SDC-1 調(diào)控TGF-β1/THBS1 信號通路對肝纖維化進(jìn)程的影響

羊 丹 田婉婷 徐 菁

乙型肝炎是全球范圍內(nèi)的重要公共衛(wèi)生問題?！?022 中國衛(wèi)生健康統(tǒng)計(jì)年鑒》[1]發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，2021年中國新發(fā)乙型肝炎97.68 萬例，相較于2020年（90.63 萬例）增加了8%，距離WHO 提出的2030年消除乙型肝炎的目標(biāo)仍有一定差距。乙型肝炎是由HBV 感染引起的肝臟疾病，大多數(shù)HBV感染者經(jīng)治療后在短期內(nèi)能夠痊愈，但5%～10%的成年患者無法清除病毒，可能進(jìn)展為慢性乙型肝炎[2]。慢性乙型肝炎患者通常無明顯癥狀，但可能引起肝纖維化改變，進(jìn)而導(dǎo)致肝硬化和肝細(xì)胞癌（HCC）發(fā)生，威脅患者的生命健康[3]。多配體蛋白聚糖-1（SDC-1）是一種位于細(xì)胞表面的糖蛋白，可參與調(diào)控細(xì)胞黏附、細(xì)胞外基質(zhì)的組裝、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞遷移等多種生物學(xué)過程。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，HCC 細(xì)胞中SDC-1 表達(dá)顯著上調(diào)，可能發(fā)揮促進(jìn)肝纖維化進(jìn)展的作用[4]。轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）是TGF-β 超家族的多肽成員之一。既往研究表明，肝臟受損后，炎癥反應(yīng)和纖維化的激活可導(dǎo)致TGF-β1 釋放，TGF-β1 則可與肝星狀細(xì)胞（HSC）表面受體結(jié)合，激活下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而促使HSC 轉(zhuǎn)化為纖維化細(xì)胞，參與肝纖維化進(jìn)程[5]。血小板反應(yīng)蛋白1（THBS1）屬于THBS 家族，在肝臟等組織中表達(dá)。Reszegi 等[6]的研究發(fā)現(xiàn)，THBS1 與TGF-β1 在肝纖維化進(jìn)程中存在相互作用，且SDC-1 在此過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。目前關(guān)于SDC-1 的表達(dá)與肝纖維化的關(guān)系，以及其對于HSC 及細(xì)胞周期作用機(jī)制的報(bào)道較少。本研究對此進(jìn)行了分析，旨在為肝纖維化的臨床診治提供參考依據(jù)。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

選擇2021年4月至2023年4月于三二〇一醫(yī)院住院治療并行肝穿刺活體組織病理檢查的102 例慢性乙型肝炎患者作為研究對象，其中男性58 例，女性44 例，年齡32～76 歲，平均年齡為（58.35±10.21）歲，BMI 為22～26 kg/m2，平均BMI 為（24.36±2.14）kg/m2；參照《肝纖維化診斷及治療共識(shí)（2019年）》[7]中的肝纖維化分期標(biāo)準(zhǔn)，S0 期22 例，S1 期19 例，S2 期24 例，S3 期21 例，S4 期16 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）18～80 歲；（2）符合《慢性乙型肝炎防治指南（2015年版）》[8]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)；（3）尚未接受抗病毒治療；（4）患者及家屬簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他類型的肝炎病毒感染；（2）合并藥物性、酒精性、自身免疫性、膽汁淤積性和遺傳代謝性等肝??；（3）合并惡性腫瘤；（4）近6 個(gè)月內(nèi)曾接受抗病毒或抗炎保肝治療；（5）有心、腦、腎等重要器官功能不全。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過（批件號20210623）。

1.2 方法

1.2.1 血清SDC-1 表達(dá)水平檢測 采用ELISA 法檢測受試者血清SDC-1 的表達(dá)水平。于患者入院時(shí)，采集清晨空腹?fàn)顟B(tài)下的外周靜脈血5 mL，3 500 r/min 離心5 min，取上清液，使用全自動(dòng)生物化學(xué)分析儀檢測血清SDC-1 的表達(dá)水平，試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司（貨號E-EL-H1298c）。

1.2.2 LX-2 細(xì)胞的培養(yǎng)和活化 將人HSC 系LX-2（購自上海雅吉生物科技有限公司）置于10%高糖DMEM 培養(yǎng)基內(nèi)，于37 ℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)；待細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)，棄去培養(yǎng)液，用無菌PBS溶液沖洗；之后更換為無血清DMEM 培養(yǎng)基，將細(xì)胞隨機(jī)分為2 組，其中1 組加入TGF-β1 溶液（質(zhì)量濃度為10 ng/mL）后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，設(shè)為TGF-β1組；另1 組不作處理，設(shè)為陰性對照（NC）組。

