miR-5188 在肝癌細(xì)胞中的作用及網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制研究

全養(yǎng)雅 黎慧娟 陳 仕 周 艷

【關(guān)鍵字】 miR-5188；肝細(xì)胞癌；DIDO1；NEAT1；pri-miRNA

在亞洲肝細(xì)胞癌（HCC）的發(fā)病率居惡性腫瘤的第5 位，在中國(guó)HCC 也是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤[1]。雖然近年來(lái)手術(shù)切除、射頻消融、肝移植等多種治療方法不斷發(fā)展，但是HCC 治療的遠(yuǎn)期效果仍不理想，經(jīng)治愈性切除術(shù)后患者的5年復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率高達(dá)70%，并且多在術(shù)后2年內(nèi)復(fù)發(fā)[2]。因此，亟需探究HCC 發(fā)生和進(jìn)展的分子機(jī)制，從而研發(fā)新的診療方案，以期改善HCC 患者的預(yù)后并提高總體生存率。miRNA 是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的、長(zhǎng)度為20～25 個(gè)核苷酸的非編碼RNA，能通過(guò)與靶mRNA 的互補(bǔ)配對(duì)從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因表達(dá)，導(dǎo)致mRNA 的降解或翻譯抑制，進(jìn)而參與腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展過(guò)程[3]。研究報(bào)道，miR-5188 在HCC 組織中表達(dá)上調(diào)，乙型肝炎病毒X 蛋白（HBx）可以誘導(dǎo)miR-5188 表達(dá)并刺激β-連環(huán)蛋白（β-catenin）核轉(zhuǎn)位，從而促進(jìn)HCC 的腫瘤干性[4]。由于HBV 感染并非是HCC 的充分必要條件，其他因素也可以導(dǎo)致HCC 發(fā)生（如丙型肝炎病毒感染等），因此內(nèi)源性miR-5188 在HCC 發(fā)生和進(jìn)展中的作用仍需進(jìn)一步探索。本研究探討了內(nèi)源性miR-5188 在肝癌細(xì)胞中的作用及網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)中所用的質(zhì)粒購(gòu)自山東維真生物科技有限公司；小干擾RNA（siRNA）、miR-5188 mimics和miR-5188 inhibitor 均由廣州瑞博生物醫(yī)藥科技有限公司設(shè)計(jì)并合成；正常肝細(xì)胞LO2 購(gòu)自北京邁瑞達(dá)科技有限公司（貨號(hào)M186652-125 mL×4）；肝癌細(xì)胞HepG2 購(gòu)自深圳市優(yōu)里生物科技有限公司（貨號(hào)BN-CC338070）；DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司（貨號(hào)XB01-08）；LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自北京鼎泰博揚(yáng)科技有限公司（貨號(hào)11668027）；MTT 試劑購(gòu)自深圳市益百順科技有限公司（貨號(hào)T818538-5g）；抗NONO 抗體購(gòu)自廣州市文?？茖W(xué)儀器有限公司（貨號(hào)DF7254-100）；抗GAPDH 抗體購(gòu)自廣州德為生物科技有限公司（貨號(hào)AP0066）；抗PSF 抗體購(gòu)自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司（貨號(hào)bs-19683R）；抗DIDO1 抗體購(gòu)自廣州偉然生物科技有限公司（貨號(hào)DF3612-100）；G 蛋白 Dyna 珠子購(gòu)自深圳拓山生物科技有限公司（貨號(hào)10003D）；潮霉素購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司（貨號(hào)A600230-0250）；熒光素酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海信裕生物科技有限公司（貨號(hào)11402XY60）；RNA 提取試劑盒購(gòu)自廣州基準(zhǔn)科技服務(wù)有限公司（貨號(hào)R4132-03）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自北京泰合通生物科技有限公司（貨號(hào)4387406）；RIPA 裂解液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司（貨號(hào)P0013B）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和處理 LO2 細(xì)胞和HepG2 細(xì)胞均培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，并置于37 ℃、5% CO2的環(huán)境中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前，將指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿中，使用LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑盒將質(zhì)粒、siRNA、miR-5188 mimics 和miR-5188 inhibitor 分別轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48～72 h 收集細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 采用MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。分別將指數(shù)生長(zhǎng)期的LO2 細(xì)胞和HepG2 細(xì)胞接種至培養(yǎng)基中的96 孔板，孵育過(guò)夜。使用MTT 試劑（5 mg/mL）檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.3 NONO、DIDO1 和PSF 的表達(dá)水平檢測(cè) 采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)NONO、DIDO1 和PSF 的表達(dá)水平。于裂解緩沖液中獲得HepG2 細(xì)胞裂解物，使用 BCA 蛋白測(cè)定試劑盒檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。通過(guò)SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白并轉(zhuǎn)膜，使用相應(yīng)的抗體（抗GAPDH、NONO、DIDO1 和PSF 抗體）對(duì)其進(jìn)行免疫探測(cè)。使用ECL 試劑盒檢測(cè)蛋白質(zhì)，使用ChemiDocTMXRS+分子成像儀獲取圖像。

