選擇性剪接在腫瘤化療耐藥中的研究進展

苗春萌,吳啟鵬,江振洲,張陸勇,2

(1.中國藥科大學新藥篩選中心,江蘇省藥效研究與評價服務中心,江蘇 南京 210009;2.廣東藥科大學新藥研發(fā)中心,廣東 廣州 510006)

選擇性剪接(alternative splicing,AS)是擴大轉(zhuǎn)錄組和構(gòu)成蛋白質(zhì)組多樣性的關(guān)鍵過程,為高等真核生物提供了進化優(yōu)勢。人類大約95%的基因通過AS機制轉(zhuǎn)錄一個以上的轉(zhuǎn)錄物,擴大基因組多樣性。AS是一個時空過程,對細胞生命活動、細胞分化和器官發(fā)育至關(guān)重要[1]。其中,受調(diào)控基因中的順式作用元件和反式剪接調(diào)節(jié)子之間的相互作用是保證AS過程精確執(zhí)行的關(guān)鍵條件[2]。研究發(fā)現(xiàn)致癌相關(guān)基因調(diào)節(jié)元件的突變[3]和剪接因子表達的改變[4],導致AS過程被擾亂,該過程與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。這也表明靶向突變順式作用元件或受損反式剪接調(diào)節(jié)子在癌癥治療中具有巨大價值[5]。

惡性腫瘤是危害人類健康的主要疾病之一。放化療、靶向免疫治療是治療腫瘤的常用方法,其中化療更是發(fā)揮著重要作用,但腫瘤細胞對化療藥物耐藥嚴重影響治療效果和患者預后。盡管近幾年癌癥化療取得了重大進展,但是許多對治療反應良好的患者對化療藥物產(chǎn)生了耐藥性,導致治療失敗。藥物靶點改變、藥物外排和DNA損傷修復等耐藥機制的研究一直是腫瘤研究的熱點,其中許多化療耐藥機制涉及基因和蛋白質(zhì)的突變和表達改變。細胞蛋白質(zhì)組是細胞對藥物產(chǎn)生化療反應的關(guān)鍵因素,受到基因突變、基因轉(zhuǎn)錄、mRNA加工、翻譯、蛋白質(zhì)修飾和蛋白質(zhì)降解等多個環(huán)節(jié)的影響。AS雖然是一種正常的細胞過程,但可以被癌細胞用于提高化療時的存活率[6]。對AS的調(diào)控是癌癥發(fā)展的重要機制,雖然已經(jīng)確定許多化療藥物可以影響AS,但AS在耐藥性中的作用尚未闡述明確[7]。本文總結(jié)了AS在腫瘤中發(fā)揮的作用,以及改變AS事件對不同癌癥耐藥性的病理影響,并討論AS如何調(diào)節(jié)癌細胞獲得耐藥性,以期為腫瘤化療耐藥性的進一步研究提供參考。

1 選擇性剪接與剪接體

1.1 選擇性剪接定義及意義選擇性剪接指的是mRNA 中外顯子進行不同組合產(chǎn)生多樣化的成熟mRNA的過程[8],進而可翻譯產(chǎn)生多個功能的蛋白質(zhì)。AS是蛋白質(zhì)多樣性的重要來源,在剪接過程中,前體mRNA(pre-mRNA)前轉(zhuǎn)錄本的內(nèi)含子被移除,外顯子按照在基因中出現(xiàn)的順序結(jié)合,進而形成不同的成熟mRNA變體,這些變體在翻譯后可以產(chǎn)生功能不同的蛋白質(zhì)。

與癌癥相關(guān)的異常剪接包括產(chǎn)生或破壞剪接位點或者剪接增強子或沉默子的突變,剪接因子的異常表達,以及影響剪接過程的信號通路受損[9]。在癌變過程中,許多剪切性因子過表達導致致癌通路的激活,比如MYC通路[10]。AS與許多生理活動息息相關(guān),如細胞分化、組織和器官發(fā)育、血管生成等[11]。 mRNA剪接位點內(nèi)的基因突變、剪接體或剪接調(diào)節(jié)因子表達水平的改變與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[12],腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成,也受到AS的影響。在mRNA加工過程中,AS可能會導致腫瘤細胞的細胞周期失調(diào)、細胞骨架紊亂、遷移和黏附,這些變化除了影響癌癥的發(fā)生發(fā)展過程,還會導致癌細胞對化療藥物的敏感性下降[13]。

