PAI-1單核苷酸多態(tài)性與結直腸癌發(fā)生風險的相關性研究

靳志雄, 胡常暉, 張建軍, 李 蕊

(張家口市第一醫(yī)院1胃腸外科, 2腎內科, 3急診科; 4河北北方學院附屬第一醫(yī)院骨外科, 河北 張家口 075000)

結直腸癌是消化系統(tǒng)常見腫瘤,多發(fā)于結腸與直腸,早期癥狀不明顯,隨著病情進展,可出現(xiàn)便血、腹瀉腹痛、貧血等癥狀,近年來結直腸癌的發(fā)病群體逐漸呈年輕化趨勢[1-2]。目前結腸鏡檢查和CT、MRI等影像學檢查是早期篩查和診斷結直腸癌的主要手段,可有效預防結直腸癌發(fā)病[3]。隨著醫(yī)療技術的不斷發(fā)展,一些具有特異性的基因也被用于癌癥的早期篩查[4]。纖溶酶原激活物抑制劑-1(Plasminogen activator inhibitor-1, PAI-1)是血漿中的一種蛋白質,屬于纖溶系統(tǒng)的調節(jié)因子,它主要通過抑制纖溶酶原激活劑和尿激酶的活性達到調控纖溶系統(tǒng)功能的作用[5]。有研究顯示靶向PAI-1抑制劑對于腫瘤的治療具有重要意義[6]。此外也有研究表明PAI-1表達增強能夠促進食管鱗癌細胞的惡性生物學行為,PAI-1的4G/4G基因型也被證實與惡性腫瘤患者合并靜脈血栓栓塞有關[7-8]。本研究探究PAI-1 SNP與結直腸癌的發(fā)生風險之間的關系,現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料以2019年5月-2021年5月張家口市第一醫(yī)院胃腸外科收治的120例結直腸癌患者為病例組,其中男性54例,女性66例,年齡38～79歲,平均年齡(55.74±7.41)歲。另取同期80例健康體檢者為對照組,其中男性47例,女性33例,年齡39～75歲,平均年齡(56.36±6.35)歲。收集兩組相關資料,包括:BMI、吸煙史、飲酒史、家族史、是否久坐、排便頻率、排便是否費力、接觸毒害物質情況、腫瘤分期、腫瘤類型、淋巴結轉移和遠處轉移情況。納入標準:(1)診斷標準依據《中國早期結直腸癌篩查及內鏡診治指南》[9]進行,所有患者均符合結直腸癌的診斷標準;(2)活檢或腫瘤根治術切除獲得癌組織,經過病理診斷確診;(3)臨床資料與病理信息完整;(4)自愿參與研究。排除標準:(1)合并其他腫瘤;(2)有腫瘤病史;(3)患有嚴重的消化道性疾病或嚴重的營養(yǎng)不良;(4)中途退出研究。本研究經過張家口市第一醫(yī)院倫理委員會批準,研究對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 外周血DNA樣本的提取 分別抽取對照組和病例組外周靜脈血5 mL,加入3倍體積的紅細胞裂解液,充分混勻,放置在室溫下靜置5 min,12 000 r/min離心2 min,吸去上清液,收集沉淀。將沉淀中加入200 μL的溶液A,通過振蕩完全混勻。向懸浮液中加入20 μL的RNase A (10 mg/mL),充分顛倒混勻,置于室溫放置10 min,加入20 μL的蛋白酶K (10 mg/mL),充分顛倒混勻,置于60℃水浴中消化60 min。加入100 μL的溶液B,充分顛倒混勻。加入等體積的無水乙醇,充分顛倒混勻,將溶液和絮狀沉淀都加入吸附柱中,室溫放置2 min。12 000 r/min離心2 min,棄去廢液,將吸附柱放入收集管中。向吸附柱中加入600 μL漂洗液,12 000 r/min離心2 min,棄去漂洗液,將吸附柱放回收集管中,重復漂洗1次。12 000 r/min離心2 min,將吸附柱敞口置于室溫下以去除殘留的漂洗液。將吸附柱放入離心管中,向吸附膜中央滴加150 μL經65℃預熱的洗脫液,在室溫下放置5 min后,12 000 r/min離心2 min。所得洗脫液加入吸附柱中,12 000 r/min離心2 min,即得到PAI-1高質量的基因組DNA。使用Nano Drop ND-1000微量分光光度計檢測DNA的濃度和純度。

