維生素D通過Nrf2/HO-1抑制鐵死亡緩解6-羥基多巴胺所致PC12細(xì)胞損傷的作用機(jī)制研究

穆清爽, 李沛珊, 李艷霞, 李瑞晟, 楊新玲

(1新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院干部一科, 新疆神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 2新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,3新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院康復(fù)科, 烏魯木齊 830063; 4新疆醫(yī)科大學(xué), 烏魯木齊 830017)

帕金森病(Parkinson′s disease,PD)是僅次于阿爾茨海默病的第二大神經(jīng)退行性疾病,占65歲以上人口的2%～3%,主要由位于基底神經(jīng)節(jié)區(qū)域黑質(zhì)致密部(Substantia nigra pars compacta,SNpc)的多巴胺能神經(jīng)元耗竭引起的[1-2]。遺傳、老齡化、環(huán)境、營養(yǎng)等因素均可能與PD發(fā)生相關(guān),但其具體發(fā)病機(jī)制尚不明確[2-3]。多巴胺前體左旋多巴是PD的主要治療藥物,但其治療效果欠佳,不能阻止PD的惡化,甚至還伴隨明顯的毒副作用[4]。作為一種神經(jīng)保護(hù)試劑,維生素D可通過調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)鈣平衡以及影響神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)而參與神經(jīng)系統(tǒng)的代謝,發(fā)揮其對PD患者的神經(jīng)保護(hù)作用[5]。維生素D可有效改善缺血缺氧所致神經(jīng)元細(xì)胞損傷,上調(diào)神經(jīng)元中Nrf2和HO-1的表達(dá),導(dǎo)致谷胱甘肽過氧化酶4(Glutathione peroxidase 4,GPX4)、超氧化物歧化酶(Super oxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽(Glutathione,GSH)水平升高,丙二醛(Malondialdehyde,MDA)和活性氧(Reactive oxygen species,ROS)含量降低,從而抑制鐵死亡[6]。

鐵死亡(Ferroptosis)是新發(fā)現(xiàn)的一種鐵依賴的調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡方式,其與核因子E2相關(guān)因子2(Nuclear factorE2 related factor 2,Nrf2)/血紅素加氧酶1(Heme oxygenase1,HO-1)通路激活相關(guān)[7]。PD患者多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞所沉積的α-突觸核蛋白(α-synuclein,α-syn),可引起脂質(zhì)代謝紊亂及鐵死亡,暗示鐵死亡與PD進(jìn)展相關(guān)[8],抑制鐵死亡可顯著緩解多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞損傷[9]。但PD中,維生素D是否通過調(diào)控鐵死亡緩解神經(jīng)元細(xì)胞損傷,報(bào)道尚少。為此,本研究擬通過6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)刺激PC12構(gòu)建體外PD細(xì)胞模型[10],維生素D干預(yù)后,觀察鐵死亡及Nrf2/HO-1通路激活情況。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及主要試劑 未分化的PC12(大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞)購自于賽百慷(上海)生物技術(shù)股份有限公司(貨號:iCell-r025)。胎牛血清購自于CLARK公司(貨號:FB15015);RPMI 1640培養(yǎng)基購自于美國Gibco公司(貨號:31800-089);6-OHDA(貨號:HY-B1081)、1,25(OH)2D3(貨號:HY-10002)、Erastin(貨號:HY-15763)、ML385(貨號:HY-100523)購自于美國MCE公司;丙二醛(MDA)測定試劑盒(貨號:A003-1-2)、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(貨號:A020-2-2)、超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒(貨號:A001-3-2)、還原型谷胱甘肽(GSH)測定試劑盒(貨號:A006-2-1)購自于南京建成生物工程研究所;一氧化氮(Nitric oxide,NO)測定試劑盒(貨號:S0021S)購自于上海碧云天生物科技有限公司;細(xì)胞鐵含量檢測試劑盒(貨號:BC5310)購自于北京索萊寶科技有限公司;RIPA裂解液(貨號:LS-W-03268)、Annexin V-FITC/PI(貨號:LS-H-158)試劑盒、PBS(貨號:LS-P-0106)、Western blot試劑盒(貨號:LS-H-128)購自于武漢靈思生物技術(shù)有限公司;Anti-Heme Oxygenase 1(貨號:AF5393)、Nrf2 Antibody(貨號:AF0639)、XCT Antibody(貨號:DF12509)、GPX4 Antibody(貨號:DF6701)、Transferrin Receptor Antibody(貨號:AF5343)購自于美國affinity公司;Anti-GAPDH antibody(貨號:ab8245)、Anti-Ferritin-1(貨號:ab75973)購自于英國abcam公司;HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(貨號:GB23303)購自于武漢賽維爾生物技術(shù)有限公司;SYBR Green PCR試劑盒(貨號:AQ131)購自于北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要儀器 3111型CO2培養(yǎng)箱購自于美國Thermo公司;LC96型Real-time PCR檢測儀購自于美國羅氏公司;Nano-100型微量核酸測定儀購自于杭州奧盛儀器有限公司;HBS-1096A型酶標(biāo)儀購自于南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PC12細(xì)胞培養(yǎng) PC12細(xì)胞復(fù)蘇后,置于RPMI 1640,并添加5%胎牛血清、10%熱滅活馬血清和1%的青-鏈霉素于培養(yǎng)基中,培養(yǎng)的氣相條件:空氣95%,二氧化碳5%。培養(yǎng)溫度為37℃,培養(yǎng)箱濕度為70%～80%。