近年來,AS在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用研究取得了很大進展,尤其是機制方面,但仍需要更多的研究來闡明剪接過程對癌癥表型的影響。而闡明AS在異常mRNA加工和修飾產(chǎn)生的癌癥特異性mRNA中的作用,將為癌癥治療提供新的策略。

1.2 選擇性剪接的過程AS是實現(xiàn)基因表達和蛋白質(zhì)組多樣性的重要過程,調(diào)節(jié)來自同一基因的多種蛋白質(zhì)異構(gòu)體的合成,是維持細胞多樣性的重要機制,該過程受到許多剪接體因子的調(diào)控[14]。剪接體主要由5個snRNPs (U1、U2、U4、U5和U6)組成,如圖1所示[15],依賴許多ATP酶和剪接因子促進snRNPs在剪接過程中不同步驟的結(jié)構(gòu)重塑,調(diào)控mRNA剪接反應。snRNPs是剪接體的核心單位。Sm蛋白也是剪接體的組成成分,是維持剪接體正常功能的關(guān)鍵蛋白,7個Sm蛋白共同形成異七聚環(huán)結(jié)構(gòu),分別為SmB/B′、SmE、SmF、SmG、SmD1、SmD2和SmD3。結(jié)構(gòu)高度相似的Sm蛋白在每個snRNA周圍形成一個七聚環(huán)結(jié)構(gòu),可能作為其他snRNP蛋白組裝的平臺。

圖1 剪接體的結(jié)構(gòu)和組成部分

AS過程由剪接體和剪接因子完成。首先,富含絲氨酸和精氨酸的剪接因子1蛋白(serine and arginine rich splicing factor 1,SRSF1)C端被細胞質(zhì)中富含絲氨酸/精氨酸的蛋白特異性激酶—SRSF蛋白激酶(SRSF protein kinase,SRPKs)二次磷酸化[16]。然后,磷酸化的SRSF蛋白被CDC2樣激酶1 (cyclindependent kinase-like 1-related kinase,CLK1)磷酸化。磷酸化的SRSF蛋白通過一個核糖核酸識別基序結(jié)合前核糖核酸[17],招募U1小核核糖核蛋白(U1 snRNP)和U2 snRNP與內(nèi)含子的剪接位點結(jié)合。U1 snRNP與5′剪接位點的保守序列G-U結(jié)合,U2 snRNP取代分支位點結(jié)合蛋白(BBP),與3′剪接位點的保守序列A-G結(jié)合。隨后,U4、U6和U5 snRNP在磷酸化的pre-mRNA加工因子激酶31(pre-mRNA processing factor 31,PRPF31)的作用下組裝Tri-snRNP(PRP31)和 pre-mRNA加工因子激酶6 (PRP6),兩個蛋白均被 pre-mRNA加工因子激酶4k (PRP4k)磷酸化[18]。PRP31通過pre-mRNA加工因子激酶28 (PRP28)與剪接體A相互作用。U2 snRNP取代U4 snRNP與U6和U5 snRNP結(jié)合,U6 snRNP取代U1 snRNP與內(nèi)含子5′剪接位點的保守序列G-U結(jié)合,產(chǎn)生剪接體B的構(gòu)象。最后,pre-mRNA經(jīng)歷兩次酯交換,第一次酯交換反應生成復合物 C,在復合物C中發(fā)生重排,促進第二次酯交換,產(chǎn)生剪接體后復合物,外顯子相互連接形成成熟的mRNA,之后內(nèi)含子被降解,snRNP被回收[19]。

AS作為一種重要的基因表達調(diào)控機制,極大地提高了轉(zhuǎn)錄組的復雜性和蛋白質(zhì)組的多樣性。但是當AS發(fā)生異常,會導致蛋白質(zhì)表達障礙和各種疾病,包括癌癥、神經(jīng)退行性疾病、肌肉營養(yǎng)不良以及心血管和免疫疾病等[20]。其中,腫瘤細胞通過異常剪接事件,表達異常蛋白,促進癌癥進展,這些異常剪接事件與腫瘤的惡性進展和化療耐藥性相關(guān)。

