凈水調(diào)整至4 mL，每日上午灌胃。BRD4抗體工作濃度1∶1000、β-actin抗體工作濃度1∶3000、MAPK抗體工作濃度1∶1000、NF-κB抗體工作濃度1∶1000（Abcam）。蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度檢測試劑盒和超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（杭州碧云天生物技術(shù)公司），cGMP環(huán)磷酸鳥苷活性檢測試劑盒（BioVision），1%茜素紅染色試劑盒（索寶來）。

1.3 主要儀器

Discovery A 型小動物骨密度測試儀（Holigic），YLS-16A型小動物骨骼強(qiáng)度測定儀（濟(jì)南益延公司）。DM3000型正置熒光顯微鏡（Leica）。酶標(biāo)儀ELX800洗板機(jī)（BioTek）。全波長酶標(biāo)儀（BioTek）。

1.4 模型制備、分組和給藥

參照文獻(xiàn)報道摘除雙側(cè)卵巢，建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型［14］。腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉（40 mg/kg），無菌條件下腹部正中切口進(jìn)腹，絲線結(jié)扎卵巢并摘除?？p合切口前腹腔內(nèi)注入萬古霉素105U。手術(shù)后大鼠常規(guī)單獨(dú)飼養(yǎng)，自由飲水和進(jìn)食。術(shù)后2周實(shí)驗(yàn)動物傷口完全愈合后合籠，灌胃給藥，分為3組：假手術(shù)組、模型組（生理鹽水，10 mL/kg）、六味地黃丸組（LWDH，六味地黃丸385.7 mg/kg）。

1.5 骨密度和骨生物力學(xué)測定

完整分離雙側(cè)股骨，標(biāo)本放置于骨密度測試儀平臺上，分析檢測整體股骨的骨密度（g/cm2）。同時，通過小動物骨骼強(qiáng)度測定儀，參照文獻(xiàn)報道采用三點(diǎn)彎曲法測量骨骼強(qiáng)度［13］。

1.6 蘇木素-伊紅（HE）染色觀察骨組織結(jié)構(gòu)病理變化

用藥療程結(jié)束后，取各組大鼠雙側(cè)股骨組織標(biāo)本，4%多聚甲醛固定24 h，用10%EDTA脫鈣液（pH值8.0）脫鈣15 d后石蠟包埋。切片厚4 μm脫蠟，HE染色30 s，1%濃度鹽酸酒精分化后伊紅復(fù)染。

1.7 負(fù)重游泳力竭實(shí)驗(yàn)分析六味地黃丸抗疲勞作用

參照文獻(xiàn)報道末次給藥后1 h進(jìn)行負(fù)重游泳時間的測定［15］，主要實(shí)驗(yàn)操作如下：對大鼠進(jìn)行適應(yīng)性非負(fù)重游泳訓(xùn)練5 d，30 min/次；將大鼠尾根部負(fù)荷以其體質(zhì)量5%的重物（鉛絲），放入水深35 cm，水溫20～25 ℃的游泳缸中，注意鼠的尾巴不接觸缸底，大鼠自游泳開始至頭部自然沉降超過9 s即為負(fù)重力竭游泳時間，每次實(shí)驗(yàn)后及時吹干大鼠毛發(fā)，注意保溫。

1.8 酶聯(lián)免疫法檢測環(huán)磷酸腺苷（cGAP）和環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）

參照文獻(xiàn)報道［16］經(jīng)鼠尾取血置入促凝管，室溫靜止30 min；1500 r/min，離心20 min，收集上清，制備血清樣本備用。按試劑盒操作說明書，采用雙抗體夾心ELISA法檢測cGAP和cGMP）。主要操作如下：酶標(biāo)板反應(yīng)孔加入稀釋好后的待測血清樣本或標(biāo)準(zhǔn)品50 μL后，加入生物素標(biāo)記的抗體50 μL，37 ℃孵育45 min；用洗板機(jī)洗滌2 次；每孔加入親和鏈酶素-HRP 量為100 μL，37 ℃孵育10 min；每孔加入底物50 μL，避免光照，輕輕振蕩混勻，37 ℃孵育5 min。取出酶標(biāo)板，迅速加入終止液50 μL；使用酶標(biāo)儀測定各孔的A50nm值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算cGMP/cGMP比值。

