環(huán)磷酰胺聚乳酸微球的制備及其緩釋過程的研究*

吳慧敏,錢文斌

(1.湖北科技學(xué)院醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院,湖北 咸寧 437100;2.湖北科技學(xué)院醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide,CP)是臨床上最常見的烷化劑類抗腫瘤藥,應(yīng)用范圍廣,主要用于淋巴瘤、骨髓瘤、乳腺癌、肺癌和卵巢癌等[1-2],治療效果好。由于CP進(jìn)入人體后對(duì)癌細(xì)胞和正常細(xì)胞的非選擇特異性,使得藥物在治療癌癥的同時(shí)也產(chǎn)生了嚴(yán)重的毒副作用[3]。CP具有明顯的療效-劑量依賴關(guān)系[4-5],因此,如何提高藥物的局部濃度,降低毒副作用一直是研究的重要方向。將CP與高分子材料混合制成聚合物緩釋微球,不僅可以減少給藥次數(shù),降低毒副作用,還可以提高藥物的生物利用度。

微球(microspheres)是粒徑范圍1～1000μm,以適宜高分子材料為載體包裹或吸附藥物而制成的球形或類球形微粒。微球作為藥物載體不僅可以提高藥物的生物利用度,降低藥物不良反應(yīng),在抗癌藥物上還具有靶向性[6]。高分子材料聚乳酸(Polylactic acid,PLA)作為無毒、可生物降解的高分子材料已被FDA批準(zhǔn)用作藥物緩、控釋制劑的載體。目前,以聚乳酸為載體的抗癌藥物的研究主要有表阿霉素、紫杉醇、甲氨蝶呤和氟尿嘧啶等[7-10],很少有環(huán)磷酰胺聚乳酸微球的研究。因此,本文采用乳化溶劑揮發(fā)法[11],以PLA為載體材料,二氯甲烷為溶劑,環(huán)磷酰胺為模型藥物,制備了高分子微球,為臨床應(yīng)用提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

實(shí)驗(yàn)所需的主要材料與儀器詳見表1、2。

表1 實(shí)驗(yàn)所需主要材料

表2 實(shí)驗(yàn)所需儀器

1.2 方法

1.2.1 檢測(cè)方法的確定

檢測(cè)波長(zhǎng)的確定:精密稱取環(huán)磷酰胺并用純水定容后,在190～400nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示,在195nm處環(huán)磷酰胺的吸光度最大。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定:分別精密取環(huán)磷酰胺標(biāo)準(zhǔn)品0.02、0.03、0.05、0.12g將其溶于純水中并定容至1L。用純水做空白組對(duì)照,用紫外分光光度計(jì)于195nm處檢測(cè)吸光度A。以環(huán)磷酰胺的濃度(x)對(duì)吸光度A值(y)進(jìn)行線性回歸。

1.2.2 載藥微球的制備方法

采用O/W型乳化溶劑揮發(fā)法制備載藥微球。水相準(zhǔn)備:精密稱取表面活性劑放入圓底燒瓶中,倒入40mL純水,置于加熱磁力攪拌器上攪拌,表面活性劑完全溶解后冷卻到室溫備用。油相準(zhǔn)備:稱取一定量的PLA放入圓底燒瓶中,加入4mL CH2Cl2,放在超聲波清洗器中超聲乳化10min,再加入CP超聲乳化30s,形成油相。在磁力攪拌的條件下,將有機(jī)相緩慢勻速的加入水相中,持續(xù)攪拌數(shù)小時(shí)確保有機(jī)溶劑最大限度的被揮發(fā),然后離心,用純水沖洗最少3次,烘干,得到環(huán)磷酰胺聚乳酸微球。