1.2.2 PD細(xì)胞模型構(gòu)建 參考文獻(xiàn)[9-10], 利用40 μmol/L的6-羥基多巴胺(6-OHDA)處理PC12細(xì)胞24 h,構(gòu)建PD模型。

1.2.3 VD干預(yù)濃度篩選 按照1.2.2構(gòu)建PD模型后,利用不同濃度的1,25(OH)2D3(20 ng/mL、40 ng/mL、80 ng/mL)處理24 h。收集細(xì)胞,CCK-8檢測細(xì)胞活力。利用30 mmol/L[11]的鐵死亡激活劑Erastin或者5 mmol/L[12]的Nrf2抑制劑ML385分別處理PC12細(xì)胞6 h,按照1.2.2構(gòu)建PD模型后,再利用不同濃度的1,25(OH)2D3(20、40、80 ng/mL)處理24 h。收集細(xì)胞,CCK-8檢測細(xì)胞活力。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)分組 PC12細(xì)胞隨機(jī)分成:空白對照組(Control)、6-羥基多巴胺組(6-OHDA)、維生素D組(VD)、鐵死亡激活劑組(Erastin)、鐵死亡激活劑+維生素D組(Erastin+VD)、Nrf2抑制劑組(ML385)、Nrf2抑制劑+維生素D組(ML385+VD);其中Control組細(xì)胞正常培養(yǎng)不進(jìn)行任何處理、6-OHDA組細(xì)胞按照1.2.2構(gòu)建PD模型、VD組按照1.2.2構(gòu)建PD模型后,利用1,25(OH)2D3(40 ng/mL)處理24 h、Erastin組利用30 mmol/L的Erastin處理PC12細(xì)胞6 h后,再按照1.2.2構(gòu)建PD模型、Erastin+VD組利用30 mmol/L的Erastin處理PC12細(xì)胞6 h,構(gòu)建PD模型,再利用1,25(OH)2D3(40 ng/mL)處理24 h、ML385組利用5 mmol/L的ML385處理PC12細(xì)胞6 h后,再按照1.2.2構(gòu)建PD模型、ML385+VD組利用5 mmol/L的ML385處理PC12細(xì)胞6 h,構(gòu)建PD模型,再利用1,25(OH)2D3(40 ng/mL)處理24 h。

1.2.5 CCK-8(Cell Counting Kit-8)檢測 PC12細(xì)胞按照1×104個(gè)/孔接種于96孔板,按照1.2.4分組,干預(yù)結(jié)束后,每孔加入10 μL CCK-8溶液,并在37℃條件下孵育1 h。利用酶標(biāo)儀測定其450 nm處的吸光度值(OD value)。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 PC12細(xì)胞按照1×105個(gè)/孔接種于6孔板,按照1.2.4分組,干預(yù)結(jié)束后,用預(yù)冷PBS離心洗滌,收集1×105～10×105個(gè)細(xì)胞(包括培養(yǎng)上清中的細(xì)胞);取 500 μL 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞;每管加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI;輕柔渦旋混勻后,室溫避光孵育5 min;流式細(xì)胞儀分析,在流式細(xì)胞儀上,通過FITC檢測通道檢測Annexin V-FITC(Ex=488 nm; Em=530 nm)和通過PI檢測通道(Ex=535 nm;Em=615 nm)檢測PI。