1.2.3 SDC-1 敲低實(shí)驗(yàn) 本研究中的SDC-1 小干擾RNA（siRNA）由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成，正向序列為5'-CCACCAAACAGGAGG AAUUTT-3'，反向序列為5'-UUCCUCCUGUUUGGU GGTT-3'。取TGF-β1 組中對數(shù)生長期的細(xì)胞，以1×106個(gè)/孔接種于6 孔板上，加入不含抗生素的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，之后隨機(jī)分為2 組，其中1 組轉(zhuǎn)染隨機(jī)排序的小片段siRNA，設(shè)為NC siRNA 組；另1 組轉(zhuǎn)染SDC-1 siRNA，設(shè)為SDC-1 siRNA 組。以上步驟均按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒（購自英國Invitrogen 公司）說明書進(jìn)行操作，之后將細(xì)胞置于Opti-MEM 培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染12 h，后更換為無胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)48 h。

1.2.4 α-平滑肌肌動(dòng)蛋白、SDC-1 和THBS1 蛋白表達(dá)水平檢測 采用蛋白質(zhì)印跡法測定α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、SDC-1 和THBS1 蛋白表達(dá)水平。取1.2.3 中轉(zhuǎn)染48 h 后的細(xì)胞，棄去舊培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS 溶液沖洗3 次；滴加RIPA 裂解液（購自北京伊塔生物科技有限公司，貨號SY4680）裂解細(xì)胞，冰上反應(yīng)10～30 min；4 ℃下12 000 r/min離心15 min，取上清液，使用BCA 蛋白定量試劑盒（購自上海信帆生物科技有限公司，貨號YX3763）測定α-SMA、SDC-1 和THBS1 蛋白的表達(dá)水平。具體步驟：取蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE，濕法轉(zhuǎn)至PVDF 膜；用快速封閉液[購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司]封閉抗體，依次滴加兔抗α-SMA 多克隆抗體（購自上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司）、兔抗SDC-1 多克隆抗體和兔抗THBS1多克隆抗體（均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司），按1 ∶1 000 比例稀釋，4 ℃孵育過夜；用TBST 溶液沖洗3 次，滴加二抗（購自上海烜雅生物科技有限公司），按1 ∶5 000 比例稀釋，37 ℃孵育1 h；用TBST 溶液沖洗3 次，采用ECL 法（試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司）曝光顯影；使用凝膠成像系統(tǒng)觀察條帶，應(yīng)用ImageJ 軟件進(jìn)行灰度值分析，以β-actin 作為內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.5α-SMA、SDC-1 和THBS1 mRNA 表達(dá)水平檢測 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測α-SMA、SDC-1和THBS1 mRNA 的表達(dá)水平。取1.2.3 中轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞，用PBS 溶液沖洗2 次；滴加TRIzol 試劑（購自南京森貝伽生物科技有限公司）提取總RNA，冰上孵育10 min；用移液槍吹打5 min，轉(zhuǎn)移至EP 管內(nèi)；滴加預(yù)冷的氯仿，4 ℃下12 000 r/min 離心15 min，取上層水相置于新的EP 管內(nèi)，滴加異丙醇沉淀DNA；4 ℃下12 000 r/min 離心15 min，棄上清，加入預(yù)冷的75%乙醇洗滌沉淀；4 ℃下7 500 r/min 離心5 min，棄上清；使用紫外可見分光光度計(jì)（購自美國Thermo Fisher Scientific 公司）測定波長260 nm 和280 nm 處的光密度（OD）值，檢測RNA 純度（R），公式：R=OD260/OD280，取R值在1.8～2.0 間的RNA 樣品，并測定RNA 濃度；按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒[購自優(yōu)利科（上海）生命科學(xué)有限公司]說明書操作，將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)并合成，引物序列見表1。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；之后94 ℃ 30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃ 60 s，共35 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延展10 min。取PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，使用凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果；以GAPDH 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算α-SMA、SDC-1 和THBS1 mRNA 的相對表達(dá)量。

1.2.6 細(xì)胞增殖情況檢測 采用CCK-8 法檢測細(xì)胞增殖情況。取1.2.3 中轉(zhuǎn)染48 h 后的細(xì)胞，用胰酶消化細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液；以2×103個(gè)/孔接種于96 孔板，在37 ℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)4 h；待細(xì)胞貼壁后每孔加入10 μL 的CCK-8 溶液（購自上海烜雅生物科技有限公司），在37 ℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)2 h，使用酶標(biāo)儀（購自美國Thermo Fisher Scientific 公司）測定波長450 nm 處的OD 值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.7 細(xì)胞周期檢測 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期。取1.2.3 中轉(zhuǎn)染48 h 后的細(xì)胞，用胰酶消化細(xì)胞，1 000 r/min 離心5 min，棄上清；用預(yù)冷的PBS 溶液沖洗，加入無水乙醇，4 ℃孵育過夜；1 000 r/min離心5 min，吸出乙醇，用PBS 溶液清洗2～3 次，加入2 μL 的RNA 酶及0.5 mL 的PI 溶液[購自弗元（上海）生物科技有限公司，貨號FY600002]，室溫避光染色30 min；用300 μm 尼龍網(wǎng)膜過濾，轉(zhuǎn)移至新的含PBS 溶液的EP 管內(nèi)，使用流式細(xì)胞儀（購自美國BD 公司）檢測細(xì)胞周期。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 20.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，2 組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同肝纖維化分期的慢性乙型肝炎患者血清SDC-1 的表達(dá)水平比較