1.9 原代成骨細(xì)胞分離和細(xì)胞培養(yǎng)

無菌條件下切取鼠的股骨皮質(zhì)骨骨片，剪成0.5 mm×0.5 mm 大小，約25 塊；將其置入含有DMEM 培養(yǎng)基細(xì)胞培養(yǎng)6孔板中，加入0.25%胰蛋白酶5 mL，37 ℃二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱消化20 min 后，用10%胎牛血清終止消化；再加入I型膠原酶10 mL（濃度為1.0 g/L），37 ℃二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱消化40 min，1000 r/min離心10 min，200目濾網(wǎng)去除骨片，收集原代成骨細(xì)胞。

1.10 茜素紅染色分析成骨細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)形成數(shù)目

按試劑盒操作說明，配制pH值為4.2的茜素紅溶液。原代成骨細(xì)胞接種6孔板培養(yǎng)14 d后，以10%中性福爾馬林進(jìn)行細(xì)胞固定，進(jìn)行茜素紅染色，顯微鏡下觀察，選取3個視野拍照，計數(shù)鈣結(jié)節(jié)形成的數(shù)目。

1.11 細(xì)胞免疫熒光分析BRD4、MAPK、NF-κB蛋白表達(dá)

原代成骨細(xì)胞接種6孔板爬片用4%多聚甲醛固定后；PBS緩沖液洗滌3次，2 min/次；滴加封閉兔血清，37 ℃孵育60 min；加入一抗MAPK和NF-κB，工作濃度分別1∶1000和1∶1000，37 ℃孵育60 min；滴加一抗工作濃度分別1∶1000，37 ℃避光孵育60 min；DAPI復(fù)染細(xì)胞核。封片后顯微鏡下觀察，選取視野拍照，利用Image J軟件分析細(xì)胞陽性染色率。

1.12 Western blotting分析股骨組織BRD4蛋白表達(dá)

稱取雙側(cè)股骨組織重量約50 mg，用含蛋白酶抑制劑的蛋白提取試劑盒提取總蛋白，并進(jìn)行熱變性制備蛋白樣品。在10%SDS-PAGE分離膠中進(jìn)行電泳，然后將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用含0.05%Tween-20和5%脫脂牛奶的Tris緩沖液封閉膜，與一抗4 ℃孵育過夜。一抗BRD4工作濃度為1∶500，內(nèi)參抗體工作濃度β-actin為1∶2000，與HRP偶聯(lián)的二抗孵育，用PBS洗滌膜后，加入超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑在暗室曝光洗片。底片掃描用Image J軟件分析灰度值。

1.13 GO分析和KEGG通路富集分析

PMOP相關(guān)數(shù)據(jù)集GSE56116從Gene Expression Omnibus（GEO）數(shù)據(jù)庫下載并用于獲得BRD4 信使RNA（mRNA）的差異表達(dá)。應(yīng)用KEGG通路富集分析和GO富集分析預(yù)測差異表達(dá)的BRD4 mRNA的相關(guān)功能。GSE56116 數(shù)據(jù)集按中醫(yī)證型將共納入10 例PMOP患者，分為3組；腎陰虛者4例，腎陽虛者3例，非腎虛者3例［17,18］。

1.14 統(tǒng)計學(xué)分析

所有統(tǒng)計均采用SPSS25.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。結(jié)果數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 六味地黃丸對PMOP模型鼠骨組織病理的影響

造模12周結(jié)束后，對各組大鼠骨密度、骨強(qiáng)度和骨組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較。骨掃描結(jié)果見圖1A，與假手術(shù)組骨密度相比較，PMOP模型組大鼠股骨的骨密度明顯降低；六味地黃丸（LWDH）組能有效提高模型組大鼠骨密度（圖1B）和骨強(qiáng)度（圖1C），但LWDH組的骨密度和骨強(qiáng)度低于假手術(shù)組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；中藥組與西藥組相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。各組大鼠股骨干組織HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠骨膜完整，骨小梁致密且分布較寬；與假手術(shù)組比較，模型組骨小梁稀少且小梁之間距離加大；LWDH組治療后的大鼠則觀察到骨小梁增加（圖1D）。

