基于蜂花粉質量控制現(xiàn)狀的問題分析及研究展望

朱娟娟,盧琪,曲珍妮,呂暢,周巧,石典花,戴衍朋

(山東省中醫(yī)藥研究院,國家中醫(yī)藥管理局中藥蜜制和制炭炮制技術與原理重點研究室,山東 濟南 250014)

蜂花粉為蜜蜂科動物意大利蜜蜂(ApismelliferaLinnaeus)或中華蜜蜂(ApisceranaFabricius)采集的顯花植物雄蕊或裸子植物孢子囊內花粉細胞,加入采集的花蜜和自身分泌物形成的花粉團。蜂花粉是含有多種生物活性物質的天然營養(yǎng)源,主要有蛋白質、氨基酸、多糖、維生素、不飽和脂肪酸、多酚類和黃酮類等活性物質[1-2],還含有磷脂和生長激素[3],能促進兒童生長發(fā)育,同時還能增強遺傳物質和蛋白質的合成,參與糖和脂肪代謝、調節(jié)。具有提高免疫力、增強體質、清除自由基[4-5]、抗腫瘤[6-8]、抗衰老[9]和治療便秘等多種功效,被譽為“人類天然食品中的瑰寶”。

中醫(yī)藥是我國的瑰寶,千百年來在保障中華民族的繁衍昌盛方面發(fā)揮著極為重要的作用。2019年底至今,在治療和預防新型冠狀病毒感染工作中,中醫(yī)藥發(fā)揮了顯著作用,進一步證實中醫(yī)藥在治療和預防疾病方面具有獨特的優(yōu)勢。但中醫(yī)藥的現(xiàn)狀和發(fā)展依然存在一些問題,較為突出的是中藥材及飲片的質量一致性問題,因此完善和提升中藥材或飲片質量控制標準是加快促進中醫(yī)藥的高質量發(fā)展最為有效和關鍵手段。藥食兩用的蜂花粉富含大量對人體有益的活性成分,在保健和預防治療方面應用均較為廣泛,需求量巨大,由此如何確保蜂花粉質量安全,保障其有效性是急需解決的問題。通過查閱國內外近年來有關文獻,本文從質量控制方面對蜂花粉的研究進展進行概述,以期為建立健全蜂花粉的產品標準體系及其質量安全評價體系提供參考。

1 現(xiàn)行標準收載情況及存在的問題

1.1 現(xiàn)行標準及收載情況蜂花粉在歷版《中國藥典》中均未被收錄;全國僅有6省現(xiàn)有中藥材標準中收載了蜂花粉藥材,詳情見表1。

表1 蜂花粉各地中藥材標準收載情況

1.2 現(xiàn)有質量標準存在的問題

1.2.1 命名與來源不一一方面,蜜蜂采集花粉時,植物的孢粉源不同,蜂花粉的種類也不相同?，F(xiàn)有藥材標準中貴州省、山東省、吉林省藥材標準中收錄為蜂花粉藥材,《甘肅省中藥材標準》收錄油菜蜂花粉,《浙江省中藥材標準》收錄茶花粉和油菜花粉,《福建省中藥材標準》收錄玉米花粉和油菜花粉?，F(xiàn)有蜂花粉藥材標準中命名不統(tǒng)一,不規(guī)范的中藥名稱可能導致中藥飲片處方調劑混亂,成為危及藥品質量及醫(yī)療安全的隱患。另一方面,現(xiàn)有標準從來源上大部分限制了蜂花粉的種類,蜂花粉資源優(yōu)勢還遠遠未體現(xiàn)出來,嚴重制約了行業(yè)的發(fā)展。

1.2.2 檢驗項差異較大6省中藥材標準中《山東省中藥材標準》含量測定項為含氮量,專屬性成分鑒別空缺,設定的標準薄弱。檢查項下福建省中藥材標準中收載的玉米花粉和油菜花粉中規(guī)定了雜質限量,分別為15%和2%,差異較大,其他省藥材標準中未收錄雜質檢查項。

鑒別項下,山東省和福建省只有顯微鑒別一項,其他省份增加了顯色或薄層鑒別項,其中吉林省和浙江省藥材標準中為顯色反應,專屬性差?！陡拭C省中藏藥材標準》(2020年版)中增加了以對照藥材為對照的薄層色譜鑒別,僅《貴州省中藥材民族藥材質量標準》(2019年版)中為以山柰素為對照品的薄層鑒別專屬性更強。

