低頻脈沖電磁場聯(lián)合中藥對膝骨關(guān)節(jié)炎小鼠MMP-13和Col-X的影響

李心蕓,熊振飛,吳杏英,湯樣華

(1.杭州市蕭山區(qū)第一人民醫(yī)院 康復(fù)科,浙江 杭州311200;2.杭州市蕭山區(qū)中醫(yī)院 骨科,浙江 杭州311201;3.浙江中醫(yī)藥大學(xué) 第三臨床醫(yī)學(xué)院,浙江 杭州 310053)

關(guān)節(jié)軟骨纖維化、退行性變和丟失,關(guān)節(jié)邊緣和軟骨下骨骨質(zhì)再生,以至關(guān)節(jié)不穩(wěn)、半脫位和屈曲性攣縮是膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis,KOA)的主要發(fā)病機(jī)制[1],與正常磨損、年齡及肥胖等密切相關(guān)[2]。KOA的總發(fā)病率達(dá)到8.1%,其中,在60歲以上人群中高達(dá)30%[3]。目前臨床治療KOA尚無特效藥,多用非甾體抗炎鎮(zhèn)痛藥、膝關(guān)節(jié)鏡治療及人工膝關(guān)節(jié)置換等,但常伴有各種副反應(yīng)及并發(fā)癥[4]。

低頻脈沖電磁場作為一種無創(chuàng)傷、費(fèi)用低廉、可長期使用的非藥物療法,近年來成為骨關(guān)節(jié)炎物理治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。中醫(yī)辨證分型分期研究發(fā)現(xiàn)[5],骨關(guān)節(jié)炎以肝腎虧虛、氣血不足為本,局部血瘀為標(biāo)。團(tuán)隊(duì)前期研究結(jié)果[6-7]顯示,自擬益氣化瘀補(bǔ)腎方對氣虛血瘀型膝骨性關(guān)節(jié)炎具有較好的治療效果。本研究選取基質(zhì)金屬蛋白酶-13(MMP-13)、X型膠原蛋白(Col-X)作為觀察指標(biāo),從分子生物學(xué)、形態(tài)學(xué)角度來探討益氣補(bǔ)腎化瘀方聯(lián)合低頻脈沖電磁場對小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠45只(8周齡)由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供(動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(滬)2013-0016)。飼養(yǎng)條件:(22±2) ℃ 恒溫,濕度50%～60%,光照每12 h明暗交替,換風(fēng)次數(shù)15～20次/h。實(shí)驗(yàn)過程中對動(dòng)物的處置符合中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部頒發(fā)的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》的要求。本研究通過杭州市蕭山區(qū)第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核。

1.2 主要試劑和儀器 本研究中所用主要試劑包括Trizol、RIPA裂解液、PMSF、Citrate 檸檬酸鹽緩沖液(MDL)、蘇木素染液、DAB kit、MMP13 抗體、beta Catenin Antibody、小鼠TNF-α ELISA試劑盒、番紅固綠染色試劑盒、小鼠IL-1β ELISA試劑盒、SYBR Green qPCR試劑盒、HiFi-Script cDNA第一鏈合成試劑盒等,主要儀器有低頻脈沖電磁場治療儀(龍之杰,型號(hào)LGT-20000A)、Micro-CT(ZKKS,型號(hào)MCT-Ⅲ)、酶標(biāo)儀(MD,型號(hào)CMaxPlus)、核酸定量儀(Thermo Scientific,型號(hào)Nanodrop one)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(羅氏,型號(hào)LightCycler? 96)、正置熒光顯微鏡(Leica,型號(hào)DM3000)、成像系統(tǒng)(日本尼康,型號(hào)Nikon DS-U3)。

1.3 動(dòng)物造模 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后選取 42只小鼠制作膝骨關(guān)節(jié)炎模型。剩余2只小鼠作為陰性對照組,1只小鼠備用。模型組小鼠禁食24 h后用0.3%戊巴比妥鈉(100 μL/10 g)將小鼠深度麻醉并固定在恒溫手術(shù)板上,右側(cè)膝關(guān)節(jié)備皮、碘伏消毒,將模型組小鼠膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)切開,暴露髕韌帶,鈍性分離韌帶與右側(cè)肌肉間的筋膜,并向上分離股四頭肌,直至將鑷子插入到髕韌帶下方后,牽拉韌帶能將髕骨及韌帶拉向膝關(guān)節(jié)外側(cè)為止。將髕韌帶引向膝關(guān)節(jié)外側(cè),暴露膝關(guān)節(jié)腔,彎屈膝關(guān)節(jié),暴露前交叉韌帶,在直視下,將其剪斷或割斷,行前抽屜實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證前交叉韌帶已剪斷。清洗傷口,逐層縫合,術(shù)后每天肌肉注射給予小鼠青霉素5 000 U,連續(xù)3天。對照組小鼠鈍性分離肌肉和筋膜,同樣牽拉髕骨至一側(cè),但不剪斷前交叉韌帶。