1.2.7 MDA、LDH、SOD、GSH含量檢測 PC12細(xì)胞按照1×105個(gè)/孔接種于6孔板,按照1.2.4分組,干預(yù)結(jié)束后,收集上清和細(xì)胞;參考試劑盒說明書檢測MDA、LDH、SOD、GSH含量。

1.2.8 鐵離子含量檢測 PC12細(xì)胞按照1×105個(gè)/孔接種于6孔板,按照1.2.4分組,干預(yù)結(jié)束后,收集上清和細(xì)胞;參照試劑盒說明書檢測鐵離子含量。

1.2.9 qRT-PCR檢測 PC12細(xì)胞按照1×105個(gè)/孔接種于6孔板,按照1.2.4分組干預(yù),干預(yù)結(jié)束后,收集細(xì)胞,TRIzon Reagent裂解提取RNA;cDNA合成試劑盒合成cDNA后,qRT-PCR檢測各基因的表達(dá),引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,其序列如表1,反應(yīng)程序?yàn)?4℃,30 sec;(94℃,5 sec)×40個(gè)循環(huán);61℃,35 sec。采用2-△△CT法分析目的基因的相對表達(dá)量,計(jì)算公式如下:△Ct= Ct目的基因-Ct內(nèi)參,即△△Ct=△Ct樣本-△Ct對照,再計(jì)算各組2-△△CT值,即為各組中基因的相對表達(dá)量。

表1 引物序列

1.2.10 Western blot檢測 PC12細(xì)胞按照1×105個(gè)/孔接種于6孔板,按照1.2.4分組,干預(yù)結(jié)束后,收集細(xì)胞,加500 μL RIPA(含1 mmol/L PMSF);冰上裂解細(xì)胞,30 min;4℃ 12 000 r/min離心10 min,收集上清;BCA定量后,SDS-PAGE電泳;以兔抗HO-1抗體(1∶500)、兔抗Nrf2 抗體(1∶800)、兔抗XCT抗體(1∶1 000)、兔抗GPX4 抗體(1∶800)、兔抗Transferrin Receptor 抗體(1∶500);兔抗GAPDH抗體(1∶10 000)、兔抗Ferritin-1(1∶1 000)為一抗,4℃孵育過夜;PBS清洗后,HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶2 000)室溫孵育1 h,TBST洗5次,每次10 min;將配好的ECL顯色液加到PVDF膜上進(jìn)行曝光拍照。Image 2x軟件采集各樣本灰度值,蛋白相對表達(dá)量以目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值表示。

2 結(jié)果

2.1 維生素D可顯著降低6-OHDA對PC12細(xì)胞活力的影響與Control組比較,6-OHDA可顯著抑制PC12細(xì)胞活力(t=5.031,P=0.002);與6-OHDA處理組比較,不同濃度的VD均可顯著促進(jìn)PC12細(xì)胞活力(F=33.25,P=0.000),并呈現(xiàn)濃度依賴性;與20 ng/mL的VD相比,40 ng/mL(t=3.796,P=0.009)和80 ng/mL(t=4.607,P=0.004)的VD均可促進(jìn)PC12細(xì)胞活力,見表2。

表2 預(yù)處理組細(xì)胞活力檢測

與Control組比較,Erastin可顯著抑制PC12細(xì)胞活力(t=15.820,P=0.000);與Erastin組比較,不同濃度的VD均可顯著促進(jìn)PC12細(xì)胞活力(F=3.733,P=0.041);20 ng/mL與40 ng/mL的VD對PC12細(xì)胞活力的影響相當(dāng),與20 ng/mL的VD相比,80 ng/mL的VD可顯著促進(jìn)PC12細(xì)胞活力(t=2.657,P=0.025)。與Control組比較,ML385可顯著抑制PC12細(xì)胞活力(t=14.760,P=0.000);與ML385組比較,不同濃度的維生素D均可顯著促進(jìn)PC12細(xì)胞活力(F=24.440,P=0.000),并呈現(xiàn)濃度依賴性;與20 ng/mL的VD相比,40 ng/mL(t=2.556,P=0.043)及80 ng/mL(t=5.216,P=0.013)的VD均可顯著促進(jìn)PC12細(xì)胞活力,見表3。綜上所述,40 ng/mL及80 ng/mL VD均可促進(jìn)PC12細(xì)胞活力,但兩組細(xì)胞活力相差不大,結(jié)合實(shí)驗(yàn)效益,故后續(xù)實(shí)驗(yàn)均選用40 ng/mL的VD進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