如表2 所示，隨著肝纖維化程度逐漸加重，慢性乙型肝炎患者的血清SDC-1 表達(dá)水平呈升高趨勢，S4 期高于S3 期，S3 期高于S2 期，S2 期高于S1 期，S1 期高于S0 期，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。

表2 不同肝纖維化分期的慢性乙型肝炎患者血清SDC-1 的表達(dá)水平比較

2.2 LX-2 細(xì)胞活化鑒定

NC 組中α-SMA 蛋白及α-SMAmRNA 的相對表達(dá)量分別為0.67±0.12 和1.13±0.16，TGF-β1 組中α-SMA 蛋白及α-SMAmRNA 的相對表達(dá)量分別為2.85±0.56 和3.72±0.61。與NC 組相比，TGF-β1組中α-SMA 蛋白及α-SMAmRNA 的相對表達(dá)量均顯著升高（P均＜0.05）。

2.3 經(jīng)TGF-β1 誘導(dǎo)活化的LX-2 細(xì)胞中SDC-1 表達(dá)水平的變化

NC 組中SDC-1 蛋白及SDC-1 mRNA 的相對表達(dá)量分別為1.36±0.24 和1.21±0.18，TGF-β1 組中SDC-1 蛋白及SDC-1 mRNA 的相對表達(dá)量分別為2.63±0.52 和1.89±0.23。與NC 組相比，TGF-β1 組中SDC-1 蛋白及SDC-1 mRNA 的相對表達(dá)量均顯著升高（P均＜0.05）。

2.4 敲低SDC-1 表達(dá)對活化LX-2 細(xì)胞中α-SMA、TGF-β1 及THBS1 表達(dá)水平的影響

NC siRNA 組 中α-SMA、TGF-β1 和THBS1 蛋白的相對表達(dá)量分別為2.63±0.59、5.72±1.36 和5.84±1.43，而α-SMA、TGF-β1 和THBS1 mRNA 的相對表達(dá)量分別為2.34±0.52、5.43±1.21 和5.67±1.36；SDC-1 siRNA 組中α-SMA、TGF-β1 和THBS1 蛋白的相對表達(dá)量分別為1.46±0.37、3.11±1.25 和2.58±1.14，而α-SMA、TGF-β1和THBS1 mRNA 的相對表達(dá)量分別為1.53±0.35、2.79±1.28 和2.53±1.34。與NC siRNA 組相比，SDC-1 siRNA 組中α-SMA、TGF-β1、THBS1 蛋白及其mRNA 的相對表達(dá)量均顯著降低，2 組的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。

2.5 敲低SDC-1 表達(dá)對活化LX-2 細(xì)胞增殖的影響

如圖1 所示，與NC 組相比，TGF-β1 組的細(xì)胞增殖活性顯著增強(qiáng)（P＜0.05）；與NC siRNA 組相比，SDC-1 siRNA 組的細(xì)胞增殖活性顯著減弱（P＜0.05）。

圖1 敲低SDC-1 表達(dá)對活化LX-2 細(xì)胞增殖的影響

2.6 敲低SDC-1 表達(dá)對活化LX-2 細(xì)胞周期的影響

如圖2 所示，與NC 組相比，TGF-β1 組中G1期細(xì)胞占比顯著降低，S 期和G2期細(xì)胞占比顯著升高（P均＜0.05）；與NC siRNA 組相比，SDC-1 siRNA 組中G1期細(xì)胞占比顯著升高，S 期和G2期細(xì)胞占比顯著降低（P均＜0.05）。