造模8周后,分別取2只造模組小鼠、2只陰性對照組小鼠眼眶血清,離心后取上清液,檢測并對比2組血清中IL-1β和TNF-α的含量,結(jié)合脛骨平臺(tái)軟骨組織形態(tài)及后期Micro-CT表現(xiàn),確定小鼠造模是否成功。

1.4 分組及處理 于單腿造模2個(gè)月后選取2只小鼠驗(yàn)證是否造模成功,其余40只按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對照組、中藥組、低頻脈沖電磁場組、聯(lián)合組,每組各10只?？瞻讓φ战M和中藥組分別予以生理鹽水、益氣補(bǔ)腎化瘀方水煎劑灌胃,每次1 mL,每日2次;低頻脈沖電磁場組予低頻脈沖電磁場治療,每天1次,每次30 min;聯(lián)合組在中藥灌胃的基礎(chǔ)上加用低頻脈沖電磁場。益氣補(bǔ)腎化瘀方:黃芪15 g、黨參12 g、川芎12 g、丹參9 g、仙靈脾12 g、補(bǔ)骨脂12 g、防己10 g、牛膝12 g,每次制成水煎劑200 mL。膝關(guān)節(jié)電磁場治療的具體參數(shù)根據(jù)臨床應(yīng)用參數(shù)結(jié)合查閱文獻(xiàn)[8-9]制定:①磁場強(qiáng)度采用兩檔強(qiáng)度交變,第一檔強(qiáng)度為2.5～3.5 mT,第二檔強(qiáng)度為 3.5～4.2 mT;②頻率共8檔,按出現(xiàn)順序依次為32、28、24、22、20、16、12、8 Hz,治療過程中采用頻率掃描模式,每4 min變化1檔。所有組均連續(xù)處理2個(gè)月。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.5.1 小鼠膝關(guān)節(jié)CT影像表現(xiàn) 干預(yù)結(jié)束后,先行Micro-CT掃描各組小鼠右膝關(guān)節(jié):參數(shù)為電壓45 KeV、電流555 μA、功率25 W、曝光時(shí)間48 ms、分辨率35 μm、掃描角度180°,做9 μm連續(xù)掃描后選取一個(gè)固定的興趣區(qū)(ROI)體積進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。運(yùn)用NRecon軟件和CTvox軟件進(jìn)行小鼠腳掌的三維圖像重建和繪制3D立體圖,記錄骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、骨小梁的厚度(Tb.SP)、分離度(Tb.SP)和選取 ROI 體積(TV)。

1.5.2 KOA小鼠膝關(guān)節(jié)組織Col-X、MMP-13 mRNA表達(dá) 頸椎錯(cuò)位法處死各組KOA小鼠,提取組織樣本以備用:迅速剃掉小鼠腿部肌肉及韌帶,暴露小鼠右膝關(guān)節(jié),清除膝關(guān)節(jié)周圍的軟組織及韌帶等,將右膝關(guān)節(jié)上下約1 cm截?cái)?。Trizol提取各組模型小鼠的細(xì)胞總RNA,并用mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒,反轉(zhuǎn)錄成cDNA。取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。qRT-PCR反應(yīng)條件為:94 ℃,40 s; 56 ℃,40 s,72 ℃,1 min,共40次循環(huán)。qRt-PCR引物序列見表1。

表1 小鼠qRT-PCR引物序列Table 1 Mice qRT-PCR primer sequence

1.5.3 膝關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)及MMP-13表達(dá) 取關(guān)節(jié)軟骨固定、石蠟包埋,采用番紅-固綠染色、免疫組化染色分別觀察膝關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)及MMP-13表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 造模情況 整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中,沒有發(fā)生動(dòng)物死亡和感染現(xiàn)象。造模8周后,造模組血清IL-1β和TNF-α水平高于陰性對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.001),見圖1。獲取小鼠膝關(guān)節(jié)組織樣本時(shí)發(fā)現(xiàn)造模后的小鼠脛骨平臺(tái)軟骨逐漸出現(xiàn)色澤改變、局灶充血、表面磨損、軟骨表面龜裂、潰瘍形成,后期Micro-CT檢測時(shí)發(fā)現(xiàn)造模小鼠膝關(guān)節(jié)骨體積分?jǐn)?shù)與骨小梁厚度較正常值低。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[10],提示骨性關(guān)節(jié)炎小鼠造模成功。