1.2.4 PSF 與NONO 相互作用的檢測(cè) 采用免疫共沉淀技術(shù)和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)PSF 與NONO 的相互作用。免疫共沉淀的操作步驟：取2 μg 特異性抗體于4 ℃下在 200 μL 裂解緩沖液中與G 蛋白Dyna 珠子偶聯(lián)2 h，用裂解緩沖液洗滌3 次后，加入300 μL 全細(xì)胞提取物（用RIPA 裂解液制備的HepG2 細(xì)胞）。將混合物于4 ℃下旋轉(zhuǎn)孵育2 h，將珠子用裂解緩沖液洗滌4 次后，重新懸浮于1×SDS 上樣緩沖液中，煮沸用于免疫印跡分析。

1.2.5 miR-5188、pre-miR-5188、pri-miR-5188 和長(zhǎng)鏈非編碼RNA NEAT1 的表達(dá)水平檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)LO2 細(xì)胞和HepG2 細(xì)胞中miR-5188、pre-miR-5188、pri-miR-5188 和長(zhǎng)鏈非編碼RNA NEAT1（下文簡(jiǎn)稱NEAT1）的表達(dá)水平。使用RNA 提取試劑盒分離LO2 細(xì)胞和HepG2 細(xì)胞的總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將總RNA合成cDNA，以cDNA 作為模板，使用特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 的反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min，95 ℃10 min；然后95 ℃ 15 s，57 ℃ 60 s，共計(jì)40 個(gè)循環(huán)。使用Bio-Rad T100 型和Bio-Rad CFX96 型PCR 儀分別進(jìn)行cDNA 合成及PCR 反應(yīng)。

1.2.6 NONO/PSF 與pri-miR-5188 相互作用的檢測(cè) 采用紫外交聯(lián)免疫沉淀技術(shù)檢測(cè)NONO/PSF與pri-miR-5188 的相互作用。將15 cm 培養(yǎng)皿中的貼壁細(xì)胞在冰冷的PBS 中沖洗2 次，在 254 nm波長(zhǎng)的紫外燈（120 mJ/cm2）下交聯(lián)，在1 mL Tris-HCl 裂解緩沖液中于冰上刮擦并裂解10 min，輔以蛋白酶抑制劑和RNase 抑制劑。將裂解物渦旋，然后在4 ℃下以17 000×g 離心5 min。上清液與5 μg抗NONO 抗體、抗PSF 抗體或?qū)φ胀N型G 蛋白Dyna 珠子在4 ℃下旋轉(zhuǎn)90 min。用于每個(gè)反應(yīng)的G 蛋白Dyna 珠子（80 μL）用1 mL 裂解緩沖液沖洗2 次，并在4 ℃下用1 mg/mL 的牛血清白蛋白封閉2 h。將珠子重新懸浮于100 μL 裂解緩沖液中，然后添加至反應(yīng)管中，在4 ℃下旋轉(zhuǎn)孵育2 h。然后用高鹽緩沖液將珠子洗滌2 次，并用裂解緩沖液洗滌3 次。免疫沉淀的樣品用脫氧核糖核酸酶Ⅰ（DNase Ⅰ）處理，然后用蛋白酶K 消化。使用RNeasy MinElute 柱試劑盒純化RNA。

