GPX3基因緩解MPP+誘導(dǎo)多巴胺細(xì)胞損傷的機(jī)制研究

夏 歡, 馮婷婷, 蔡 倩, 楊新玲

(1新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科, 烏魯木齊 830011; 2新疆神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 3新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,烏魯木齊 830063;4新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院呼吸神經(jīng)內(nèi)科, 烏魯木齊 830011; 5新疆醫(yī)科大學(xué), 烏魯木齊 830017)

帕金森病(Parkinson′s disease,PD)是一種復(fù)雜的神經(jīng)退行性疾病,病理以黑質(zhì)紋狀體的多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性變性為特征[1]。其發(fā)病機(jī)制涉及多種基因的表達(dá)差異和信號(hào)通路的改變[2]。在一項(xiàng)PD外周血分析研究中顯示,谷胱甘肽過氧化物酶3(Glutathione peroxidase 3,GPX3)、前列腺素D2合成酶(Prostaglandin D2 synthase,PTGDS)、肉毒堿脂酰轉(zhuǎn)移酶(Recombinant solute carrier family 25 member 20,SLC25A20)等多個(gè)基因表達(dá)差異作為PD潛在生物標(biāo)志物具有較大的臨床診斷價(jià)值,其中GPX3是谷胱甘肽過氧化物酶家族的重要成員之一。2023年最新的全基因組關(guān)聯(lián)研究(Genome-wide association studies,GWAS)顯示,包括GPX3在內(nèi)的多個(gè)谷胱甘肽過氧化物酶家族基因通過氧化應(yīng)激機(jī)制參與了PD、阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)和肌萎縮側(cè)索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)等多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病過程[3]。因此,本研究利用高通量的基因芯片技術(shù)篩查PD患者外周血中基因的表達(dá)差異,進(jìn)一步通過構(gòu)建過表達(dá)GPX3的小鼠中腦多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞(Mouse midbrain dopaminergic neuron cells,MN9D)模型,探索GPX3基因緩解1-甲基-4-苯基吡啶離子(1-methyl-4-phenylpyridinium,MPP+)誘導(dǎo)多巴胺細(xì)胞損傷的機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料(1)基因芯片的研究對(duì)象:納入2022年9月至2023年4月就診于新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科專家門診的首診的、散發(fā)性的PD患者6例,作為芯片-PD組(Chip-PD組),平均年齡(65.83±9.15)歲,符合英國腦庫診斷標(biāo)準(zhǔn)[4],排除繼發(fā)性帕金森綜合征及其它患有嚴(yán)重全身疾病的患者。芯片-對(duì)照組(Chip-對(duì)照組)來源于同地區(qū)體檢健康者5例,平均年齡(61.40±7.16)歲,無PD家族史。(2)RT-PCR驗(yàn)證試驗(yàn)的研究對(duì)象:收集同時(shí)期、同地區(qū)就診的PD患者45例,作為人-PD組(Hum-PD組),均為散發(fā)性,平均年齡(66.42±8.92)歲;體檢健康者47例為人-對(duì)照組(Hum-對(duì)照組),平均年齡(63.17±7.58)歲。本研究經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(20210304-05),所有受試者簽署知情同意書。(3)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象:利用MN9D細(xì)胞構(gòu)建PD細(xì)胞模型,分為細(xì)胞-PD組(Cel-PD組)、細(xì)胞-對(duì)照組(Cel-對(duì)照組)、細(xì)胞-GPX3過表達(dá)組(Cel-GPX3過表達(dá)組)及細(xì)胞-空載組(Cel-空載組)。

1.2 材料HumanHT-12 v4 Expression BeadChip基因芯片(美國Illumina公司);TotalPrep RNA擴(kuò)增試劑盒(美國Ambion公司);淋巴細(xì)胞分離液(美國Sigma公司);Trizol(美國Invitrogen公司);氯仿、異丙醇、乙醇、無RNase水、PBS緩沖液(上海生工生物有限公司);芯片擴(kuò)增雜交液(美國Illumina公司);引物(武漢萊康生物有限公司);CCK8檢測(cè)試劑盒(美國Abcam公司);MN9D細(xì)胞(武漢萊康生物有限公司);胎牛血清及胰蛋白酶(美國Ginco公司);TBST緩沖液(美國Thermo Fisher公司);GPX3和β-actin抗體(美國Thermo Fisher公司);芯片檢測(cè)BeadChip Reader系統(tǒng)(美國Illumina公司);QuantStudio5實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國Thermo Fisher公司);Invitrogen iBright化學(xué)發(fā)光儀(美國Thermo Fisher公司);R軟件(美國Lucent Technologies公司);基因芯片實(shí)驗(yàn)由晶能生物技術(shù)(上海)有限公司完成。過表達(dá)GPX3的病毒及對(duì)照組病毒由上海生工生物科技公司包裝合成。倒置熒光顯微鏡(廣州微域醫(yī)學(xué)有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 總RNA的提取和純化 所有受試者均取外周靜脈血約4 mL,使用淋巴細(xì)胞分離液抽取單核細(xì)胞,然后使用Trizol試劑提取單核細(xì)胞中的總RNA,依次氯仿洗滌1次、異丙醇純化沉淀1次、70%乙醇洗2次,無RNase水溶解沉淀1次,最后進(jìn)行RNA質(zhì)檢,取吸光度(A260/230 nm)≥1.0的合格樣本用于后續(xù)芯片檢測(cè)及分析。

