IL-35 和IL-37 在幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎和胃潰瘍患者中的表達(dá)及臨床意義

王 瓊 呂 穎

幽門螺桿菌（Hp）是生長于人類胃部的一種特殊致病菌，Hp感染者常伴隨急性或慢性炎癥反應(yīng)[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球約50%的人群已感染Hp，其中2%～5%會(huì)發(fā)生胃癌，因此Hp感染被認(rèn)為是導(dǎo)致胃部疾病發(fā)生的重要因素[2]。胃炎是Hp感染者常見的并發(fā)疾病，根據(jù)癥狀持續(xù)時(shí)間可分為急性胃炎和慢性胃炎，其中慢性胃炎通常是胃潰瘍和胃癌等較嚴(yán)重胃部疾病的前驅(qū)疾病。研究表明，70%～85%的胃潰瘍和90%～95%的十二指腸潰瘍是由Hp感染誘發(fā)的[3]。IL-35 是IL-12 家族成員，被認(rèn)為是一種抗炎細(xì)胞因子，可以在多種病原體感染過程中調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)[4-5]。IL-37 是IL-1 家族成員，廣泛存在于骨髓、睪丸、淋巴結(jié)、胸腺和皮膚等組織器官中，其被認(rèn)為具有一定的抗炎作用[6-7]。IL-35 和IL-37 在多種病原體感染者中表達(dá)水平的變化已有不少報(bào)道，但關(guān)于兩者在Hp感染導(dǎo)致的胃炎和胃潰瘍患者中表達(dá)水平變化的報(bào)道較少。本研究探討了IL-35 和IL-37 在Hp相關(guān)性胃炎和胃潰瘍患者中表達(dá)水平的差異及臨床意義。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2019年6月至2021年6月中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四一醫(yī)院收治的胃炎和胃潰瘍患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）行胃鏡檢查，且結(jié)果顯示有胃黏膜改變；（2）符合《慢性胃炎基層診療指南（2019年）》[8]中胃炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)；（3）符合《消化性潰瘍基層診療指南（2023年）》[9]中消化性潰瘍的診斷標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)胃鏡確診；（4）符合《第六次全國幽門螺桿菌感染處理共識(shí)報(bào)告（非根除治療部分）》[10]中Hp感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）近2 個(gè)月內(nèi)服用過阿司匹林或非甾體抗炎藥；（2）合并惡性腫瘤；（3）合并嚴(yán)重代謝性疾病或自身免疫病；（4）服用免疫抑制劑；（5）感染HBV、丙型肝炎病毒（HCV）或人類免疫缺陷病毒（HIV）等。最終納入124 例患者，其中Hp相關(guān)性胃炎和胃潰瘍患者共80 例，非Hp相關(guān)性胃炎和胃潰瘍患者共44 例。所有入組患者及家屬均簽署知情同意書，本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 分組和資料收集

在入組的124 例患者中，Hp相關(guān)性胃炎患者42 例（設(shè)為HAG 組），非Hp相關(guān)性胃炎患者24例（設(shè)為nHAG 組），Hp相關(guān)性胃潰瘍患者38 例（設(shè)為HGU 組），非Hp相關(guān)性胃潰瘍患者20 例（設(shè)為nHGU 組）。收集所有入組患者的性別、年齡、BMI，以及血清總膽固醇（TC）、尿酸（UA）、ALT、AST 和C 反應(yīng)蛋白（CRP）水平等臨床資料。

1.3 樣本采集

采集入組患者的空腹外周血10 mL，500×g 離心10 min，分離血漿，所得血漿凍存于-80 ℃冰箱，待后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其中IL-35 和IL-37 的表達(dá)水平。所有入組患者在行胃鏡檢查時(shí)采集胃黏膜活體組織，碾碎后加入裂解液在冰上充分裂解，使用總RNA 提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒[均購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司]獲取cDNA，凍存于-80 ℃冰箱，待測(cè)。

1.4 血漿中IL-35 和IL-37 蛋白的表達(dá)水平檢測(cè)

采用ELISA 法檢測(cè)血漿中IL-35 和IL-37 蛋白的表達(dá)水平。取1.3 中的血漿在室溫下融化，500×g 離心5 min，使用ELISA 檢測(cè)試劑盒（購自美國R＆D 公司）并嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。使用HM-96A 型多功能酶標(biāo)儀（購自山東恒美電子科技有限公司）進(jìn)行比色分析，測(cè)定樣本在450 nm波長處的光密度（OD）值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)OD 值計(jì)算樣本含量。