2 選擇性剪接在腫瘤化療耐藥中的作用

惡性腫瘤是一種嚴重危害人類健康的疾病,其發(fā)病率仍在不斷升高[21]。醫(yī)療技術(shù)的快速發(fā)展使得癌癥患者整體生存率有了較大提高,然而長期使用化療藥物的腫瘤患者容易逐漸產(chǎn)生耐藥性,進而導致治療失敗?；熌退幰殉蔀榭鼓[瘤治療中的一個重大問題。腫瘤耐藥機制復雜,主要包括增加藥物外排、DNA損傷修復增強、細胞周期失調(diào)、腫瘤微環(huán)境改變、腫瘤干細胞轉(zhuǎn)化(cancer stem cells,CSCs)、自噬、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)和細胞凋亡的抵抗等[22]。

腫瘤的固有耐藥或獲得性耐藥導致腫瘤復發(fā)是腫瘤化療的主要障礙。現(xiàn)有的腫瘤耐藥機制研究無法完全闡釋清楚耐藥的產(chǎn)生,仍需更深入的研究耐藥機制。近年來,越來越多的證據(jù)表明剪接體改變與腫瘤耐藥密切相關(guān)。異常的AS是改變腫瘤細胞基因表達譜的主要因素,它通過改變藥物的靶點和信號轉(zhuǎn)導途徑來誘導耐藥。以剪接體為治療藥物的靶點,結(jié)合傳統(tǒng)化療藥物聯(lián)合用藥,可能是克服耐藥性腫瘤的有效方法。常見的與化療耐藥相關(guān)的剪接體靶點有SRSF蛋白、SRPK蛋白、HNRNP蛋白、Sm蛋白、SPF45和SF3B1。

2.1 SRSF家族SRSF家族成員包含一個或多個RNA識別基序(rms)和一個c端精氨酸-絲氨酸重復序列,稱為RS域。SRSF蛋白參與多種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控過程,例如AS。一些SRSF蛋白可以增強交替剪接轉(zhuǎn)錄本,在不同的癌癥中發(fā)揮促癌特性[23],參與多種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控過程[24]。SRSF在胰導管腺癌、卵巢癌和乳腺癌的化療耐藥中發(fā)揮重要作用。

研究發(fā)現(xiàn),吉西他濱上調(diào)剪接因子SRSF1,誘導MAP激酶相互作用絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶2 (MAP kinase signal-integrating kinase 2,MNK2)基因向MNK2b變體轉(zhuǎn)化。MNK2b剪接變異體磷酸化真核起始因子4E(eukaryotic initiation factor 4E,eIF4E),減少吉西他濱誘導的凋亡,促進胰導管腺癌細胞存活、細胞增殖,最終對吉西他濱產(chǎn)生耐藥性[25]。在鉑類藥物治療耐藥性卵巢癌過程中發(fā)現(xiàn)剪接因子富含絲氨酸和精氨酸的剪接因子2(serine and arginine rich splicing factor 2,SRSF2)突變,提示AS可能有助于獲得性鉑耐藥性的發(fā)生[6]。富含絲氨酸和精氨酸的剪接因子3(serine and arginine rich splicing factor 3,SRSF3)過表達減弱了紫杉醇抑制乳腺癌細胞增殖的效果,SRSF3蛋白表達下調(diào)會顯著增加癌細胞對紫杉醇治療的敏感性[26]。以上結(jié)果提示剪接因子SRSF家族可能參與了腫瘤對化療藥物的耐藥。

2.2 SRPK家族SRPK家族成員是潛在的致癌基因,SRPK家族的3個主要成員為SRPK1、SRPK2和SRPK3,SRPK1和SRPK2在肺癌和肝癌中均可見上調(diào)[27]。在前列腺癌細胞中,SRPK1和SRPK2表達的增加與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),促進腫瘤細胞增殖和抗凋亡過程[28],在胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌和膠質(zhì)瘤化療耐藥中起作用。

