雷公藤紅素抑制血管內(nèi)皮細胞株體外增殖的作用探究

劉智勇,翁小琴,薛倩倩,陳惠云

膠質(zhì)瘤是一種多見的顱內(nèi)惡性實體腫瘤,患者的血管密度會嚴重影響該病的嚴重程度、腫瘤惡性程度及預后[1-2],因此,臨床治療常以抗腫瘤血管生成為關鍵點,故多選用腫瘤血管抑制劑抑制血管內(nèi)皮細胞增殖[3]。雷公藤紅素取自衛(wèi)矛科植物雷公藤的全株或去皮木質(zhì)部,是雷公藤的主要活性成分之一,具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理作用[4]。本研究旨在探討雷公藤紅素對血管內(nèi)皮細胞株體外增殖的抑制作用,現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 以血管內(nèi)皮細胞株ECV304為實驗標本,分別使用低濃度、高濃度的雷公藤紅素作用于血管內(nèi)皮細胞株ECV304。

1.2 試劑與儀器 血管內(nèi)皮細胞株ECV304購于American Type Culture Collection,RPMI 1640培養(yǎng)基購于GIBCO BRL公司,小牛血清購于上海實生公司;雷公藤紅素購于成都普思(PS0048-0020),純度>98%;二甲基亞砜(DMSO)購于Sigma公司,溴化丙啶購于法國Genetech公司。流式細胞儀購于Coulter公司,型號為Epics XL型。

1.3 觀察指標與實驗方法 將不同濃度雷公藤紅素作用于血管內(nèi)皮細胞株ECV304中,通過繪制生長曲線、HE染色、流式細胞儀觀察細胞生長曲線、細胞形態(tài)、內(nèi)皮細胞周期及細胞凋亡情況。

1.3.1 不同濃度雷公藤紅素作用下的內(nèi)皮細胞生長情況:使用DMSO對雷公藤紅素進行助溶,而后使用RPMI 1640培養(yǎng)基將其稀釋至實驗所需濃度,DMSO最終濃度需低于0.1%;取出血管內(nèi)皮細胞株,于24孔板中以1×104/孔進行接種,分別加入5、10、15、20 μg/ml 4種濃度的雷公藤紅素,并以0.1% DMSO為陰性對照組。在第2、4、6天時,在每個濃度孔中隨機性取3個,進行消化、吹打為單細胞懸液,而后使用0.04%臺盼藍染色2 min,而后計算存活細胞數(shù)量,經(jīng)過3次計數(shù),2次重復實驗,取平均數(shù)。

1.3.2 內(nèi)皮細胞涂片HE染色:將蓋玻片置于培養(yǎng)皿中,接種血管內(nèi)皮細胞株ECV304后置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,而后更換雷公藤紅素濃度為20 μg/ml的培養(yǎng)基,繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中維持96 h,最后使用4%中性甲醛進行固定、染色,在光鏡下觀察內(nèi)皮細胞形態(tài)。

1.3.3 內(nèi)皮細胞DNA周期及細胞凋亡測定:將血管內(nèi)皮細胞株ECV304于6孔板內(nèi)以2.0×105個/孔進行接種,于37 ℃培養(yǎng)箱中過夜,待細胞融合度達50%～60%時,棄上清液,分別加入不同濃度雷公藤紅素的RPMI 1640培養(yǎng)基,干預48 h。其中15、20 μg/ml濃度雷公藤紅素分別設置3個孔,分別于第2、4、6天進行消化,收集1×106個細胞,使用4 ℃的冷乙醇固定2 h后,加入溴化丙啶,上機進行檢測,其余各個濃度與對照孔均于第4天進行同樣操作。重復實驗2次,計算15、20 μg/ml雷公藤紅素作用下細胞周期及細胞凋亡情況。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)進行描述性統(tǒng)計;以時間為橫坐標,細胞數(shù)量(×105個)為縱坐標,繪制各濃度雷公藤紅素作用下的內(nèi)皮細胞生長曲線。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度雷公藤紅素作用下內(nèi)皮細胞生長曲線 繪制內(nèi)皮細胞生長曲線發(fā)現(xiàn),處理孔內(nèi)的內(nèi)皮細胞生長速度明顯降低、倍增時間延長。當細胞數(shù)>1×105個后,細胞數(shù)量則立即升高,雷公藤紅素可發(fā)揮一定的抑制效果。當雷公藤紅素濃度為20 μg/ml以上時,細胞數(shù)量則較少增加,出現(xiàn)大量漂浮的細胞碎片,活細胞比例約為62%,見圖1。