注:與空白對照組比較,▲P<0.05,▲▲P<0.01。圖1 模型組與空白對照組小鼠血清中的 IL-1β﹑TNF-α水平比較Figure 1 Comparison of serum levels of IL-1β and TNF-α between the model group and the control group

2.2 膝關(guān)節(jié)組織Col-X與MMP-13 mRNA表達(dá) 與空白對照組相比,中藥組、低頻脈沖電磁場組、聯(lián)合組KOA小鼠膝關(guān)節(jié)組織中Col-X與MMP-13的表達(dá)水平均降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中,聯(lián)合組最低。見表2。

表2 KOA小鼠膝關(guān)節(jié)組織中Col-X、MMP-13 mRNA的表達(dá)水平Table 2 Expression levels of Col-X and MMP-13 mRNA in knee tissue of KOA

2.3 膝關(guān)節(jié)軟骨組織的變化情況 番紅-固綠染色顯示:空白對照組膝關(guān)節(jié)表面有較大裂隙,軟骨缺失,軟骨基質(zhì)番紅染色不明顯,軟骨細(xì)胞數(shù)量嚴(yán)重減少,潮線模糊不清;與空白對照組相比,低頻脈沖電磁場組、中藥組、聯(lián)合組骨平面較為完整,磨損程度較輕;尤其是聯(lián)合組,骨面基本完整無明顯磨損。見封三圖1。

2.4 小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中MMP-13的表達(dá)情況 免疫組化檢測顯示:中藥組、低頻脈沖電磁場組、聯(lián)合組小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中的MMP-13蛋白表達(dá)量均低于空白對照組,且聯(lián)合組低于其他2個(gè)治療組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見封三圖2。

2.5 小鼠膝關(guān)節(jié)組織的Micro-CT表現(xiàn) 與中藥組相比,聯(lián)合組小鼠膝關(guān)節(jié)骨體積分?jǐn)?shù)與骨小梁厚度均上升,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);2組間的骨小梁分離度與骨體積,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3、圖2。

表3 低頻脈沖電磁場對OA小鼠膝關(guān)節(jié)組織的影響Table 3 Effects of low-frequency pulsed electromagnetic field on knee tissue of OA

圖2 中藥組(A)和聯(lián)合組(B)膝關(guān)節(jié)組織的微CT掃描影像表現(xiàn)Figure 6 MicroCT scanning image of knee tissue in the Chinese medicine group (A) and the combined group (B)

3 討論

中醫(yī)學(xué)治病求本,標(biāo)本皆治,且副反應(yīng)較少,日漸成為臨床治療KOA的研究熱點(diǎn)之一。本研究團(tuán)隊(duì)前期研究結(jié)果[6-7]表明:骨關(guān)節(jié)炎以肝腎虧虛、氣血不足為本,局部血瘀為標(biāo);自擬益氣化瘀補(bǔ)腎方對膝骨性關(guān)節(jié)炎具有較好的治療效果,基質(zhì)金屬蛋白酶-13(MMP-13)、X型膠原蛋白(Col-X)與膝骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制及患者病程緊密相關(guān)。

低頻脈沖電磁場作為一種非藥物療法,具有無創(chuàng)傷、 無感染、操作簡單、費(fèi)用低廉、可長期使用、安全性好等優(yōu)勢。目前,脈沖電磁場(PEMFs)正被應(yīng)用于骨科康復(fù)領(lǐng)域以促進(jìn)成骨修復(fù)和保護(hù)關(guān)節(jié)[8]。脈沖電磁場刺激骨愈合的科學(xué)基礎(chǔ)是運(yùn)用電活動(dòng)給各種骨細(xì)胞施加機(jī)械負(fù)荷從而促進(jìn)骨細(xì)胞的再生和修復(fù)[9]。本研究結(jié)果顯示:①從分子生物學(xué)角度分析,與空白對照組相比較,低頻脈沖電磁場組KOA小鼠膝關(guān)節(jié)組織中Col-X與MMP-13的表達(dá)水平有所降低,尤其是聯(lián)合組KOA小鼠膝關(guān)節(jié)組織中Col-X與MMP-13的表達(dá)水平是最低的;②從解剖學(xué)、影像學(xué)角度分析,聯(lián)合組KOA小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織損傷程度最輕,軟骨及骨面基本完整無明顯磨損,骨體積分?jǐn)?shù)與骨小梁厚度在各組數(shù)據(jù)中最高。