含量測定方面,2017年版《浙江省中藥材標準》以紫外分光光度法測得油菜花粉總黃酮含量,規(guī)定其總量以無水蘆丁計不得少于3.0%。山東省、貴州省、吉林省、浙江省和福建省中藥材標準中僅規(guī)定了含氮量,以總黃酮和含氮量作為含量測定指標缺乏專屬性?！陡拭C省中藥材標準》(2020年版)中收錄的油菜蜂花粉中增加了以槲皮素和山柰素為對照的含量測定項,專屬性強且解決了化學成分含量標準的空缺,但標準中僅收載油菜蜂花粉,蜂花粉質量標準的制定未充分考慮到蜂花粉的多來源性和不同來源蜂花粉存在的化學成分差異問題。

1.2.3 用法、用量不統(tǒng)一山東省、吉林省、貴州省、浙江省、福建省的藥材標準中僅規(guī)定用量和服用次數(shù)?！陡拭C省中藥材標準》(2020年版)中規(guī)定用法用量為：取經破壁的花粉適量,沖服或入制劑?，F(xiàn)行藥材標準中蜂花粉的用法用量差異大,不規(guī)范,輕者影響患者的治療效果,甚至導致用藥安全問題的發(fā)生。

2 蜂花粉質量控制研究進展

2.1 影響蜂花粉質量的因素

2.1.1 產地、來源差異不同產地和來源蜂花粉中蛋白質和礦物質含量差異較大[10-11]。不同來源蜂花粉中總黃酮含量和自由基清除力差異亦較大,其中油菜蜂花粉中總黃酮含量最高,具有較強的自由基清除和抗氧化能力[12]。任乃艷[11]對15種蜂花粉的總黃酮含量進行分析發(fā)現(xiàn)五味子蜂花粉黃酮含量最高,油菜花次之,是獼猴桃蜂花粉總黃酮含量的6.7倍。張紅城等[13]對6種不同蜂花粉的多酚及黃酮提取物含量進行了對比,結果油菜蜂花粉的黃酮類化合物含量最高,是荷花蜂花粉黃酮類含量的近27倍。牛德芳等[14]測定了市面上常見的7種蜂花粉的總黃酮含量,結果油菜蜂花粉的總黃酮含量顯著高于其他蜂花粉。黃新球等[15]測定了5種蜂花粉的蛋白質、氨基酸和礦物質含量,結果均存在較大差異,從提供優(yōu)質蛋白營養(yǎng)量來看,茶花蜂花粉優(yōu)于油菜花蜂花粉等。

2.1.2 重金屬有害元素殘留重金屬元素是一種可以通過一系列途徑富集于植物體內,通過食物鏈危害人體健康的高毒性、持久性、難降解的環(huán)境污染物。有研究表明重金屬的控制和管理是中藥材急需解決的問題[16]。李碩等[17]對油菜花粉和茶花粉中7種重金屬元素含量進行了考察,發(fā)現(xiàn)油菜花粉和茶花粉均存在重金屬污染問題。魏月[18]發(fā)現(xiàn)與蜂蜜和蜂膠比較,蜂花粉與環(huán)境介質之間存在更多、更穩(wěn)定的顯著相關關系,更易受到環(huán)境中的重金屬污染且逐漸累積。

2.1.3 抗生素、農藥殘留養(yǎng)蜂生產中,為了防病治病蜂農會使用或者在飼料中添加抗生素,容易造成蜂產品抗生素殘留。花粉中農藥的主要來源是花期前后噴灑農藥和加工過程中混入農藥,尤其是隨著新藥物的開發(fā)使用,蜂產品中藥物殘留的種類也隨之增多,監(jiān)測抗生素和農藥殘留成為蜂花粉質量控制中一個重要因素。蜂花粉中檢出農藥種類多,除了在蜂蜜中常檢出的新煙堿類、有機磷類、擬除蟲菊酯類外,還常能檢出氨基甲酸酯類、大環(huán)內酯類和苯基吡唑及其代謝物等[19]。對國內市場上的蜂花粉農藥殘留檢測發(fā)現(xiàn),噻蟲胺、吡蟲啉、多菌靈、三唑醇、噻蟲嗪、吡蟲脒、嘧菌酯、蠅毒磷和毒死蜱等9種農藥廣泛分布于蜂花粉中[20]。有學者[21-22]運用氣相色譜-質譜聯(lián)用對蜂花粉中的有機氯農藥殘留進行檢測,發(fā)現(xiàn)有一定的殘留。宋梓豪[19]建立了蜂花粉中53種農藥及5種代謝物的簡單、快速、靈敏、穩(wěn)定的檢測方法,監(jiān)測結果顯示,在21個省區(qū)70種蜂花粉樣品中28批次蜂花粉樣品檢出13種農藥,檢出率較高的為毒死蜱(18.6%)、啶蟲脒(10.0%)、噻蟲嗪(7.1%)。《中國藥典》2020年版要求植物類藥材全面禁用新增的33種農藥,禁用農藥推薦應用液相色譜串聯(lián)質譜檢測的有22種,推薦應用氣相色譜串聯(lián)質譜檢測的有22種,其中11種化合物可同時用兩種方法檢測,最低定量限0.01 mg·kg-1。藥食兩用的蜂花粉在抗生素農藥殘留的風險評估及限量標準的研究工作應加快推進。