研究發(fā)現(xiàn),SRPK1基因下調(diào)在吉西他濱單用或與順鉑聯(lián)合使用時都增加胰腺癌細胞的凋亡。在胰腺癌中高表達SRPK1抑制細胞增殖,促進細胞凋亡,增強化療敏感性[29]。有研究表明順鉑通過涉及Tip60、SRPK1和SRPK2蛋白的機制誘導低乙?；土姿峄问絊RSF2的積累,調(diào)節(jié)SRPK2的表達。在幾種人類肺癌細胞系(H358、H1299、H810、H69)中,SRSF2介導的SRSF2磷酸化在順鉑治療誘導細胞凋亡中起關(guān)鍵作用,提高肺癌細胞對順鉑的敏感性[30]。研究還發(fā)現(xiàn)SRPK1乙酰化與化療敏感性密切相關(guān)。在乳腺癌細胞MCF7和231細胞中,順鉑誘導SRPK1乙?；?但在相應的耐藥細胞中,順鉑降低了SRPK1的乙?；?但增加了SRPK1的磷酸化和激酶活性,促進一些抗凋亡變異的剪接。而且順鉑耐藥細胞可以通過增強SRPK1乙?；蛞种破浼っ富钚?進而增強對順鉑的敏感性[31]。

研究發(fā)現(xiàn),SRPK1下調(diào)可以提高乳腺癌、卵巢癌等對化療的敏感性,SRPK1下調(diào)誘可導雌激素受體陽性乳腺癌細胞對順鉑的敏感性。在雌激素受體陽性的基底細胞樣型乳腺癌(basal-like breast cancer,BLBC)中,SRPK下調(diào)增強細胞凋亡,增加了MCF10A、MCF7、MDA231和 MDA468細胞對化療藥吉西他濱和順鉑的敏感性,同時抑制細胞遷移和腫瘤轉(zhuǎn)移[32]。在卵巢癌中,靶向SRPK1抑制SKOV3細胞增殖、遷移和侵襲,提高腫瘤細胞對順鉑的敏感性[33]。另外,在膠質(zhì)瘤細胞系87MG、T98G和U251MG中,SRPK1在mRNA和蛋白水平上的表達顯著上調(diào),敲低SRPK1對細胞活力影響不大,但令腫瘤細胞對順鉑的敏感性有一定提高。

2.3 HNRNP家族HNRNP家族與mRNA的合成相關(guān),在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮多種功能,如促進剪接、多聚腺苷化、mRNA轉(zhuǎn)運和mRNA穩(wěn)定[34]。HNRNPs含有輔助的脯氨酸、甘氨酸結(jié)構(gòu)域,這些結(jié)構(gòu)域與蛋白質(zhì)的相互作用有關(guān)。HNRNPs的異常表達與癌細胞的增殖、轉(zhuǎn)移息息相關(guān)[35]。

研究發(fā)現(xiàn)雄激素受體剪接變體 7(androgen receptor splicing variant 7,AR-V7)的剪接由核糖核蛋白L (HNRNPL)和其他兩個家族成員HNRNPA1和HNRNPH調(diào)節(jié)。HNRNPA1在ARAS產(chǎn)生AR-V7中發(fā)揮重要作用[36]。它調(diào)節(jié)AR并誘導產(chǎn)生其變體AR-V7,激活MYC,與轉(zhuǎn)移性前列腺癌的耐藥性密切相關(guān)。敲低HNRNPH1使PC細胞對比卡魯胺敏感,抑制體內(nèi)前列腺腫瘤的生長[37]。另有研究表明在前列腺癌中HNRNPA1可以誘導AR-V7的產(chǎn)生,促進了AR-FL(full-length AR)在缺乏雄激素的情況下的核定位,并減輕了抗雄激素恩雜魯胺抑制AR-FL核運輸?shù)哪芰ΑR剪接變體的表達減弱了雄激素和恩雜魯胺對LNCaP、22Rv1、COS-7和PC-3細胞的毒性,并降低了恩雜魯胺的體內(nèi)抗腫瘤療效。HNRNPA1過表達提高前列腺癌細胞對恩雜魯胺的耐藥性[38]。槲皮素可以降低HNRNPA1的表達,從而降低AR-V7的表達。槲皮素還與HNRNPA1結(jié)合,削弱其在細胞核和細胞質(zhì)之間穿梭的能力,導致其滯留在細胞質(zhì)。槲皮素對AR-V7的抑制使恩雜魯胺耐藥前列腺癌細胞恢復對恩雜魯胺的敏感性。抑制雄激素受體的AS在前列腺腫瘤對抗雄激素治療中重新獲得敏感性具有重要意義[39]。在胃癌中HNRNPA2B1的過表達與患者的不良預后有關(guān),HNRNPA2B1通過增強細胞增殖、抑制細胞凋亡和增加細胞轉(zhuǎn)移來促進胃癌發(fā)展。HNRNPA2B1參與抗凋亡因子BIRC5(baculoviral IAP repeat-containing 5)的AS過程。BIRC5亞型202過表達可以部分拮抗因HNRNPA2B1下調(diào)導致的順鉑化療敏感性提高,證明HNRNPA2B1調(diào)節(jié)BIRC5的剪接過程,有希望成為耐藥胃癌細胞的治療靶點[40]。