1.5 胃黏膜組織中IL-35 和IL-37 mRNA 的表達(dá)水平檢測(cè)

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)胃黏膜組織中IL-35 和IL-37 mRNA 的表達(dá)水平。單個(gè)樣本的PCR反應(yīng)體系包括Master mix、IL-35 或IL-37 的正向引物和反向引物各1 μL、樣本cDNA 和ddH2O。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)處理5 min；95 ℃ 40 s，60 ℃40 s，72 ℃ 15 s，共計(jì)35 個(gè)循環(huán)；最后4 ℃ 2 h。以GAPDH 作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算IL-35 和IL-37 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)并合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 23.0 和GraphPad 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)。采用Spearman 相關(guān)系數(shù)法分析Hp相關(guān)性胃炎和胃潰瘍患者中IL-35 和IL-37 的表達(dá)水平與胃潰瘍發(fā)生的相關(guān)性。采用logistic 回歸模型分析影響Hp相關(guān)性胃潰瘍發(fā)生的危險(xiǎn)因素。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組的臨床資料比較

結(jié)果表明，4 組的年齡、性別構(gòu)成，以及BMI、TC、UA、ALT、AST 和CRP 水平的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），提示具有可比性。見表2。

表2 各組的臨床資料比較

2.2 HAG 組和nHAG 組中IL-35 和IL-37 的表達(dá)水平比較

由表3 可知，與nHAG 組相比，HAG 組患者血漿中IL-35 和IL-37 蛋白的表達(dá)水平，以及胃黏膜組織中IL-35 和IL-37 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量均顯著降低，組間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。

表3 HAG 組和nHAG 組中IL-35 和IL-37 的表達(dá)水平比較

2.3 HGU 組和nHGU 組中IL-35 和IL-37 的表達(dá)水平比較

由表4 可知，與nHGU 組相比，HGU 組血漿中IL-35 和IL-37 蛋白的表達(dá)水平，以及胃黏膜組織中IL-35 和IL-37 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量均顯著降低，組間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。

表4 HGU 組和nHGU 組中IL-35 和IL-37 的表達(dá)水平比較

2.4 Hp 相關(guān)性胃炎和胃潰瘍患者的各項(xiàng)指標(biāo)與胃潰瘍發(fā)生的相關(guān)性

結(jié)果顯示，Hp相關(guān)性胃潰瘍患者血漿中IL-37蛋白的表達(dá)水平，以及胃黏膜組織中IL-35 和IL-37 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量均與胃潰瘍的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)（P均＜0.05），其余指標(biāo)與胃潰瘍的發(fā)生均無顯著相關(guān)性（P均＞0.05）。見表5。

表5 Hp 相關(guān)性胃潰瘍患者的各項(xiàng)指標(biāo)與胃潰瘍發(fā)生的相關(guān)性

2.5 胃潰瘍發(fā)生的影響因素分析

以Hp相關(guān)性胃炎和胃潰瘍患者是否發(fā)生胃潰瘍作為因變量（發(fā)生胃潰瘍=1，未發(fā)生胃潰瘍=0），以2.4 中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）的項(xiàng)目（包括IL-35 mRNA、IL-37 和IL-37 mRNA）作為自變量，納入logistic 回歸模型分析，結(jié)果顯示IL-35 mRNA、IL-37 和IL-37 mRNA 均為胃潰瘍發(fā)生的保護(hù)因素（P均＜0.05）。見表6。

表6 影響胃潰瘍發(fā)生的logistic 回歸模型分析

3 討論

Hp感染是胃炎、胃潰瘍等消化系統(tǒng)疾病的重要致病因素，也是導(dǎo)致消化道腫瘤發(fā)生及進(jìn)展的重要因素[11]。患者感染Hp后，致病菌會(huì)穿透胃壁黏液層，定植于胃上皮細(xì)胞表面并大量增殖，同時(shí)伴隨毒素因子及多種炎癥細(xì)胞因子在細(xì)菌定植處大量累積，引發(fā)局部及全身性免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，加重胃黏膜損傷程度，最終導(dǎo)致不同程度的消化系統(tǒng)疾病[12-13]。研究表明，多種炎癥細(xì)胞因子參與了Hp感染引起的胃黏膜損傷過程，其中IL 家族扮演了重要角色[14]。IL-1、IL-6 和IL-27 等促炎細(xì)胞因子在Hp相關(guān)性消化道疾病患者中表達(dá)水平的變化已有不少報(bào)道[15-16]，但關(guān)于抗炎細(xì)胞因子（如IL-35、IL-37）的表達(dá)水平變化尚未明確，本研究對(duì)此進(jìn)行了探討。