1.2.2 PCR擴增 取“1.2.1”項下提取的DNA進行擴增,PAI-1引物序列,上游:5′-CTCTCTCTGCCCTCACCAAC-3′, 下游: 5′-GTGGAGAGGCTC-

TTGGTCTG-3′。GAPDH作為內參,其引物序列為:上游:5′-GTAGGTTCGGCTTAAA-3′,下游:5′-TTAGGTCCGCGTTTAGGATC-3′。 反應條件為 95℃變性10 min,95℃15 s,60℃退火1 min,共40個循環(huán)。60℃延伸30 s。

1.2.3 限制性片段長度多態(tài)性(Restriction fragment length polymorphism,RFLP)酶切 使用Bsl I內切酶消化擴增產物,反應溫度為55℃,反應時間為3 h,反應體系為:2 μL 10×NEB buffer,0.5 μL Bsl I內切酶,7.5 μL ddH2O,10 μL PCR substrate。

1.2.4 電泳分析 取4%瓊脂糖凝膠在室溫下靜置30 min,放入電泳槽,加入1×TAE電泳緩沖液,取5 μL 酶切產物,100 V恒壓電泳30 min,在紫外投射儀下觀察結果,根據酶切條帶判斷基因型:5G/5G:74,46,22(bp), 4G/5G:96,74,46,22(bp), 4G/4G:96,46(bp)。

1.3 PAI-1單核苷酸多態(tài)性與結直腸癌發(fā)生風險的相關性分析采用二元Logistic風險回歸模型分析PAI-1的3種基因型5G/5G、4G/5G、4G/4G和等位基因型4G、5G與結直腸癌發(fā)生風險的相關性,以是否發(fā)生結直腸癌作為因變量,PAI-1等位基因型作為自變量,計算比值比(Odds ratio,OR)及95%置信區(qū)間(Confidential interval,CI),當OR大于1時,表示自變量與因變量之間存在正向關聯(lián),即自變量的存在增加了因變量的發(fā)生風險;當OR等于1時,表示自變量與因變量不相關;當OR小于1時,表示自變量與因變量之間存在負向關聯(lián),即自變量的存在降低了因變量的發(fā)生風險。

2 結果

2.1 兩組一般資料比較與對照組比較,病例組性別、年齡、BMI、吸煙史、飲酒史差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);病例組有結直腸癌家族史、久坐、排便頻率異常及費力、接觸毒害物質人數(shù)增多,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2 Hardy-Weinberg檢驗對照組80例受試者中5G/5G型有46例,4G/5G型有29例,4G/4G型有5例,病例組120例受試者中5G/5G型有44例,4G/5G型有51例,4G/4G型有25例。與對照組比較,病例組5G/5G型、4G/5G型、4G/4G型指標差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),基因型分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律,樣本具有群體代表性,見表2。

表2 Hardy-Weinberg檢驗結果

2.3 兩組PAI-1基因型分布情況比較與對照組比較,病例組中5G/5G型分布較少,4G/5G型、4G/4G型分布較多,差異存在統(tǒng)計學意義(χ2=11.900,P=0.003)。與對照組比較,病例組5G等位基因占比減少,4G等位基因占比增多(χ2=13.230,P<0.001)。4G/5G基因型攜帶者患結直腸癌的危險性是5G/5G基因型攜帶者的1.839倍,但差異無統(tǒng)計學意義(χ2=3.794,P=0.051)。4G/4G基因型攜帶者患結直腸癌的危險性是5G/5G基因型攜帶者的5.227倍(χ2=10.920,P=0.001)。4G等位基因攜帶者患結直腸癌的危險性是5G等位基因攜帶者的2.254倍(χ2=13.230,P<0.001),見表3。