1.3.2 芯片檢測(cè) 取200 ng RNA,使用TotalPrep RNA擴(kuò)增試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,純化后取1.5 μg cDNA及10 μL無RNase水及20 μL芯片擴(kuò)增雜交液進(jìn)行雜交管混勻,取混合液20 μL加入HumanHT-12 v4 Expression BeadChip芯片中,58℃雜交16 h,55℃洗滌10 min后用BeadChip Reader系統(tǒng)讀取及獲取圖像。

1.3.3 RT-PCR驗(yàn)證芯片 依照芯片數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)GPX3基因引物,GPX3上游引物序列:5′-TGTTTATGTTATTGTCGTTCG-3′,下游引物序列:5′-CCTTACCCTCGCT-3′,β-actin上游引物序列:5′-CTGGGACGACATGGAG-3′,下游引物序列:5′-GGGGCTGGGAGTGC-3′。使用QuantStudio5實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀擴(kuò)增,反應(yīng)體系30 μL,GPX3和β-actin的退火溫度分別為57℃和60℃。

1.3.4 過表達(dá)GPX3基因穩(wěn)轉(zhuǎn)株的構(gòu)建 根據(jù)慢病毒轉(zhuǎn)染手冊(cè),將過表達(dá)GPX3的病毒及對(duì)照組病毒轉(zhuǎn)染MN9D細(xì)胞72 h,分別構(gòu)建Cel-GPX3過表達(dá)組和Cel-空載組。

1.3.5 細(xì)胞活力檢測(cè) 取對(duì)數(shù)期生長的MN9D細(xì)胞完全培養(yǎng)基下培養(yǎng)12 h后,分別對(duì)細(xì)胞-PD(Cel-PD)組MN9D細(xì)胞加入不同濃度(100、200、400、600、800 μmol/L)的MPP+干預(yù)24 h,其中濃度梯度參考Hussain等[5]的研究,Cel-對(duì)照組加入生理鹽水,根據(jù)CCK8檢測(cè)試劑盒檢測(cè)不同MPP+濃度下細(xì)胞活力。然后根據(jù)篩選的最佳MPP+濃度,分別處理Cel-GPX3過表達(dá)組和Cel-空載組24 h,最后利用CCK8檢測(cè)試劑盒再次檢測(cè)各組細(xì)胞活力。

1.3.6 Western blot蛋白檢測(cè) 收集細(xì)胞并裂解后使用BCA法進(jìn)行蛋白測(cè)定,其中一抗孵育:用TBST緩沖液稀釋一抗,稀釋比例:GPX3為1∶500,β-actin為1∶800,4℃孵育過夜。用Invitrogen iBright化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)、拍照,計(jì)算條帶上的灰度值。

2 結(jié)果

2.1 差異基因聚類分析Chip-PD組與Chip-對(duì)照組相比年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-1.284,P=0.199)。聚類分析顯示82個(gè)基因存在表達(dá)差異,其中30個(gè)基因表達(dá)上調(diào)2倍以上,52個(gè)基因表達(dá)下調(diào)2倍以上,且包括GPX3基因在Chip-PD組中表達(dá)下調(diào)(圖1A)。

注:圖1A中1～6為Chip-PD組,7～11為Chip-對(duì)照組;根據(jù)色條標(biāo)尺,表達(dá)上調(diào)會(huì)以紅色顯示,表達(dá)下調(diào)則為綠色表示。箭頭指示,GPX3基因在Chip-PD組中表達(dá)下調(diào)2倍以上。圖1B中紅色為P<0.05,藍(lán)色為P>0.05。圖1 Chip-PD組與Chip-對(duì)照組部分差異基因聚類及KEGG富集分析圖

2.2 差異基因KEGG富集分析Chip-PD組與Chip-對(duì)照組比較,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的KEGG分別是花生四烯酸代謝通路(FE=11.794,P=0.011)、血清素能的突觸通路(FE=6.433,P=0.036)、葉酸的一碳池通路(FE=2.813,P=0.047),其中GPX3表達(dá)差異可能與花生四烯酸代謝通路有關(guān)(圖1B)。