1.3 單因素考察

本研究采用單因素試驗(yàn)篩選出制備環(huán)磷酰胺聚乳酸載藥微球的最佳工藝。 在進(jìn)行試驗(yàn)之前,通過查閱相關(guān)文獻(xiàn),確定了油相與水相體積比為1∶10[12]。以載藥微球外觀、粒徑及聚合物分散性指數(shù)(polymer dispersity index,PDI)為評(píng)價(jià)指標(biāo),PDI反映粒徑分布寬度,范圍0～1,數(shù)值越小,代表粒度越均勻,粒度分布越集中。采用單因素實(shí)驗(yàn)方法探討各種因素對(duì)載藥微球質(zhì)量的影響。考察因素包括表面活性劑的種類及濃度、聚乳酸的濃度、環(huán)磷酰胺與聚乳酸的比例、攪拌速度及揮發(fā)時(shí)間。通過粒徑分布、顯微鏡觀察判斷載藥微球的質(zhì)量,選出最優(yōu)方案制備載藥微球,并計(jì)算包封率與載藥量。

1.3.1 表面活性劑的選擇

以載藥微球的外觀、粒徑和PDI為評(píng)價(jià)指標(biāo),對(duì)制備過程中使用的表面活性劑Tween20、Tween80和PVA進(jìn)行考察,根據(jù)外觀、粒徑和PDI實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇最佳的表面活性劑。

1.3.2 表面活性劑濃度的考察

固定其他條件不變,精密稱取一定量的PVA,分別考察PVA濃度為0.5%、1%、2%、3%、4%時(shí)對(duì)載藥微球的外觀、粒徑以及PDI的影響。

1.3.3 PLA濃度的考察

固定其他條件不變,精密稱取一定量的PLA,分別配制濃度為5、10、15、20、30mg/mL PLA對(duì)載藥微球的外觀、粒徑以及PDI的影響。

1.3.4 CP與PLA比例的考察

將CP與PLA的比例分別設(shè)置為1∶3、1∶6和1∶10,其他條件不變,考察其對(duì)載藥微球的粒徑和PDI的影響。

1.3.5 攪拌速度的考察

將磁力攪拌器的攪拌速度設(shè)置為300、400、500rpm,固定其他條件,考察攪拌速度對(duì)載藥微球的粒徑及PDI的影響。

1.3.6 攪拌時(shí)間的考察

固定其它條件不變,分別考察攪拌1、3、5、7、12h時(shí)對(duì)載藥微球外觀、粒徑以及PDI的影響。

1.4 載藥微球的形態(tài)觀察及粒徑分布

用光學(xué)顯微鏡初步觀察微球的外觀形態(tài),用激光粒度分析儀分析粒徑,并用Origin(2019版)繪圖。

1.5 載藥量與包封率

載藥量是載藥微球中所含藥物的重量百分率,載藥量可由下式計(jì)算:

(1)

包封率是載藥微球內(nèi)藥量占投藥量的百分比,包封率可通過下式計(jì)算:

(2)

1.6 體外模擬

采用透析膜囊[12]進(jìn)行體外模擬實(shí)驗(yàn),精密稱取環(huán)磷酰胺聚乳酸微球50mg,置于透析袋內(nèi),加入3mL透析介質(zhì)并將透析袋兩端扎緊,將其投入含有100mL pH為7.4的磷酸緩沖液的燒杯中,以100rpm轉(zhuǎn)速,(37±0.5)℃恒溫水浴震蕩,分別于0、1、3、5、7、12、24、36、48、96、108h取出1mL磷酸緩沖液,并向燒杯內(nèi)補(bǔ)加同體積的磷酸緩沖液。用紫外可見分光光度計(jì)對(duì)取出的溶液進(jìn)行分析,測(cè)定載藥微球的藥物含量,計(jì)算累計(jì)釋藥率,繪制釋放曲線。

2 結(jié) 果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以環(huán)磷酰胺的濃度(x)對(duì)吸光度A值(y)進(jìn)行線性回歸,得到的回歸方程y=3.4x-0.00035,R2=0.999,見圖1。