圖1 六味地黃丸改善PMOP骨組織病理Fig.1 Liuwei Dihuang(LWDH)Pills improve bone histopathology in PMOP rats.A:Representative bone density scan images.B: Comparison of bone density scans among the 3 groups.C:Comparison of bone strength among the groups.D:HE staining of the bone tissue in each group.**P＜0.01,##P＜0.01.

2.2 六味地黃丸抗鼠PMOP疲勞癥狀的作用

造模12周，PMOP模型組鼠表現(xiàn)活動減少，易激怒，飲水量增加。利用鼠負(fù)重游泳力竭時間實(shí)驗(yàn)比較了各組疲勞癥狀（圖2）。與假手術(shù)組相比較，模型組鼠負(fù)重游泳時間明顯減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組相比較，LWDH組能提高模型組負(fù)重游泳時間，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

圖2 六味地黃丸對抗PMOP鼠模型疲勞癥狀Fig.2 Effects of LWDH Pills on fatigue symptoms in PMOP rats shown by comparison of weight-bearing swimming time among the groups.**P＜0.01,##P＜0.01.

2.3 六味地黃丸對鼠血清環(huán)核苷酸水平的影響

通過檢測各組鼠的血清核苷酸水平發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比較，模型組鼠血清cAMP（圖3A）、cGMP（圖3B）和cAMP/cGMP明顯升高（圖3C），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組相比，LWDH組鼠的cAMP和cGMP顯著降低（P＜0.01）。但是假手術(shù)組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3 六味地黃丸減輕鼠PMOP血清cAMP和cGMP濃度Fig.3 Effect of LWDH Pills on serum cAMP and cGMP levels in in each group.A:Serum cAMP levels.B:Serum cGMP levels.C:Ratio of cAMP to cGMP.**P＜0.01,***P＜0.001,##P＜0.01,###P＜0.001.

2.4 六味地黃丸促進(jìn)成骨細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)形成的影響

分離培養(yǎng)獲得原代成骨細(xì)胞后（圖4），進(jìn)行茜素紅染色觀察成骨細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)形成情況。結(jié)果顯示（圖5），與假手術(shù)組相比較，模型組成骨細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)形成數(shù)明顯減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。與模型組相比較，LWDH組鈣結(jié)節(jié)形成數(shù)明顯增多，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

圖4 股骨成骨細(xì)胞原代培養(yǎng)Fig.4 Primary culture osteoblasts from femur(Original magnification:×200).

圖5 六味地黃丸促進(jìn)成骨細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)形成Fig.5 LWDH Pills promote the formation of calcium nodules in osteoblasts(Alizarin red staining,×200).**P＜0.01,***P＜0.001,##P＜0.01.

2.5 六味地黃丸減少POMP骨組織中BRD4蛋白表達(dá)的表達(dá)

Western blot檢測各組骨組織中BRD4蛋白表達(dá)結(jié)果（圖6），與假手術(shù)組比較，模型組BRD4蛋白表達(dá)升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，LWDH中藥干預(yù)后，BRD4蛋白表達(dá)均呈現(xiàn)下降趨勢，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

圖6 六味地黃丸抑制BRD4蛋白表達(dá)Fig.6 LWDH Pills inhibit the expression of BRD4 protein in femoral bone tissues.**P＜0.01,##P＜0.01.