2.3 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果Hum-PD組患者和Hum-對(duì)照組的年齡分別為(66.42±8.92)歲和(63.17±7.58)歲,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.886,P=0.063)。兩組患者實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示,兩組GPX3的mRNA相對(duì)表達(dá)量2-ΔΔCt值分別為(0.828±0.198)和(1.033±0.216),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-4.738,P<0.001)(圖2A)。

注: *P<0.05, ***P<0.001, ns為P>0.05。圖2 GPX3在Hum-PD組和Hum-對(duì)照組及不同MPP+處理后Cel-PD組細(xì)胞模型中的差異

2.4 GPX3蛋白水平表達(dá)差異CCK8結(jié)果顯示MPP+處理24 h后MN9D細(xì)胞活力隨著MPP+濃度的升高而逐漸下降,且MPP+的處理濃度在600 μmol/L,細(xì)胞活力約為69%(圖2B)。Western blot結(jié)果顯示Cel-PD組MN9D細(xì)胞上GPX3蛋白相對(duì)表達(dá)量隨著MPP+處理濃度的增加而逐漸下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=21.75,P<0.001),而在600 μmol/L和800 μmol/L時(shí),GPX3蛋白相對(duì)表達(dá)量未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=0.921,P=0.379)(圖2C、2D)。

2.5 過表達(dá)GPX3基因?qū)PP+誘導(dǎo)PD細(xì)胞模型中神經(jīng)元凋亡的影響給予600 μmol/L MPP+處理Cel-GPX3過表達(dá)組及Cel-空載組細(xì)胞24 h后,采用CCK8法檢測(cè),結(jié)果顯示,Cel-GPX3過表達(dá)組的細(xì)胞活力百分比約為(0.75±0.07),較Cel-空載組的(0.70±0.04)增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.659,P=0.011)(圖3A)。600 μmol/L MPP+處理前,100倍鏡熒光顯微鏡視野下Cel-GPX3過表達(dá)組、Cel-空載組MN9D細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為(218.24±44.17)、(207.63±36.52),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.453,P=0.660)。600 μmol/L MPP+處理后,100倍鏡視野下Cel-GPX3過表達(dá)組、Cel-空載組MN9D細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為(160.19±31.28)、(98.63±26.17),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.697,P=0.004)。與Cel-空載組相比,Cel-GPX3過表達(dá)組細(xì)胞密度明顯較密,細(xì)胞數(shù)量較多(圖3B、C)。由此可見,GPX3過表達(dá)的MN9D細(xì)胞可以抵抗MPP+的毒性,減少神經(jīng)元細(xì)胞的損傷。

注:A為Cel-GPX3過表達(dá)組及Cel-空載組細(xì)胞活力的差異; B和C均為細(xì)胞計(jì)數(shù)差異, 其中-為未添加MPP+,+為已添加MPP+, **P<0.01。圖3 Cel-GPX3過表達(dá)組和Cel-空載組MN9D細(xì)胞活力及數(shù)量差異圖

3 討論

PD作為復(fù)雜的神經(jīng)變性疾病,其發(fā)病機(jī)制往往涉及多種基因的表達(dá)差異和信號(hào)通路的改變。近幾年,基因芯片作為一種有效的高通量測(cè)序方法在探索神經(jīng)變性疾病致病基因方面發(fā)揮著重要的作用,如AD、ALS、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病等。最新的研究[6]也發(fā)現(xiàn)PD患者和健康人群比較,兩者外周血基因表達(dá)存在明顯差異,并且發(fā)現(xiàn)它們與大分子代謝過程、免疫系統(tǒng)、基因表達(dá)、細(xì)胞活化、ATP酶活性、DNA包裝復(fù)合物、信號(hào)受體活性、免疫受體活性和蛋白質(zhì)結(jié)合等過程相關(guān)。而本研究中基因芯片篩查的結(jié)果進(jìn)一步顯示PD患者外周血大分子代謝異常主要與花生四烯酸代謝通路、血清素能的突觸通路、葉酸的一碳池通路有關(guān)。