1.2.7 敲除NEAT1 的細(xì)胞系構(gòu)建 構(gòu)建敲除NEAT1 的HepG2 細(xì)胞，以探究NEAT1 在pri-miR-5188 加工中的作用。 使用CRISPR 基因編輯工具（http://crispr.mit.edu） 設(shè)計(jì)小向?qū)NA（sgRNA）。將4 對(duì) sgRNA 序列克隆到PiggyBac 質(zhì)粒（PBC2）中，每對(duì)sgRNA 均應(yīng)用U6 啟動(dòng)子。使用LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑將含有sgRNA 的PBC2 質(zhì)粒和表達(dá)Cas9 的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HepG2 細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后24 h，使用潮霉素處理敲除NEAT1的細(xì)胞4 d?；罴?xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清且不含抗生素的新鮮DMEM 培養(yǎng)基中，以便在分離單個(gè)克隆之前恢復(fù)1～2 d。采用直接測(cè)序法驗(yàn)證敲除成功與否。

1.2.8 miR-5188 與DIDO1 靶向關(guān)系的檢測(cè) 利用miRNA 靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)miRDB 獲取miR-5188潛在的靶基因，包括DIDO1、PARP8、WDR11、SGCB、CLDN10、WASF2、SBSPON、RUFY3 和RPS6KA2 基因。采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)miR-5188 與DIDO1 的靶向關(guān)系。擴(kuò)增DIDO1 3'非翻譯區(qū)（3'-UTR）野生型（WT）片段，用于驗(yàn)證miR-5188 是否靶向DIDO1 mRNA 的3'-UTR。應(yīng)用GeneTailorTM定點(diǎn)誘變系統(tǒng)進(jìn)行miR-5188 結(jié)合位點(diǎn)的定點(diǎn)誘變（MT）。將3'-UTR-WT 或3'-UTRMT 克隆至psiCHECKTM-2 載體中用于熒光素酶檢測(cè)。將載體與miR-5188 mimics 或?qū)φ招蛄泄厕D(zhuǎn)染至HepG2 細(xì)胞中，并在轉(zhuǎn)染后48 h 應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告基因分析系統(tǒng)檢測(cè)HepG2 細(xì)胞中熒光素酶活性。

1.2.9 pri-miR-5188 的加工水平檢測(cè) 采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)pri-miR-5188 的加工水平。構(gòu)建pri-miR-5188 加工雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)，若pri-miR-5188 被加工，則熒光素酶因缺失Poly（A）尾而無(wú)法被翻譯。將報(bào)告載體轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞中，并在轉(zhuǎn)染后48 h 應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告基因分析系統(tǒng)檢測(cè)經(jīng)不同處理的HepG2 細(xì)胞中熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，2 組間比較采用Student'st檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。采用一般線性模型重復(fù)測(cè)量方差分析比較MTT 測(cè)定結(jié)果的差異。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-5188 靶向DIDO1 對(duì)HepG2 細(xì)胞增殖能力的影響