2.4 Sm蛋白家族真核生物中有7種Sm蛋白：B/B ′、D1、D2、D3、E、F和G。這些蛋白在剪接體上組裝成一個環(huán)狀的異七聚體,形成相應snRNPs的核心。Sm蛋白是維持snRNAs的穩(wěn)定性和snRNPs的發(fā)揮功能所必需的成分,在pre-mRNA剪接中非常重要[41],在非小細胞肺癌和膠質(zhì)母細胞瘤化療耐藥中起重要作用。

小核核糖核蛋白多肽B(SNRPB)是剪接體的核心成分,是一種Sm蛋白,在mRNA剪接中起著關(guān)鍵作用。SNRPB在非小細胞肺癌(NSCLC)中高度表達,并作為一種致癌基因發(fā)揮作用,SNRPB可負向調(diào)節(jié)NSCLC細胞的順鉑耐藥。敲低SNRPB可以使抑制癌細胞的生長,也會顯著降低順鉑誘導的NSCLC細胞生長抑制、細胞周期阻滯和凋亡,SNRPB可能是NSCLC患者對順鉑化療反應的一個預測指標[42]。替莫唑胺(TMZ)是多形膠質(zhì)母細胞瘤(GBM)化療的常用藥物,但耐藥性限制了其在GBM治療中的療效。編碼小核核糖核蛋白多肽G的SNRPG基因介導的對膠質(zhì)瘤細胞的抑制作用可能與MYC和p53有關(guān)。且SNRPG在TMZ耐藥U87細胞中表達增加,而下調(diào)SNRPG可能使耐藥細胞對TMZ敏感,這表明敲低SNRPG可以降低GBM細胞對TMZ的化療耐藥[43]。

2.5 SPF45SPF45參與調(diào)控pre-mRNA剪接,SPF45不是剪接因子的SR蛋白或HNRNP家族成員,是由一個N端結(jié)構(gòu)域、一個α-螺旋結(jié)構(gòu)域、一個包含40個氨基酸的G-patch域(G-patch domain)和一個C端RRM (RNA-recognition motif)組成,是mRNA剪接所必需的,在卵巢癌化療耐藥中起重要作用。

SPF45在人類導管上皮中表達,在膀胱癌、肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌和前列腺癌中高表達。在HeLa細胞中過表達SPF45可使其對阿霉素的耐藥性增加。在A2780卵巢癌細胞系中,SPF45誘導了多藥耐藥表型,誘導癌細胞對卡鉑、長春瑞濱、阿霉素、依托泊苷、米托蒽醌和長春新堿等多種作用機制的化療藥物耐藥,而在A2780細胞中,敲低SPF45則使細胞對依托泊苷敏感。SPF45不只參與選擇性mRNA剪接也參與DNA修復,這有助于解釋SPF45過表達所表現(xiàn)出對包括DNA損傷劑在內(nèi)的不同作用機制藥物的多藥耐藥表型[44]。