花生四烯酸屬于不飽和脂肪酸,在整個(gè)腦發(fā)育過程中至關(guān)重要,其主要沉積在腦灰質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞膜中,通過調(diào)節(jié)膜結(jié)合蛋白的離子通道和囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)來調(diào)節(jié)膜的物理性質(zhì),通過調(diào)節(jié)G蛋白介導(dǎo)第二信使信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)以及基因的表達(dá)來影響神經(jīng)元的生長和分化[7]。在本研究中,KEGG富集分析顯示PD患者花生四烯酸代謝通路較健康體檢者顯著降低?；ㄉ南┧釋儆谥|(zhì)代謝通路,本研究結(jié)果提示PD患者可能存在脂質(zhì)代謝的異常?；ㄉ南┧釋?duì)PD等神經(jīng)退行性疾病具有重要的神經(jīng)保護(hù)作用,主要與線粒體功能障礙、神經(jīng)炎癥和氧化應(yīng)激等特征性病理表現(xiàn)有關(guān)[8]。既往研究顯示環(huán)氧二十碳三烯酸(Epoxyeicosatrienoic acids,EETs)是花生四烯酸的代謝物,由于它們廣泛分布于大腦中并顯示出抗炎和抗氧化作用[9-10],因此,花生四烯酸作為PD的治療靶點(diǎn)存在巨大的潛力[11]。與之一致的是,在果蠅PD模型中,再次證實(shí)EETs增加了抗氧化酶的表達(dá),減輕了氧化應(yīng)激和炎癥[12]。Iljina等[13]的研究顯示,與沒有花生四烯酸誘導(dǎo)α-突觸核蛋白組裝過程相比,花生四烯酸干預(yù)下α-突觸核蛋白多聚體形成的神經(jīng)元損傷更低?；ㄉ南┧嵩谏窠?jīng)元發(fā)育中也是必不可少的,部分原因是它直接負(fù)責(zé)激活Synaxin-3,這是神經(jīng)元膜上的一種蛋白質(zhì),參與神經(jīng)元的生長和軸突修復(fù),是神經(jīng)發(fā)育和突觸傳遞中的重要蛋白[14]?；ㄉ南┧岬闹饕嬍硜碓词莿?dòng)物性食物,如牛羊肉、魚肉和雞蛋等。最新的飲食方面的研究也顯示,在PD患者和對(duì)照組之間,雖然飲食總能量和不飽和脂肪酸攝入量未觀察到差異,但是PD患者的α-亞麻酸、亞油酸和花生四烯酸血漿水平較低,進(jìn)一步控制年齡和性別后,花生四烯酸血漿水平與PD的非運(yùn)動(dòng)癥狀呈正相關(guān)[15]。因此,鑒于其在PD中重要的神經(jīng)保護(hù)性作用,PD患者飲食上應(yīng)該更傾向于補(bǔ)充動(dòng)物性食物以增加花生四烯酸等多不飽和脂肪酸的攝入。

進(jìn)一步深入分析參與花生四烯酸代謝通路的基因改變顯示,GPX3基因在PD患者外周血及PD細(xì)胞模型中均顯著降低。最新研究顯示GPX家族蛋白可利用電荷驅(qū)動(dòng)底物方式,優(yōu)先識(shí)別花生四烯酸并減少后者被過氧化氫氧化[16]。人GPX3基因位于5號(hào)染色體上,GPX3作為GPX家族的重要成員之一,被廣泛認(rèn)為是一種抗氧化酶[17]。其在PD中表達(dá)降低可能與緩解神經(jīng)細(xì)胞膜上過氧化氫的氧化作用減弱有關(guān)。既往研究也顯示GPX3敲除的小鼠表現(xiàn)為氧自由基之類毒性損傷的敏感性明顯增加,如暴露于百草枯、其他炎癥刺激、病毒感染或再灌注損傷等[18]。本研究中細(xì)胞模型顯示,過表達(dá)GPX3基因可以有效緩解MPP+導(dǎo)致的MN9D細(xì)胞的損傷。GPX3編碼的氨基酸已被既往研究證實(shí)具有良好的胞外抗氧化功能,主要表現(xiàn)為清除組織細(xì)胞間的過度產(chǎn)生的氧自由基,因此GPX3緩解MPP+的毒性作用可能與其表達(dá)上調(diào)后降低細(xì)胞中ROS的過度產(chǎn)生和積累有關(guān)[19]。近年來研究發(fā)現(xiàn),GPX3翻譯后的分子屬于硒元素依賴的氨基酸,在中度缺硒的情況下,GPX3的表達(dá)很容易下降,甚至其信使RNA也會(huì)在這些條件下被降解。進(jìn)一步深入分析顯示,在蛋白質(zhì)水平上,GPX3受硒結(jié)合蛋白1(Selenium-binding protein,SBP1)的調(diào)控。當(dāng)機(jī)體缺少微量元素硒時(shí),SBP1會(huì)反應(yīng)性增高,SBP1在多種細(xì)胞系統(tǒng)中的過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致GPX3含量及活性降低[20],因此,對(duì)于PD患者適量補(bǔ)充微量元素硒可能有助于增加GPX3含量及活性,緩解神經(jīng)細(xì)胞膜上的氧化損傷。

綜上所述,基因芯片篩查顯示PD的發(fā)病機(jī)制可能與外周血GPX3基因表達(dá)差異有關(guān),而在進(jìn)一步的MN9D細(xì)胞模型中證實(shí),GPX3過表達(dá)后可有效緩解 MPP+的毒性,減少多巴胺神經(jīng)元細(xì)胞的損傷。