3 討論

研究表明，1990年至2019年中國的乙型肝炎疾病負(fù)擔(dān)雖呈下降趨勢，但離2030年消除HBV 的目標(biāo)仍存在差距，據(jù)貝葉斯模型預(yù)測，2020年至2030年中國的乙型肝炎的發(fā)病患者約為1 486.56萬例，死亡患者約為11.18 萬例，這提示仍需強(qiáng)化防控措施[9]。肝纖維化是多種慢性肝病的共同病理特征，在中國肝纖維化主要是由慢性乙型肝炎所致[10]。SDC-1 是一種細(xì)胞表面蛋白，參與了細(xì)胞-基質(zhì)的相互作用及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[11]。近年來的研究表明，SDC-1 在肝纖維化的進(jìn)程中可能發(fā)揮著重要作用[5]。研究發(fā)現(xiàn)，肝癌細(xì)胞表面表達(dá)的SDC-1是阻止肝癌細(xì)胞遷移的重要因素[12]。因此，探究SDC-1 表達(dá)與肝纖維化之間的關(guān)系，以及其在肝纖維化進(jìn)程中的作用機(jī)制，對于阻止肝纖維化進(jìn)展具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著肝纖維化程度逐漸加重，慢性乙型肝炎患者血清SDC-1 的表達(dá)水平呈升高趨勢，這表明慢性乙型肝炎患者血清SDC-1 表達(dá)顯著上調(diào)，且其與肝纖維化進(jìn)程相關(guān)，其有可能成為評估乙型肝炎患者肝纖維化程度的血清學(xué)標(biāo)志物。

HSC 是肝纖維化進(jìn)程中的重要角色。正常情況下，HSC 處于靜止?fàn)顟B(tài)，位于肝小葉之間的腔隙中，當(dāng)肝臟受到損傷或炎癥反應(yīng)刺激時(shí)，HSC可被激活并轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，并通過合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，參與肝臟細(xì)胞外基質(zhì)重塑，導(dǎo)致肝組織纖維化及瘢痕形成[13]。因此，抑制HSC 的活化和增殖并誘導(dǎo)其凋亡，是目前抗纖維化治療的重要策略[14]。TGF-β1 是肝纖維化形成的關(guān)鍵因子[15]。本研究使用TGF-β1 誘導(dǎo)LX-2細(xì)胞活化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與NC 組相比，TGF-β1 組中α-SMA 蛋白及α-SMAmRNA 的相對表達(dá)量均顯著升高，這符合以往的研究結(jié)果[16]。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，與NC 組相比，TGF-β1 組中SDC-1 蛋白及SDC-1 mRNA 的相對表達(dá)量均顯著升高，進(jìn)一步證實(shí)TGF-β1 在誘導(dǎo)HSC 活化過程中可促使細(xì)胞內(nèi)SDC-1 表達(dá)上調(diào)，這提示SDC-1 與TGF-β1 可能存在相互作用?；诖?，本研究利用siRNA 技術(shù)引導(dǎo)內(nèi)源性核酸酶切割攜帶互補(bǔ)序列的靶向RNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染SDC-1 siRNA 后，經(jīng)TGF-β1 誘導(dǎo)的LX-2 細(xì)胞中α-SMA 蛋白及α-SMAmRNA 的相對表達(dá)量均顯著降低，這提示敲低SDC-1 表達(dá)可抑制經(jīng)TGF-β1 誘導(dǎo)的LX-2 細(xì)胞活化。肝臟中的THBS1 主要由HSC 合成及分泌[17]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1 與THBS1 存在相互作用，THBS1 可通過調(diào)節(jié)TGF-β1/α-SMA/膠原相關(guān)信號通路抑制人心臟成纖維細(xì)胞的增殖及膠原合成，進(jìn)而改善由心臟成纖維細(xì)胞中細(xì)胞外基質(zhì)增多所引起的纖維化改變[18]。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染SDC-1 siRNA后經(jīng)TGF-β1 誘導(dǎo)活化的LX-2 細(xì)胞中TGF-β1、THBS1 蛋白及其mRNA 的相對表達(dá)量均顯著降低，這提示敲低SDC-1 表達(dá)可抑制TGF-β1/THBS1 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。此外，本研究結(jié)果顯示，敲低SDC-1 表達(dá)后，經(jīng)TGF-β1 誘導(dǎo)活化的LX-2 細(xì)胞的增殖活性顯著減弱，G1期細(xì)胞占比顯著升高，S 期和G2期細(xì)胞占比顯著降低，這提示敲低SDC-1 表達(dá)可抑制HSC 的活化及增殖，阻滯HSC 由G1期進(jìn)入S 期和G2期。因此，通過干擾SDC-1 表達(dá)，可抑制HSC活化并減輕纖維化程度，SDC-1 有望成為抗纖維化治療的潛在靶點(diǎn)。

綜上所述，敲低SDC-1 表達(dá)可能通過調(diào)控TGF-β1/THBS1 信號通路，抑制HSC 的活化及增殖，阻滯HSC 由G1期進(jìn)入S 期和G2期，進(jìn)而發(fā)揮抑制肝纖維化進(jìn)展的作用。SDC-1 與TGF-β1/THBS1信號通路間的調(diào)控作用有待今后開展更深入的研究揭示，同時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測SDC-1 的表達(dá)水平變化也有可能成為評估肝纖維化程度的方法。