表3 兩組=PAI-1基因型分布情況比較

2.4 PAI-1基因型與結直腸癌發(fā)生的相關性分析Logistic回歸模型分析結果顯示PAI-1基因型(OR=5.039,P=0.003)、家族史(OR=165.3,P<0.001)、久坐(OR=8.428,P=0.006)、排便頻率(OR=6.108,P=0.021)均與結直腸癌發(fā)生有顯著關聯(lián),見表4。

表4 二元Logistic回歸模型分析PAI-1基因型與結直腸癌發(fā)生的相關性

2.5 PAI-1基因型與結直腸癌病理特征的相關性PAI-1基因型與腫瘤分期(χ2=6.311,P=0.043)、 淋巴結轉移(χ2=14.070,P=0.001)和遠處轉移(χ2=22.470,P<0.001)存在相關性,與腫瘤類型不存在相關性(χ2=3.661,P=0.454),見表5。

表5 PAI-1基因型與結直腸癌病理特征的相關性

3 討論

PAI-1基因多態(tài)性和血管相關疾病的發(fā)病被證實存在關聯(lián),如PAI-1的4G/5G基因型與靜脈血栓的發(fā)生有關且4G/4G基因型患者發(fā)生深靜脈血栓事件的比例更高[10]。有研究表明PAI-1基因的rs1799768位點的4G/5G基因型與新生兒敗血癥風險顯著增加有關,表明PAI-1基因通過影響纖溶系統(tǒng)來影響新生兒的敗血癥易感性[11]。PAI-1基因多態(tài)性也被證實與反復性流產有關[12]。Murakami等研究證實PAI1基因中特定的SNPs與膀胱癌的復發(fā)率和臨床結局相關,這些SNPs會影響PAI-1的表達或功能,從而對腫瘤的侵襲和轉移產生影響[13]。也有研究發(fā)現(xiàn),PAI-1基因多態(tài)性與子宮內膜癌的發(fā)生風險增加相關,攜帶PAI-1 rs1799889的4G/4G基因型的個體在子宮內膜癌方面的風險顯著增加,該研究分析了子宮內膜癌發(fā)病機制和風險預測的重要信息并揭示了PAI-1的作用[14]。本研究發(fā)現(xiàn)PAI-1基因型與結直腸癌發(fā)病風險顯著相關,相對于健康人,結直腸癌患者攜帶PAI-1 4G/4G基因型的占比較多,這表明該基因型與結直腸癌的發(fā)展有關;結直腸癌患者中攜帶PAI-1 5G/5G基因型的占比較少,這表明該基因型對結直腸癌的發(fā)展有一定的保護作用。

本研究發(fā)現(xiàn)PAI-1基因型、家族史、久坐時間和排便頻率與結直腸癌的發(fā)生密切相關,這對于結直腸癌的預防和篩查至關重要。臨床上可以考慮通過基因檢測和生活方式干預來降低患結直腸癌的風險。對于有家族史的人群,結直腸癌的篩查和監(jiān)測尤為重要。PAI-1基因型與腫瘤分期、淋巴結轉移和遠處轉移之間存在顯著的相關性。說明PAI-1基因型對結直腸癌的發(fā)展和轉移過程具有影響,使得不同基因型在分期和轉移方面表現(xiàn)出不同的趨勢。PAI-1基因型與腫瘤類型之間的相關性并不顯著。這表明PAI-1基因型不會對結直腸癌的特定亞型的出現(xiàn)產生影響。

綜上所述, PAI-1 4G等位基因與結直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關,可作為早期診斷與篩選結直腸癌的重要指標。