表3 Erastin干預(yù)組及ML385干預(yù)組細(xì)胞活力檢測

2.2 維生素D可顯著抑制6-OHDA所致PC12細(xì)胞凋亡與Control組比較,6-OHDA干預(yù)后,可顯著促進(jìn)PC12細(xì)胞凋亡(t=22.030,P=0.000);與6-OHDA組比較,維生素D干預(yù)后,可顯著抑制PC12細(xì)胞凋亡(t=16.570,P=0.000)。與VD組比較,Erastin+VD(t=7.246,P=0.002)、ML385+VD(t=7.260,P=0.002)組細(xì)胞凋亡水平顯著升高,見圖1。

注:與Control組比較, **P<0.01; 與6-OHDA組比較, **P<0.01; 與Erastin組比較, △△P<0.01; 與ML385組比較, ∧∧P<0.01; 與VD組比較, &&P<0.01 (柱狀圖從左至右依次為Control組、6-OHDA組、VD組、Erastin組、Erastin+VD組、ML385組、ML385+VD組)。圖1 細(xì)胞凋亡檢測

2.3 維生素D可顯著抑制6-OHDA所致PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激水平與Control組比較,6-OHDA干預(yù)后,PC12細(xì)胞中GSH(t=276.400;P=0.000)、SOD(t=76.000;P=0.000)水平均顯著降低,而LDH(t=86.960;P=0.000)、MDA(t=16.040;P=0.000)水平顯著升高。與6-OHDA組比較,VD可顯著提高GSH(t=56.310;P=0.000)、SOD(t=76.330;P=0.000)水平,降低LDH(t=40.790;P=0.000)、MDA(t=9.177;P=0.000)水平。與VD組比較,Erastin+VD組GSH(t=30.260;P=0.000)、SOD(t=26.580;P=0.000)水平均顯著降低,而LDH(t=26.920;P=0.000)、MDA(t=7.746;P=0.001)水平顯著升高;與VD組比較,ML385+VD組等到類似的結(jié)果,見表4。

表4 GSH、LDH、MDA、SOD表達(dá)檢測

2.4 維生素D可顯著抑制6-OHDA所致PC12細(xì)胞鐵離子沉積與Control組比較,6-OHDA干預(yù)后,PC12細(xì)胞中鐵離子含量顯著升高(t=54.130,P=0.000)。與6-OHDA組比較,VD可顯著抑制PC12細(xì)胞中鐵離子沉積(t=27.230,P=0.000)。與VD組比較,Erastin+VD組鐵離子水平顯著升高(t=17.530,P=0.000)。與VD組比較,ML385+VD組鐵離子水平顯著升高(t=6.562,P=0.003),見表5。

表5 鐵離子含量

2.5 維生素D對FTH-1、SLC7A11、GPX4、TFR-1等鐵離子相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)的影響qRT-PCR檢測分析發(fā)現(xiàn),與Control組比較,6-OHDA干預(yù)后,PC12細(xì)胞中FTH-1(t=21.470,P=0.000)、SLC7A11(t=89.460,P=0.000)、GPX4(t=80.880,P=0.000)的表達(dá)顯著降低,TFR-1的表達(dá)顯著升高(t=134.600,P=0.000)。與6-OHDA組比較,VD可顯著提高PC12細(xì)胞中FTH-1(t=51.400,P=0.000)、SLC7A11(t=75.850,P=0.000)、GPX4(t=64.660,P=0.000)的表達(dá),TFR-1的表達(dá)顯著降低(t=120.200,P=0.000)。與VD組比較,Erastin+VD組FTH-1(t=41.020,P=0.000)、SLC7A11(t=46.570,P=0.000)、GPX4(t=50.440,P=0.000)的表達(dá)顯著降低,TFR-1的表達(dá)升高(t=56.210,P=0.000);與VD組比較,ML385+VD組得到類似的結(jié)果,見圖2。