過(guò)表達(dá)miR-5188 后，HepG2 細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)；敲低miR-5188 表達(dá)后，HepG2 細(xì)胞的增殖能力減弱，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）， 見(jiàn)圖1。 結(jié)果顯示， 敲低PARP8、WDR11、SGCB、CLDN10、WASF2、SBSPON、RUFY3 或RPS6KA2 表達(dá)后，HepG2 細(xì)胞的增殖能力無(wú)顯著變化；敲低DIDO1 表達(dá)后，HepG2 細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)；過(guò)表達(dá)DIDO1 后，HepG2細(xì)胞的增殖能力減弱，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），見(jiàn)圖2 和圖3。過(guò)表達(dá)miR-5188 后，HepG2 細(xì)胞中DIDO1 的表達(dá)水平降低；敲低miR-5188 表達(dá)后，HepG2 細(xì)胞中DIDO1 的表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），見(jiàn)圖4。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-5188 靶向DIDO1 mRNA 的3'-UTR（P＜0.05），見(jiàn)圖5。同時(shí)過(guò)表達(dá)miR-5188 和DIDO1 后，HepG2 細(xì)胞的增殖能力無(wú)顯著變化，見(jiàn)圖6。

圖1 過(guò)表達(dá)或敲低miR-5188 表達(dá)對(duì)HepG2 細(xì)胞增殖能力的影響

圖2 敲低DIDO1 表達(dá)對(duì)HepG2 細(xì)胞增殖能力的影響

圖3 過(guò)表達(dá)DIDO1 對(duì)HepG2 細(xì)胞增殖能力的影響

圖4 過(guò)表達(dá)或敲低miR-5188 表達(dá)對(duì)HepG2 細(xì)胞中DIDO1 表達(dá)水平的影響 A 過(guò)表達(dá)miR-5188 B 敲低miR-5188 表達(dá)

圖5 miR-5188 與DIDO1 3'-UTR 的靶向關(guān)系

圖6 過(guò)表達(dá)miR-5188 或同時(shí)過(guò)表達(dá)miR-5188 和DIDO1 對(duì)HepG2 細(xì)胞增殖能力的影響

2.2 NEAT1 介導(dǎo)NONO/PSF 復(fù)合體形成并促進(jìn)pri-miR-5188 的加工

與LO2 細(xì)胞相比，HepG2 細(xì)胞中miR-5188和pre-miR-5188 的表達(dá)水平均顯著升高，而primiR-5188 的表達(dá)水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），見(jiàn)表1。與LO2 細(xì)胞相比，HepG2 細(xì)胞中NEAT1 的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），而NONO 和PSF 的表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），見(jiàn)表1 和圖7。敲低NEAT1、NONO 或PSF 表達(dá)后，HepG2 細(xì)胞中pri-miR-5188的表達(dá)水平均顯著升高（P均＜0.05），熒光素酶活性均顯著升高（P均＜0.05），見(jiàn)圖8、9。敲除NEAT1 后，HepG2 細(xì)胞中pri-miR-5188 的表達(dá)水平升高，NONO 與PSF 的相互作用減弱，并且NONO/PSF 與pri-miR-5188 的結(jié)合減少，見(jiàn)圖10、11 和12。

表1 LO2 和HepG2 細(xì)胞中miR-5188、pre-miR-5188、pri-miR-5188和NEAT1 的表達(dá)水平比較

圖7 LO2 細(xì)胞和HepG2 細(xì)胞中NONO 和PSF 表達(dá)的蛋白電泳圖

圖8 敲低NEAT1、NONO 或PSF 表達(dá)后對(duì)HepG2 細(xì)胞中primiR-5188 表達(dá)的影響

圖9 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)NEAT1、NONO 或PSF 對(duì)pri-miR-5188 的加工水平

圖10 敲除NEAT1 后對(duì)HepG2 細(xì)胞中pri-miR-5188 表達(dá)水平的影響

圖11 敲除NEAT1 后對(duì)HepG2 細(xì)胞中PSF 與NONO 相互作用的影響 A 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)親本細(xì)胞和NEAT 敲除細(xì)胞中NONO 和PSF 的表達(dá)水平 B 免疫共沉淀和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)親本細(xì)胞和NEAT 敲除細(xì)胞中NONO 與PSF 的相互作用