2.6 六味地黃丸減少POMP成骨細(xì)胞中BRD4、MAPK和NF-κB蛋白的表達(dá)

成骨細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果顯示（圖7A），LWDH干預(yù)后，POMP成骨細(xì)胞中BRD4蛋白表達(dá)水平下調(diào)。同時，MAPK（圖7B）和NF-κB（圖7C）蛋白細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組MAPK和NF-κB蛋白表達(dá)升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）；與模型組比較，LWDH干預(yù)后，MAPK和NF-κB蛋白表達(dá)均呈現(xiàn)下降趨勢，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

圖7 六味地黃丸抑制成骨細(xì)胞中BRD4、MAPK和NF-κB蛋白表達(dá)Fig.7 Immunofluorescence assay showing the effects of LWDH Pills on subcellular distribution of BRD4(A),MAPK(B)and NF-κB(C)in the osteoblasts(×200).**P＜0.01,###P＜0.001,##P＜0.01,#P＜0.05.

2.7 BRD4轉(zhuǎn)錄水平與PMOP腎虛分型的分析

將GSE56116 測序數(shù)據(jù)分為PMOP 腎陰虛、腎陽虛、非腎虛3 組進(jìn)行比較（圖8A）。腎陰虛組BRD4 mRNA表達(dá)明顯高于腎陽虛組和非腎虛組，差異具有顯著性（P＜0.05）。為進(jìn)一步研究BRD4在腎虛型PMOP中的分子作用基礎(chǔ)，將PMOP分為BRD4 mRNA高表達(dá)組和低表達(dá)組（圖8B）。BRD4 mRNA 高表達(dá)涉及FAAP24、CDH16、PAGE2B、IGSF21 等基因改變；BRD4 mRNA低表達(dá)涉及C17ORF97和BTB結(jié)構(gòu)域的16（ZBTB16）基因改變。

圖8 PMOP腎虛分型與BRD4 mRNA的差異表達(dá)Fig.8 Analysis of the differential BRD4 mRNAexpressions in PMOP kidney deficiency subtypes.*P＜0.05.

2.8 腎陰虛型PMOP及BRD4調(diào)控相關(guān)信號通路及功能的預(yù)測分析

使用GSE56116腎陰虛型PMOP數(shù)據(jù)進(jìn)行KEGG通路分析和GO功能富集分析（圖9）。KEGG通路分析（圖9A），BRD4表達(dá)上調(diào)涉及神經(jīng)配體受體反應(yīng)、細(xì)胞骨架重排及細(xì)胞因子相互作用等信號通路；BRD4表達(dá)下調(diào)涉cAMP、局部粘附、胞嘧啶代謝信號通路。GO富集分析（圖9B），BRD4表達(dá)第二信使介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)、粒細(xì)胞集落刺激因子趨化性等。

3 討論

六味地黃丸是一種由熟地黃、山藥、牡丹皮等藥物組成的中成藥。盡管六味地黃丸治療PMOP臨床療效取得肯定［19］，但其作用于PMOP多成分、多靶點(diǎn)間的相互關(guān)系及作用機(jī)制仍有待深入研究。我們的研究結(jié)果表明，六味地黃丸干預(yù)PMOP動物模型，可下調(diào)表觀調(diào)控分子BRD4蛋白表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，BRD4的抑制因子JQ1 參與PMOP 破骨細(xì)胞分化和病理性骨丟失的調(diào)控。BRD4可讀取組蛋白的乙酰賴氨酸，從而改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)以確定干細(xì)胞命運(yùn)和脂肪形成，敲除BRD4表達(dá)顯著減輕糖皮質(zhì)激素介導(dǎo)的對H3K9ac結(jié)合Runx2啟動子的抑制、提高骨鈣素和Runx2的表達(dá)、礦化基質(zhì)堆積［11］。我們通過原代培養(yǎng)的成骨細(xì)胞觀察成骨細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)形成情況，發(fā)現(xiàn)六味地黃丸治療組鈣結(jié)節(jié)形成數(shù)增多，提示六味地黃丸抑制BRD4蛋白表達(dá)，可能通過骨鈣素和Runx2信號通路，促進(jìn)鈣結(jié)節(jié)形成。這可能是六味地黃丸治療PMOP的新作用分子機(jī)制。