注:與Control組比較, **P<0.01; 與6-OHDA組比較, ##P<0.01; 與Erastin組比較, △△P<0.01; 與ML385組比較, ∧∧P<0.01; 與VD組比較, &&P<0.01。圖2 qRT-PCR檢測FTH-1、SLC7A11、GPX4、TFR-1的表達(dá)

Western blot檢測PC12細(xì)胞中FTH-1、SLC7A11、GPX4、TFR-1的蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)結(jié)果與qRT-PCR檢測結(jié)果類似,見圖3。

注:與Control組比較, **P<0.01; 與6-OHDA組比較, ##P<0.01; 與Erastin組比較, △△P<0.01; 與ML385組比較, ∧∧P<0.01; 與VD組比較, &&P<0.01。圖3 Western blot檢測FTH-1、SLC7A11、GPX4、TFR-1的表達(dá)

2.6 維生素D對Nrf2/HO-1通路激活的影響與Control組比較,6-OHDA干預(yù)后,PC12細(xì)胞中Nrf2(t=10.430,P=0.001)、 HO-1(t=12.490,P=0.000)的表達(dá)顯著降低。與6-OHDA組比較,VD可顯著提高PC12細(xì)胞中Nrf2(t=8.465,P=0.001)、HO-1(t=8.422,P=0.001)的表達(dá)。與VD組比較, Erastin+VD組Nrf2(t=5.754,P=0.005)、HO-1(t=5.984,P=0.004)的表達(dá)顯著降低。與VD組比較,ML385+VD組Nrf2(t=2.883,P=0.009)、HO-1(t=7.839,P=0.001)的表達(dá)顯著降低(P<0.01),見圖4。

注:與Control組比較, **P<0.01; 與6-OHDA組比較, ##P<0.01; 與Erastin組比較, △△P<0.01; 與ML385組比較, ∧∧P<0.01; 與VD組比較, &&P<0.01。圖4 Western blot檢測Nrf2、HO-1的表達(dá)

3 討論

帕金森病(PD)屬中老年人常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病,主要由位于基底神經(jīng)節(jié)區(qū)域黑質(zhì)致密部(SNpc)的多巴胺能神經(jīng)元耗竭引起的[1,13],目前缺乏有效的治療手段。研究發(fā)現(xiàn),抑制鐵死亡可顯著緩解PD進(jìn)展[14-15]。維生素D可以通過調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)鈣平衡以及影響神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)而參與神經(jīng)系統(tǒng)的代謝,發(fā)揮其對PD患者的神經(jīng)保護(hù)作用[5]。本研究發(fā)現(xiàn),維生素D可通過抑制6-OHDA所致PC12細(xì)胞鐵死亡,進(jìn)而抑制細(xì)胞損傷,提示維生素D可作為PD潛在的治療手段。

維生素D對神經(jīng)有潛在保護(hù)作用,PD患者的維生素D水平較低,PD患者缺乏維生素D較普遍的現(xiàn)象,與PD患者認(rèn)知功能密切相關(guān)[16-17]。維生素D是一類脂溶性類固醇,可以從飲食中獲得,也可以通過皮膚暴露在紫外線下產(chǎn)生,主要包括維生素D2(ergocalciferol,麥角鈣化醇)和維生素D3(cholecalciferol,膽鈣化醇)[18]。在肝臟,維生素D被雙重羥基化激活,轉(zhuǎn)化為25-羥基維生素D[25(OH)D],然后在腎臟,通過1-α-羥化酶的作用,成為具有活性的1,25-二羥基維生素D2[1,25(OH)2D2]或D3[1,25(OH)2D3][18]。1,25(OH)2D3可通過抑制一氧化氮合酶(Nitric Oxide Synthases,NOS)的產(chǎn)生而抑制活性氧物質(zhì)的合成;1,25(OH)2D3也能通過提高γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶的含量,增加谷胱甘肽(GSH)表達(dá)而激活腦內(nèi)抗氧化途徑,進(jìn)而減少對帕金森氏癥患者黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的氧化損傷,阻止多巴胺能神經(jīng)元的丟失;1,25(OH)2D3通過影響離子通道(Ca2+、Na+、Mg2+等),緩解神經(jīng)元細(xì)胞線粒體損傷[19];1,25(OH)2D3上調(diào)神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá),直接促進(jìn)多巴胺的釋放或者抑制氧化應(yīng)激的產(chǎn)生[20]。同時(shí),遺傳因素也可能是導(dǎo)致PD患者VD缺乏的重要因素,PD與VD受體單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism,SNP)和維生素D結(jié)合蛋白(Vitamin D Binding Protein,DBP)的關(guān)聯(lián)在PD中已有相關(guān)研究[21]。本研究發(fā)現(xiàn),維生素D干預(yù)后,可顯著抑制6-OHDA所引起的PC12細(xì)胞凋亡,從細(xì)胞水平說明了維生素D可緩解PD損傷。