圖1 不同濃度雷公藤紅素作用下內(nèi)皮細胞生長曲線圖

2.2 內(nèi)皮細胞形態(tài) 在光鏡下觀察內(nèi)皮細胞形態(tài),發(fā)現(xiàn)對照孔內(nèi)細胞大部分為梭形、三角形,部分可見長偽足,生長舒展且相互連接較多,周圍可見空暈,邊界清晰;當密度緩慢提升時,細胞轉(zhuǎn)變?yōu)楸馄?即“鋪路鵝卵石”狀,邊界模糊。雷公藤紅素處理孔密度較低,活細胞比例和對照孔相比較低,且產(chǎn)生死亡細胞崩解碎片。隨雷公藤紅素濃度升高,上述現(xiàn)象更加顯著,且細胞變圓、貼壁差,可見漂浮的細胞碎片,未見凋亡小體及細胞。

2.3 不同濃度雷公藤紅素作用48 h內(nèi)皮細胞周期及細胞凋亡情況 各濃度雷公藤紅素作用下的S期細胞比率與陰性對照組比較均有顯著差異,在5、10、15 μg/ml雷公藤紅素作用下,濃度越高,G1期細胞比率越低、S期細胞比率越高、G2期細胞比率變化則不明顯;在20 μg/ml雷公藤紅素作用下,細胞壞死碎片數(shù)目明顯升高,凋亡率最高;在各濃度中均未出現(xiàn)凋亡的“亞二倍體”峰,見表1。

表1 不同濃度雷公藤紅素作用48 h內(nèi)皮細胞周期及細胞凋亡情況 (%)

2.4 15 μg/ml雷公藤紅素作用不同時間內(nèi)皮細胞周期及細胞凋亡情況 隨著15 μg/ml雷公藤紅素作用時間的延長,未出現(xiàn)明顯的細胞凋亡情況,G1期細胞比率在藥物作用第4天時最低,S期細胞比率在第4天時最高,見表2。

表2 15 μg/ml雷公藤紅素作用不同時間內(nèi)皮細胞周期及細胞凋亡情況 (%)

2.5 20 μg/ml雷公藤紅素作用不同時間內(nèi)皮細胞周期及細胞凋亡情況 20 μg/ml雷公藤紅素作用的第2、4、6天,均出現(xiàn)較明顯的細胞凋亡,G1期細胞比率在藥物作用第4天時最低、S期細胞比率在藥物作用第4天時最高,見表3。

表3 20 μg/ml雷公藤紅素作用不同時間內(nèi)皮細胞周期及細胞死亡情況 (%)

3 討 論

血管生成又稱血管新生化,指活體組織于已存在的微血管床上芽生出新的將毛細血管作為主體的血管系統(tǒng)的過程[5-6]。腫瘤血管生成一般分為起始、浸潤、增生、成熟、分化等階段,人為干預該過程可對其生長、轉(zhuǎn)移產(chǎn)生抑制作用,且腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移常依賴于血管生長,因此,可通過抑制血管內(nèi)皮細胞的血管生長抑制腫瘤生成。雷公藤紅素是紅色晶體化學物質(zhì),其分子式為C29H38O4,是一種蛋白酶體抑制劑,可通過抑制蛋白酶體活性而誘發(fā)癌細胞凋亡,該物質(zhì)具有較強的抗氧化、抗新生血管生成、抗類風濕等作用,故可用于抗腫瘤、改善腦神經(jīng)等疾病的治療,是值得關注的天然活性產(chǎn)物。近年來有學者將其用于抑制腫瘤生成,效果顯著[7-8]。