MMP-13是一種能調(diào)解細(xì)胞外基質(zhì)退化的關(guān)鍵酶。已有研究揭示MMP-13可通過各種ECM分子降解細(xì)胞外基質(zhì)中90%的Ⅱ型膠原蛋白(Col-Ⅱ),而Col-Ⅱ在軟骨的生理周轉(zhuǎn)中發(fā)揮作用[10]。 Zhang等[11]在研究miR-320靶向抑制β-catenin并降低MMP-13表達(dá)以抑制軟骨細(xì)胞膠原降解中也發(fā)現(xiàn)MMP-13極有可能是Wnt/β-catenin通路下游產(chǎn)物,這與本研究的前期研究結(jié)果相符[6-7]。一項(xiàng)有關(guān)動(dòng)物模型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的研究[12]表明,接受抗IL-17治療的老鼠出現(xiàn)MMP-13表達(dá)的減少和炎癥的緩解,這支持了MMP-13在關(guān)節(jié)炎進(jìn)展中的作用。當(dāng)MMP-13水平升高時(shí),軟骨細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)可能因軟骨的細(xì)胞外基質(zhì)退化而受損[13],從而觸發(fā)KOA。本研究結(jié)果表明MMP-13水平下降最顯著的KOA小鼠,膝關(guān)節(jié)軟骨組織損傷程度最輕,關(guān)節(jié)退化程度也較輕,這進(jìn)一步證明了MMP-13在KOA發(fā)生過程中起著關(guān)鍵作用。

目前,針對Col-X的研究雖然較少,但現(xiàn)有的研究[14]已發(fā)現(xiàn),KOA軟骨損傷的病理變化為軟骨細(xì)胞發(fā)生肥大變性,并伴有Col-X表達(dá)增多。且He 等[15]研究發(fā)現(xiàn)Col-X參與了肥大軟骨細(xì)胞生成的某個(gè)過程,可作為肥大軟骨細(xì)胞的特異性表達(dá)標(biāo)志物。Nicol等[16]在研究兒童骨生成的過程中發(fā)現(xiàn)Col-X在軟骨細(xì)胞胚胎期和機(jī)體生長發(fā)育過程中促進(jìn)軟骨內(nèi)成骨和使軟骨細(xì)胞周圍基質(zhì)鈣化,促進(jìn)骨骼的形成和發(fā)育。同時(shí)也有相關(guān)研究[17-18]表明,膠原蛋白可通過Wnt/β-catenin通路減少軟骨肥大細(xì)胞生成。本研究結(jié)果表明Col-X的下降越顯著,其關(guān)節(jié)軟骨損傷情況也越輕微,這也驗(yàn)證了上述研究結(jié)果。同時(shí),我們也發(fā)現(xiàn)Col-X常與MMP-13的表達(dá)存在一定的一致性。

綜上,低頻脈沖電磁場能改善KOA,并在此基礎(chǔ)上提高益氣補(bǔ)腎化瘀方對KOA的治療效應(yīng),加快KOA的癥狀改善,為KOA的臨床中西醫(yī)治療方案提供了一定的科學(xué)依據(jù)和借鑒意義。低頻脈沖電磁場(FPEMFs)治療膝骨性關(guān)節(jié)炎可能有以下3個(gè)作用機(jī)制:提高軟骨細(xì)胞功能減緩軟骨細(xì)胞退變,保護(hù)軟骨細(xì)胞;調(diào)控各種信號(hào)通路,從而引起一系列化學(xué)變化,保護(hù)軟骨細(xì)胞;促進(jìn)軟骨蛋白的合成進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的修復(fù),尤其是金屬蛋白酶。本研究中我們還發(fā)現(xiàn)MMP-13和Col-X可能存在相關(guān)性,兩者常處于共同升高或降低狀態(tài),所以Col-X極有可能也參與MMP-13降解軟骨細(xì)胞外基質(zhì)這一過程,Cao等[19]的研究結(jié)果也進(jìn)一步佐證了這一推測。前期研究發(fā)現(xiàn)MMP-13、Col-X與Wnt/β-catenin信號(hào)通路有著密切的關(guān)系,結(jié)合本研究結(jié)果,我們考慮益氣補(bǔ)腎化瘀方聯(lián)合低頻脈沖電磁場治療膝骨性關(guān)節(jié)炎極有可能是通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路完成,這也將成為后續(xù)研究的重點(diǎn)方向。