圖12 敲除NEAT1 后對(duì)HepG2 細(xì)胞中NONO/PSF 與pri-miR-5188 相互作用的影響

3 討論

本研究結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-5188 可增強(qiáng)HepG2 細(xì)胞的增殖能力；而敲低miR-5188 表達(dá)后，HepG2 細(xì)胞的增殖能力減弱；此外，miR-5188 靶向DIDO1 mRNA 的3'-UTR。DIDO1 首次在WOL-1細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，其氨基酸序列包含1 個(gè)富含谷氨酰胺的區(qū)域、2 個(gè)鋅指基序、1 個(gè)來(lái)自N 端核定位信號(hào)的酸性序列，以及1 個(gè)位于C 端的富含賴氨酸的序列[5-6]。在正常細(xì)胞質(zhì)中，絲氨酸/蘇氨酸上的DIDO1 磷酸化水平較低[7]；若DIDO1 被磷酸化激活后，其會(huì)移位至細(xì)胞核以觸發(fā)WOL-1 細(xì)胞凋亡[8]。由此推測(cè)，miR-5188 可能通過(guò)下調(diào)DIDO1的表達(dá)及降低肝癌細(xì)胞的凋亡水平，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖。

本研究結(jié)果顯示，與LO2 細(xì)胞相比，HepG2細(xì)胞中miR-5188 和pre-miR-5188 的表達(dá)水平均顯著升高，而pri-miR-5188 的表達(dá)水平顯著降低。研究發(fā)現(xiàn)，小部分miRNA 是由自身基因編碼的，約80%的miRNA 來(lái)自各種大型編碼和非編碼轉(zhuǎn)錄物[9]。這些最初的轉(zhuǎn)錄本被稱為pri-miRNA，可被細(xì)胞核中由Drosha 和DGCR8 組成的微處理器復(fù)合物加工成pre-miRNA[10]。由Exportin 5 進(jìn)行核輸出后，pre-miRNA 可被Dicer 酶進(jìn)一步加工為成熟的miRNA，然后進(jìn)入RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物而發(fā)揮生物學(xué)功能[11-13]。由此推測(cè)，提高肝癌細(xì)胞中primiR-5188 的加工水平可升高成熟miR-5188 的表達(dá)水平。本研究結(jié)果顯示，敲除NEAT1 后，HepG2 細(xì)胞中pri-miR-5188 的表達(dá)水平升高，NONO 與PSF的相互作用減弱，并且NONO/PSF 復(fù)合體與primiR-5188 的結(jié)合減少。研究表明，在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中和轉(zhuǎn)錄后，大量RNA 結(jié)合蛋白、RNA 解旋酶可在單個(gè)加工步驟中調(diào)節(jié)miRNA 的生物發(fā)生[14]。另有研究報(bào)道，NEAT1 可以促進(jìn)NONO/PSF 復(fù)合體形成[15]，這與本研究的結(jié)論相符。NONO/PSF 復(fù)合體可以結(jié)合大量表達(dá)的pri-miRNA，并提高Drosha-DGCR8微處理器復(fù)合物對(duì)pri-miRNA 的處理能力[14]。因此，NEAT1 可以介導(dǎo)NONO/PSF 復(fù)合體形成并促進(jìn)pri-miR-5188 的加工。

綜上所述，HepG2 細(xì)胞中NEAT1 的表達(dá)水平升高，提高了NONO/PSF 復(fù)合體對(duì)pri-miR-5188 的加工水平，增強(qiáng)了miR-5188/DIDO1 軸對(duì)HepG2 細(xì)胞增殖能力的正向作用。因此，miR-5188 可能可以作為HCC 的潛在治療靶點(diǎn)。本研究是一項(xiàng)基于體外細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)，未進(jìn)行臨床試驗(yàn)或活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，下一步將構(gòu)建敲除NEAT 的小鼠模型以驗(yàn)證本研究結(jié)論。