2.6 SF3B1SF3B1是U2 snRNP的重要組成部分,對剪接位點的選擇至關(guān)重要,在慢性淋巴細胞白血病(CLL)、急性淋巴細胞白血病(ALL)和Richter綜合征伴彌漫性大B細胞淋巴瘤化療耐藥中起重要作用。

在研究氟達拉濱難治性CLL的編碼基因組時,發(fā)現(xiàn)SF3B1突變患者在氟達拉濱難治性CLL病例中有17%復發(fā),其頻率顯著高于診斷時采樣的連續(xù)CLL隊列。在氟達拉賓難治性CLL中,SF3B1突變和TP53突變以相互排斥的方式分布。上述結(jié)果提示,SF3B1突變相關(guān)的剪接調(diào)控是CLL一種新的發(fā)病機制。在Richter綜合征伴彌漫性大B細胞淋巴瘤中檢測到SF3B1突變,這表明其在惡性血液腫瘤的發(fā)展和進展中具有重要作用,但SF3B1突變后與耐藥性之間的關(guān)系尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn),剪接抑素A (spliceostatin,SSA)或其類似物美亞霉素B (MAMB)能夠降低BRAF表達,干擾SF3B1在AS中發(fā)揮作用并抑制維莫非尼耐藥細胞生長和體內(nèi)腫瘤生長[45]。SF3B1敲低后,ALL細胞對DNA交聯(lián)劑絲裂霉素C變得高度敏感[46]。

3 小結(jié)

在過去的10年中,癌癥治療取得了很多的進展,包括新的化療藥物、免疫療法和分子靶向治療,但是治療效果仍不夠理想,其中最大的難題之一是腫瘤化療耐藥。腫瘤化療耐藥通過多種分子機制發(fā)生,其中一種是選擇性剪接的調(diào)節(jié)。癌細胞中基因組不穩(wěn)定性有助于它們通過獲得突變來適應生長環(huán)境的變化,這些突變使它們對化療藥物的反應降低。這些突變不僅可以影響pre-mRNA剪接過程,包括剪接位點選擇、剪接位點識別核苷酸的突變和剪接機制成分的表達,還可以影響許多其他因素,包括導致蛋白質(zhì)功能突變獲得或喪失的基因突變。腫瘤細胞可以利用這種機制獲得耐藥性,而無須通過改變基因組獲得耐藥性。近來使用小分子或反義寡核苷酸調(diào)節(jié)AS開始用于治療其他疾病,如脊髓性肌萎縮,為開發(fā)此類分子用于癌癥治療帶來了希望,因此,需要更深入的研究并發(fā)現(xiàn)在促進癌癥治療化療耐藥中起作用的AS事件或剪接因子[7]。

AS的失調(diào)在癌癥中很常見,腫瘤發(fā)生涉及的細胞周期、DNA損傷反應和細胞凋亡在很大程度上都受到AS的調(diào)節(jié)。癌癥相關(guān)的剪接模式受損是多條通路共同作用的結(jié)果,這包括直接影響剪接位點和SFs的突變以及SFs的差異表達。剪接體已經(jīng)成為腫瘤新型治療藥物開發(fā)的一個極具吸引力的靶點,剪接調(diào)節(jié)劑目前已經(jīng)有項目正在臨床前和臨床研究中進行研究。隨著對異常剪接如何在癌細胞中發(fā)揮作用的深入了解包括對剪接調(diào)節(jié)高度敏感的癌癥亞型的鑒定,以及剪接調(diào)節(jié)劑與其他抗腫瘤劑的有效治療組合等,剪接調(diào)節(jié)劑有望腫瘤治療的潛在新型藥物,以提高抗腫瘤療效[46]。此外,剪接轉(zhuǎn)換寡核苷酸是設(shè)計用于結(jié)合pre-mRNA并防止結(jié)合位點利用剪接位點的寡核苷酸。這些分子正被開發(fā)為化療藥物,用于靶向特定的AS相關(guān)基因。許多基因已經(jīng)被靶向用于AS重編程,以增強常規(guī)化療藥物的功效。此類化合物用于AS定向調(diào)控的進一步開發(fā)為癌癥治療提供了新的思路。