本研究分別使用低濃度、高濃度的雷公藤紅素作用于血管內(nèi)皮細胞株ECV304中,結(jié)果顯示,各濃度雷公藤紅素作用下的S期細胞比率與陰性對照組比較均有顯著差異,在5、10、15 μg/ml雷公藤紅素作用下,濃度越高,G1期細胞比率越低、S期細胞比率越高、G2期細胞比率變化則不明顯;在20 μg/ml雷公藤紅素作用下,細胞壞死碎片數(shù)目明顯升高,凋亡率最高;在各濃度中均未出現(xiàn)凋亡的“亞二倍體”峰。此外,隨著15 μg/ml雷公藤紅素作用時間的延長,未出現(xiàn)明顯的細胞凋亡情況,G1期細胞比率在藥物作用第4天時最低;20 μg/ml雷公藤紅素作用的第2、4、6天,均出現(xiàn)較明顯的細胞凋亡,G1期細胞比率在藥物作用第4天時最低、S期細胞比率在藥物作用第4天時最高,表明雷公藤紅素可顯著抑制血管內(nèi)皮細胞的體外增殖,且低濃度雷公藤紅素可阻礙細胞S期,但不會引起較多細胞凋亡[9-10],而高濃度雷公藤紅素則以細胞毒性為主,可促使細胞凋亡,且對S期細胞抑制能力變?nèi)酢?/p>

細胞周期常分為G1、S、G2、M期,多數(shù)體外培養(yǎng)細胞的周期為20～30 h,其中G1期細胞周期最長,通常為10～15 h,主要負責為DNA復制、蛋白質(zhì)合成提供準備工作,并轉(zhuǎn)運氨基酸、糖類、合成RNA、cAMP、鈣調(diào)蛋白等物質(zhì)[11-12];S期細胞可在DNA聚合酶、鏈接酶、啟動子等共同作用下開展DNA復制,同時合成組蛋白;G2期屬合成后期,細胞主要負責為有絲分裂提供能量及物質(zhì)準備;M期為有絲分裂期,時間最短。雷公藤紅素干預后,S期細胞數(shù)量提升,G2期細胞數(shù)量無顯著變化,表明其可阻礙S期細胞增殖。不同濃度雷公藤紅素作用下均未出現(xiàn)凋亡的“亞二倍體”峰,且HE染色可見數(shù)量較多的細胞碎片,無顯著凋亡情況,表明細胞凋亡大多為壞死[13-14]。在高濃度雷公藤紅素作用下,S期細胞比率開始下降,細胞壞死碎片數(shù)目明顯升高,其原因可能為在高濃度雷公藤紅素的長期抑制下,S期細胞變化不再活躍,老化度較高,更易因細胞毒性而凋亡。理想的抗血管生成藥物需既能抑制內(nèi)皮細胞增殖、血管生成,又能抑制腫瘤細胞增殖,既往常用的去甲斑蟊素、TNP-470及其衍生物CA4P均是成熟度較高的抗腫瘤藥物、抗血管生成劑[15]。本研究發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素具有對內(nèi)皮細胞遷移、血管生長、SHG44、μ251、C6等膠質(zhì)瘤細胞生長的抑制作用,可顯著抑制血管內(nèi)皮細胞株ECV304的體外增殖,表示其滿足血管抑制劑條件,較適用于膠質(zhì)瘤的臨床治療。

綜上所述,雷公藤紅素可顯著抑制血管內(nèi)皮細胞株ECV304的體外增殖,較適用于膠質(zhì)瘤的臨床治療。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突。