研究表明，在多種急慢性感染性疾病、免疫相關(guān)疾病患者中，IL-35 具有抑制炎癥細(xì)胞增殖的作用[17]。在自身免疫性結(jié)腸炎患者中，IL-35 抑制Th1 和Th17 細(xì)胞增殖的作用較IL-27 更強(qiáng)，其可以在一定程度上避免因過度自身免疫反應(yīng)導(dǎo)致的腸道損傷[18]。p35 和EBI3 是IL-35 的2 個(gè)亞基，均參與了免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)過程。研究表明，p35可減輕單純皰疹病毒性角膜炎（HSK）合并慢性HBV 感染大鼠的炎癥反應(yīng)，而EBI3 能夠通過下調(diào)IL-17 和IL-22 的表達(dá)及抑制Th17 細(xì)胞的活性，從而減弱大鼠的免疫防御功能[19]。IL-37 在多種病理、生理過程中發(fā)揮著抗炎作用。巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞可以通過分泌IL-37 抑制其他炎性細(xì)胞因子（如IL-1α、IL-1β、IL-6 和TNF-α 等）的表達(dá)[20]。研究表明，IL-37 通過附著在IL-18Rα、IL-18BP 和IL-37/IL-18Rα 復(fù)合體上而激活抗炎反應(yīng)[21]；另有研究表明，IL-37 在受到機(jī)體內(nèi)外源性因素的刺激后會(huì)被半胱氨酸特異性天冬氨酸蛋白酶-1（caspase-1）激活，通過改變細(xì)胞膜通透性而發(fā)揮抗菌、抗病毒、中和內(nèi)毒素及抑癌等多種免疫防御作用[22]。

本研究結(jié)果顯示，Hp相關(guān)性胃炎和胃潰瘍患者血漿中IL-35 和IL-37 蛋白的表達(dá)水平，以及胃黏膜組織中IL-35 和IL-37 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量均較未感染者顯著降低；此外，通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)血漿中IL-37 蛋白的表達(dá)水平，以及胃黏膜組織中IL-35 和IL-37 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量均與Hp相關(guān)性胃潰瘍的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)，而血漿中IL-35 蛋白的表達(dá)水平與Hp相關(guān)性胃潰瘍的發(fā)生無顯著相關(guān)性，這可能與納入研究的樣本量較少，或ELISA 檢測(cè)結(jié)果的偏倚有關(guān)。本研究中l(wèi)ogistic 回歸模型分析結(jié)果顯示，IL-35 mRNA、IL-37 和IL-37 mRNA 均為胃潰瘍發(fā)生的保護(hù)因素。以上結(jié)果提示，Hp感染會(huì)降低抗炎細(xì)胞因子IL-35 和IL-37 的蛋白表達(dá)水平和轉(zhuǎn)錄水平。由此推測(cè)，Hp可能通過上述途徑抑制機(jī)體固有免疫防御和特異性免疫防御功能，導(dǎo)致Hp定植處的胃黏膜屏障受損，進(jìn)而誘導(dǎo)Hp相關(guān)性胃炎患者的病情加重，但Hp相關(guān)性胃炎是否更容易進(jìn)展為胃潰瘍或胃癌，仍有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，Hp相關(guān)性胃炎和胃潰瘍患者中IL-35 和IL-37 均呈低表達(dá)，兩者對(duì)于診斷胃炎和胃潰瘍患者是否感染Hp具有一定應(yīng)用價(jià)值。本研究存在一定的局限性：首先，本研究為單中心研究，且所有入組患者均需行胃鏡檢查及活體組織檢查，導(dǎo)致最終納入的病例數(shù)較少，今后的研究需擴(kuò)大樣本量；其次，本研究僅選擇了IL-35 和IL-37 作為觀察指標(biāo)，未對(duì)其他炎癥細(xì)胞因子進(jìn)行檢測(cè)；最后，本研究探討了IL-35 和IL-37 在Hp相關(guān)性與非Hp相關(guān)性胃炎和胃潰瘍患者中表達(dá)水平的差異，今后需進(jìn)一步分析兩者發(fā)揮抗炎效應(yīng)的具體作用機(jī)制。