LWDH干預(yù)PMOP模型后，我們通過Western blot和免疫熒光染色方法檢測，研究發(fā)現(xiàn)POMP成骨細(xì)胞MAPK和NF-κB蛋白表達(dá)呈現(xiàn)下降趨勢。既往研究表明，破骨細(xì)胞的分化和形成依賴于巨噬細(xì)胞集落刺激因子和核因子κB受體活化因子配體的激活［10］。RANKL與核因子κB受體活化因子的結(jié)合會誘導(dǎo)腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6的募集，從而刺激破骨細(xì)胞生成所需的下游MAPK和NF-κB信號通路。同時，我們通過生物信息學(xué)方法進(jìn)一步研究六味地黃丸治療PMOP 中的分子作用基礎(chǔ)，發(fā)現(xiàn)六味地黃丸下調(diào)BRD4蛋白表達(dá)，可能涉及FAAP24、CDH16、PAGE2B、IGSF21、C17ORF97 和ZBTB16 基因表達(dá)改變。Yu 等［20］研究表明，在成骨過程中成骨細(xì)胞基因上的組蛋白被乙酰化，從而使BRD4能夠與成骨細(xì)胞基因ZBTB16結(jié)合?；贐RD4分子研究背景和我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，BRD4蛋白表達(dá)下調(diào)和炎癥相關(guān)信號通路的抑制，這可能是六味地黃丸作用PMOP的另一新的分子機(jī)理。

中醫(yī)學(xué)對骨質(zhì)疏松認(rèn)識較早，且發(fā)現(xiàn)證型繁多［18］。唐·孫思邀《備急千金要方·骨虛實(shí)第六》論曰:“骨虛者，酸疼不安好倦”。華佗《勞傷論第十九》:“勞者，勞于神氣也；傷者，傷于形容也”。由此可見，疲勞是引起PMOP患者臨床癥狀的重要病因。契合現(xiàn)代臨床上大量研究表明PMOP表現(xiàn)精神疲憊、四肢倦痛乏力等系列疲勞癥狀［8,21,22］。PMOP疲勞癥狀是歸屬多臟器虛損。我們分析了公共數(shù)據(jù)庫中BRD4基因表達(dá)與PMOP中醫(yī)腎虛癥候的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)腎陰虛組BRD4 mRNA表達(dá)明顯高于腎陽虛組和非腎虛組。此外，血清檢測結(jié)果顯示cAMP/cGMP比例明顯升高，也符合腎陰虛的特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示六味地黃丸能明顯提高PMOP鼠的負(fù)重游泳時間，符合改善疲勞的特征；BRD4可能是腎陰虛型PMOP疲勞相關(guān)基因，其過表達(dá)可預(yù)測六味地黃丸療效。中醫(yī)對PMOP的病因病機(jī)、治則治法的認(rèn)識均認(rèn)為腎虛為發(fā)病的關(guān)鍵。六味地黃丸治療腎陰虧虛引起的骨質(zhì)疏松、骨折、骨痛等癥狀，能夠起到一定的治療效果。在本研究中，六味地黃丸能改善PMOP及疲勞是新的發(fā)現(xiàn)。

一般而言，表觀遺傳調(diào)控機(jī)制，特別是DNA甲基化，可調(diào)節(jié)多種疾病的基因表達(dá)，包括與骨代謝有關(guān)的關(guān)鍵基因［23］。其可能與骨質(zhì)疏松多個信號通路激活有一定內(nèi)在聯(lián)系，諸如PINK1/Parkin 信號通路和PI3K/Akt信號通路等［24,25］。新近研究證據(jù)表明，PMOP情志相關(guān)的抑郁是疾病發(fā)生、進(jìn)展和合并癥的高危因素［26,27］。BRD4的異常表達(dá)參與神經(jīng)炎癥，可能和情志失調(diào)有關(guān)［28］。但是這些致病風(fēng)險因素與BRD4是否存在關(guān)聯(lián)，尚有待開展體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步予以證實(shí)。綜上所述，鑒于PMOP分子作用機(jī)制研究方興未艾，BRD4的重要作用使其成為骨質(zhì)疏松癥的新興治療靶點(diǎn)。