鐵死亡是一種新型細(xì)胞死亡形式,通常在細(xì)胞死亡過程中伴有大量的鐵離子蓄積和脂質(zhì)過氧化。已有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)鐵死亡與PD進(jìn)展關(guān)系密切[8-9,22]。鐵作為強(qiáng)還原劑,會產(chǎn)生羥基自由基,并引起多巴胺的氧化,這促進(jìn)了PD中黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元的氧化環(huán)境的形成[23],因此,鐵穩(wěn)態(tài)的失衡會促發(fā)PD。維生素D可有效改善缺血缺氧性腦損傷和神經(jīng)元線粒體損傷,上調(diào)神經(jīng)元中Nrf2和HO-1的表達(dá),導(dǎo)致GPX4、SOD和GSH水平升高,MDA和ROS含量降低[6]。維生素D可通過抑制腸黏膜中ROS及MDA的累積,增加機(jī)體抗氧化能力,提高線粒體ATP酶活性,促進(jìn)線粒體裂變及聚合平衡,最終降低鐵死亡,抑制順鉑所導(dǎo)致的腸黏膜內(nèi)皮細(xì)胞鐵死亡[24]。不同濃度維生素D處理后,可顯著提高斑馬魚的抗氧化能力,抑制肝細(xì)胞的線粒體損傷,增加鐵死亡相關(guān)基因(FTH-1、GPX4、GP4a、GPX4b)的表達(dá),最終促進(jìn)斑馬魚的存活率[25]。本研究發(fā)現(xiàn),6-OHDA刺激后,可促進(jìn)PC12細(xì)胞鐵沉積,GSH、SOD的水平顯著降低,LDH、MDA水平顯著升高;FTH-1、SLC7A11、GPX4、TFR-1的表達(dá)顯著降低。而維生素D干預(yù)后,GSH、SOD的水平顯著升高,LDH、MDA水平顯著降低;FTH-1、SLC7A11、GPX4、TFR-1的表達(dá)顯著升高;鐵死亡激活劑Erastin可顯著抑制維生素D的作用,以上結(jié)果說明維生素D緩解6-OHDA所致PC12細(xì)胞損傷與鐵死亡相關(guān)。

Nrf2/HO-1通路和鐵死亡關(guān)系密切[26]。抑制Nrf2后,可顯著抑制氧糖剝奪所致MLE12細(xì)胞氧化應(yīng)激及線粒體功能變化,降低SLC7A11和HO-1的表達(dá),抑制鐵死亡,緩解急性肺損傷[27]。在癲癇模型中,海馬神經(jīng)元細(xì)胞中GPX4、Nrf2及HO-1 mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著降低,促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞鐵死亡,而提高GPX4、Nrf2及HO-1的表達(dá),可顯著緩解神經(jīng)元細(xì)胞鐵死亡[28]。有研究發(fā)現(xiàn),維生素D可通過激活Nrf2抑制鐵死亡[6]。本研究發(fā)現(xiàn),利用Nrf2抑制劑ML385干預(yù)后,維生素D緩解6-OHDA所致PC12細(xì)胞鐵死亡的作用顯著降低,說明維生素D調(diào)控6-OHDA所致PC12細(xì)胞鐵死亡與Nrf2/HO-1通路激活相關(guān)。

綜上所述,本研究初步說明維生素D可激活Nrf2/HO-1通路,緩解6-OHDA所致PC12細(xì)胞鐵死亡。但由于本研究局限于細(xì)胞水平,后續(xù)還需通過動物水平,進(jìn)一步明確維生素D緩解PD進(jìn)展與鐵死亡的關(guān)系及可能調(diào)控機(jī)制。