圖1 環(huán)磷酰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 表面活性劑的選擇

表面活性劑具有較強(qiáng)的親水基和親油基,乳化能力強(qiáng),在乳化的過程中能有效的降低兩相間的界面張力,形成乳滴。因此,選擇合適的表面活性劑是制備微球的關(guān)鍵因素之一。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示,表面活性PVA制備的載藥微球平均粒徑和PDI均是最小的,由于粒徑小載藥微球的降解速度較快,能快速達(dá)到血藥濃度。因此,本實(shí)驗(yàn)選定表面活性劑為PVA。

表3 不同表面活性劑制備的聚乳酸載藥微球

2.3 表面活性劑(PVA)濃度的選擇

表面活性劑能防止PLA聚集,當(dāng)PVA質(zhì)量分?jǐn)?shù)低時(shí),相界面上吸附的PVA分子較少,界面膜強(qiáng)度較差,形成的乳滴穩(wěn)定性也較差。當(dāng)PVA濃度增高,界面膜強(qiáng)度相應(yīng)增強(qiáng);使分子聚結(jié)時(shí)阻力變大,形成的乳滴穩(wěn)定性更好。但是隨著PVA濃度的增加,載藥微球出現(xiàn)黏連,粒徑變大。因此,當(dāng) PVA在適當(dāng)濃度才具有更佳的效果[13]。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖2)可看出,當(dāng)PVA濃度為0.5%時(shí)平均粒徑雖然最小,但是PDI相對(duì)較高,粒徑分布寬,分子量分布不均勻。當(dāng)PVA濃度為1%、2%、3%時(shí),載藥微球的平均粒徑相差不大,而PVA的濃度為1%時(shí)PDI最小,故選定PVA的濃度為1%。

圖2 不同濃度PVA制作的載藥微球

2.4 聚乳酸濃度的選擇

在成球范圍內(nèi),聚乳酸的濃度與載藥微球的平均粒徑成正比。這是因?yàn)榫廴樗釢舛仍酱?內(nèi)分散相的黏度就越大,相同轉(zhuǎn)速下更不易分散,微球的粒徑也隨之逐漸增大。但聚乳酸的濃度過小,會(huì)造成載藥微球表面塌陷[10]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖3)顯示當(dāng)PLA的濃度為10、15、20mg/mL時(shí)所制作的載藥微球的平均粒徑差距不明顯,但在PLA的濃度為20mg/mL時(shí)PDI的值最小,因此,選定PLA的濃度為20mg/mL。

圖3 不同濃度PLA制作的載藥微球

2.5 環(huán)磷酰胺與聚乳酸的比例

用顯微鏡可以觀察到微球粒徑隨CP含量的增加而變大,PDI無明顯差異(見表4)。而且在CP與PLA的比例為1∶3時(shí),內(nèi)分散相的濃度較高,500rpm的攪拌速度不能使內(nèi)分散相完全分散到外分散相中[14]。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制了不同比例下載藥微球粒徑正態(tài)分布圖(如圖4),三種比例的載藥微球均成正態(tài)分布,且CP與PLA的比例為1∶10時(shí)微球的總量最多,平均粒徑最小,因此,選定CP與PLA的比例為1∶10。

圖4 不同CP與PLA的比例制作的載藥微球正態(tài)分布圖

表4 不同CP與PLA的比例制作的載藥微球

2.6 攪拌速度

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5,在300～500rpm內(nèi),環(huán)磷胺聚乳酸載藥微球的平均粒徑隨著轉(zhuǎn)速的增加而減小,PDI差距均小于0.35,微球粒徑分布均一。多次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在攪拌速度為500rpm時(shí),載藥微球的平均粒徑為(12.35±3.86)μm,PDI的平均值為(0.31±0.012)。因此,攪拌速度500rpm為最佳轉(zhuǎn)速。