2.1.4 用法、用量蜂花粉細胞的外壁堅硬 (主要由孢粉素、蛋白質、纖維素、果膠質等組成),由于孢粉素是一種類似角質或木栓質的脂類物質,可耐酸、耐堿、耐溫、耐壓、耐生物分解等,進而影響其活性成分的溶出[23],在一定程度上限制了蜂花粉的開發(fā)利用。吳偉等[24]研究發(fā)現(xiàn)在未破壁的蜂花粉中幾乎一半的營養(yǎng)素沒有被消化吸收,直接排出體外。破壁蜂花粉經體內外消化后,其蛋白質和粗脂肪等主要營養(yǎng)素消化率可達85%,還原糖和氨基酸的釋放速率提高了1.5～2倍。破壁更容易使營養(yǎng)物質充分釋出有利于消化吸收。肖興英等[25]對破壁前后油菜蜂花粉中黃酮含量進行測定,槲皮素-3-O-槐糖苷和山柰素-3-O-槐糖苷在含量上分別提高了73.5%和47.8%,破壁有利于黃酮類成分的釋放。有學者[23,26]總結了目前蜂花粉破壁技術進展,發(fā)現(xiàn)不同來源的蜂花粉不僅在結構上存在較大差異,其破壁技術也不盡相同。蜂花粉的用法用量值得更深一步的探索。

2.2 蜂花粉檢驗項研究進展蜂花粉鑒別檢查目前主要包括光譜和薄層鑒別,符致秋等[27]通過掃描電子顯微鏡和表面增強拉曼光譜建立了7種蜂花粉的快速鑒別方法。吳杰等[28]采用傅立葉變換紅外光譜對6種不同蜂花粉進行快速無損鑒別,以上僅對蜂花粉的品種來源進行區(qū)分。王滿生等[29]運用TLC-DPPH對油菜花粉粗黃酮提取物成分分析,可快捷、直觀的篩選出蜂花粉中具有清除自由基或抗氧化活性的化合物,但在定性鑒別方面相對于傳統(tǒng)的TLC鑒別方法不夠簡便直觀。姚海清等[30]用普樂安片做對照藥材建立蜂花粉的TLC鑒別方法。寧生榮[31]建立了以山柰素-3-O-β-D-(2-O-β-D-葡萄糖基)吡喃葡萄糖苷(KMP)為對照的油菜蜂花粉TLC定性鑒別方法,提供了具有較強專屬性的質量評價依據(jù)。

蜂花粉含量測定研究主要有蛋白質、黃酮和多糖3個方面。其中蛋白質測定方面,周望庭等[32]用凱氏定氮法測定了枸杞蜂花粉中蛋白質含量,并采用OPA柱前衍生法進行了游離氨基酸含量測定。牛德芳等[14]用凱氏定氮法測定了7種蜂花粉中蛋白質含量,并用自動氨基酸分析儀測定氨基酸的濃度。含氮量測定無法對其主要有效成分建立定性、定量檢測方法,無法對其質量進行全面評價與控制。黃酮類化合物具有降血脂、抗動脈硬化、抗炎等多種生理活性,目前對蜂花粉中多酚和黃酮類化合物含量測定多采用紫外分光光度法[12,32-35],該方法無法對單一成分進行定量。姚海清等[30]采用HPLC測定油菜蜂花粉中槲皮素和山柰素的含量,作為油菜蜂花粉的質量控制標準。鄭敏燕等[36]采用HPLC法測定油菜花粉中槲皮素、山柰素和異鼠李素含量,結果分別為0.928%、0.295%和0.0834%。王滿生等[29]采用HPLC法測定油菜蜂花粉中槲皮素和山柰素含量。槲皮素、山柰素結構骨架的黃酮苷及苷元普遍存在于不同植物來源的蜂花粉中,僅以蜂花粉中總黃酮和酸水解后的槲皮素、山柰素含量作為評價蜂花粉質量的標準缺乏專屬性。有研究[37]建立了11批不同產地油菜花粉的指紋圖譜,其相似度評價結果表明不同地區(qū)油菜蜂花粉中化學成分是相對穩(wěn)定的,建立的指紋圖譜可行,為其質量評價提供一定依據(jù)。蜂花粉富含多糖,主要包括果膠多糖、纖維素以及半纖維素等,蜂花粉多糖具有增強免疫、降糖降脂、抗衰老、抗癌等多重功效。目前對蜂花粉多糖的研究多集中在總多糖的提取、分離、含量測定[38-41],以及蜂花粉總多糖藥理活性的研究。胡景華等[42]發(fā)現(xiàn)不同產地油菜花粉的多糖含量沒有顯著差異。涂宗財?shù)萚43]優(yōu)化篩選出苯酚-硫酸法測定油菜花粉多糖的最佳顯色條件,降低了多糖測定中其他成分的影響,使測定結果更加準確。