圖5 不同攪拌速度制備的載藥微球

2.7 攪拌時(shí)間

不同攪拌時(shí)間制備的環(huán)磷酰胺聚乳酸載藥微球的粒徑、PDI結(jié)果見圖6。在1～7h內(nèi),隨著攪拌時(shí)間的增加,平均粒徑逐漸減小,攪拌時(shí)間為1h時(shí),由于時(shí)間太短,水相與油相的聚結(jié)和團(tuán)聚尚未全部完成。揮發(fā)時(shí)間至7h時(shí),制得的平均粒徑最小為13.02μm,PDI的平均值為0.22。當(dāng)揮發(fā)時(shí)間加到12h時(shí),平均粒徑為12.99μm,但是PDI數(shù)值明顯增加,載藥微球大小分布不均一,也不符合工業(yè)化生產(chǎn)的要求?；旌舷嘣诖帕嚢?h后,環(huán)磷酰胺聚乳酸載藥微球的粒徑及PDI進(jìn)一步降低,繼續(xù)攪拌至12h與攪拌7h比較,攪拌7h各項(xiàng)指標(biāo)更優(yōu),故確定制備工藝攪拌時(shí)間為7h。

圖6 不同攪拌時(shí)間制備的環(huán)磷酰胺載藥微球

2.8 載藥微球性能

2.8.1 最佳實(shí)驗(yàn)條件下載藥微球的表征

最佳實(shí)驗(yàn)條件如表5所示,在最佳實(shí)驗(yàn)條件下多次實(shí)驗(yàn)得到了平均粒徑為(12.67±3.67)μm,分布均勻的環(huán)磷酰胺聚乳酸微球,如圖7所示。

a.載藥微球熒光顯微鏡圖(×200);b.載藥微球掃描電鏡圖(×10K)。圖7 最優(yōu)實(shí)驗(yàn)方案的微球圖

表5 最佳實(shí)驗(yàn)方案

2.8.2 載藥量和包封率的測(cè)定

按照最優(yōu)實(shí)驗(yàn)方案制備3批環(huán)磷酰胺聚乳酸載藥微球,分別按公式(1)和(2)計(jì)算載藥量和包封率,平均載藥量為15.38%,包封率為62.5%。

2.8.3 環(huán)磷酰胺聚乳酸載藥微球的體外模擬

用零級(jí)釋放動(dòng)力學(xué)方程、一級(jí)釋放動(dòng)力學(xué)方程以及Higuchi方程對(duì)最優(yōu)制備工藝下制備的載藥微球在pH 7.4磷酸緩沖液中的釋放曲線進(jìn)行擬合,詳見表6。從動(dòng)力學(xué)擬合方程中R2進(jìn)行分析,Higuchi動(dòng)力學(xué)模型對(duì)環(huán)磷酰胺聚乳酸微球的體外釋放有很好的擬合度。從釋放曲線(圖8)可以看出藥物在前12h釋放速度快,釋放了33.98%,這可能是在包埋過程中,游離態(tài)的環(huán)磷酰胺附著在聚乳酸微球的表面,在磷酸鹽緩沖液中很快就釋放出來。108h釋放84.07%。

a.零級(jí)動(dòng)力學(xué)模型;b.一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型;c.Higuchi模型。圖8 環(huán)磷酰胺聚乳酸微球的體外釋放曲線

表6 體外動(dòng)力學(xué)模型的擬合

3 討 論

環(huán)磷酰胺是經(jīng)典抗癌藥,本研究以聚乳酸為包材,環(huán)磷酰胺為囊材,以二氯甲烷為溶劑,聚乙烯醇為表面活性劑,用O/W乳化溶劑揮發(fā)法制備了環(huán)磷酰胺聚乳酸微球,制備方法簡(jiǎn)單,制備的載藥微球形態(tài)規(guī)整,呈球型,分布均勻,平均粒徑(12.67±3.67)μm,平均載藥量為15.38%,包封率為62.5%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明載藥微球在體外釋放效果良好,為進(jìn)一步的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及臨床應(yīng)用提供了參考數(shù)據(jù)。