3 討論與展望

3.1 規(guī)范蜂花粉質控標準中藥存在成分較為復雜、基礎研究相對薄弱、有效成分不明確及作用機制不清楚等問題,如何建立更有效的中藥質量評價及質控體系仍是目前研究的熱點和難點。蜂花粉即是典型代表,現(xiàn)有蜂花粉藥材標準中命名與來源不統(tǒng)一,檢驗項差異大,沒有以明確藥效物質為指標建立定性、定量檢測方法,未關注重金屬及農藥殘留等質控指標,無法對其質量進行全面評價與控制,進行質量控制的檢驗項目應予以修訂提高。用法、用量不統(tǒng)一,直接影響藥物的療效和患者的安全?；诖?筆者認為蜂花粉質量標準需要進一步修訂和完善,以建立較為全面且符合蜂花粉特色的行之有效的質量標準。

3.2 加強蜂花粉的來源研究我國作為世界養(yǎng)蜂大國,顯花植物種類繁多,花期漫長,花粉資源豐富,可作為商品性的蜂花粉來源有40余種,但商品化的蜂花粉僅10余種。絕大多數(shù)的蜂花粉尤其是我國五味子、益母草、紅花等中草藥花粉源的蜂花粉尚未得到有效開發(fā)利用。顏秋燕[44]研究發(fā)現(xiàn)黨參蜂蜜和黨參成分有相關性,黨參蜂蜜具有不同于其他蜂蜜的特征成分,可為黨參蜂蜜的品質和功效評價提供理論依據(jù),且黨參蜂蜜具有一定量的黨參功能成分。蜂花粉為蜜蜂采集的顯花植物雄蕊或裸子植物孢子囊內花粉細胞,加入采集的花蜜和自身分泌物形成的花粉團,那么蜂花粉中是否攜帶有對應中藥特有有效成分而具有特殊藥效,這需要進行更深一步的研究,如兩者之間存在量值傳遞關系,中藥花粉源的蜂花粉將能得到更廣泛地應用?；诖?蜂花粉質量標準制定過程中,不僅應考慮到蜂花粉的多來源性,也應考慮到花粉源植物化學成分的特有性。

3.3 加強蜂花粉藥效物質和作用機制研究隨著蜂花粉的開發(fā)利用,越來越多的學者留意到蜂花粉的多來源性,但目前研究多集中在不同來源蜂花粉之間總黃酮、總多糖的含量差異和藥效差異,極少有涉及不同來源蜂花粉之間化學成分差異,藥效物質基礎及作用機制未進行深入研究,導致蜂花粉藥效物質基礎仍不明確[7,45-46]。任順成等[47]利用AB-8大孔吸附樹脂對玉米花粉黃酮進行了精制,并通過高效液相和質譜分析得知精制的玉米花粉黃酮中至少含有槲皮素-3,3′-O-二葡萄糖苷等7個黃酮類化合物。雖然蜂花粉中具體藥效物質基礎未明確,但相關研究已證實蜂花粉中所含的橙皮素、槲皮素等化合物對小鼠具有保肝作用[48-49],槲皮素可阻斷腫瘤細胞中特定基因的表達,山柰素可抑制PC-3癌細胞的生長[50]。筆者在對收集的13批蜂花粉進行山柰素含量測定的實驗中發(fā)現(xiàn),不同蜂花粉水解后山柰素的含量相差懸殊,油菜蜂花粉中山柰素含量最高0.22%,茶花蜂花粉0.04%,蓮花蜂花粉因含量過低未測得含量。因此,這些已知藥效的化學成分能否直接作為蜂花粉的質控指標還有待進一步考證。在對收集到的13批蜂花粉進行薄層鑒別時發(fā)現(xiàn),3個來源蜂花粉中均有山柰素熒光斑點,此還有兩個明顯的共有斑點,因對照品限制目前還未明確這兩個共有斑點的具體成分,后續(xù)可以明確兩個共有斑點的化學成分,結合多批次多來源蜂花粉薄層鑒別實驗改進薄層鑒別項,建立多元化質控標準。

綜上所述,下一步應重點關注蜂花粉多來源性及有毒、有害物質安全性評價,針對不同來源蜂花粉應建立以藥效明確的化學成分為對照和現(xiàn)代科技手段相結合的鑒別、檢查和含量測定方法,規(guī)范其用法用量,完善蜂花粉質量標準及安全評價體系,盡快達到有效評價不同來源蜂花粉質量的目標。