采摘時間與干燥方式對藏產(chǎn)紅花藥材質(zhì)量的影響

梁從蓮,韓文悅,王智超,劉紅燕,張永清*

(1.山東中醫(yī)藥大學藥學院,山東 濟南 250355;2.山東中醫(yī)藥大學實驗中心,山東 濟南 250355)

藥材紅花為菊科植物紅花(CarthamustinctoriusL.)的干燥管狀花,藥用歷史悠久,其性溫、味辛,歸心、肝經(jīng),具有活血通經(jīng)、散瘀止痛等功效,用于治療經(jīng)閉、痛經(jīng)、惡露不行、癥瘕痞塊、胸痹心痛、瘀滯腹痛、胸脅刺痛、跌撲損傷、瘡瘍腫痛等[1-2]。紅花也是重要的藏藥之一,藏語名“Ku-gong”,藏醫(yī)臨床多用于治療痛經(jīng)、難產(chǎn)、外傷、血瘀、肝炎、肝熱,被譽為“保肝圣藥”[3-4]。含有紅花的藏藥成方較多,如“十四味羚羊角丸”“石榴日輪丸”“二十五味松石丸”“七味鐵屑丸”等[5]。現(xiàn)代研究顯示,紅花含有黃酮類、生物堿類、倍半萜類、有機酸類等成分,其中黃酮類是紅花的主要活性成分,也是活血化瘀的藥效物質(zhì)[6-7]。我國紅花栽培歷史悠久,早在漢代就有關于紅花栽培和藥用的記載,目前紅花主產(chǎn)于新疆、四川、云南、河南等地,西藏部分地區(qū)也有栽培。有關紅花種質(zhì)資源、栽培技術、化學成分、藥理活性等的研究文獻眾多,但鮮見藏產(chǎn)紅花質(zhì)量方面的研究。本文探討了采收時間及干燥方式對藏產(chǎn)紅花黃酮類、酚酸類成分含量及其提取液抗氧化活性的影響,旨在為提高和穩(wěn)定藏產(chǎn)紅花藥材質(zhì)量提供參考,助力藏藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

1 材料、儀器與試劑

1.1 材料紅花樣品采自西藏自治區(qū)山南市,原植物經(jīng)山東中醫(yī)藥大學張永清教授鑒定,確認為菊科植物紅花(C.tinctoriusL.)。分別在初花期(初開放為黃色時)、中花期(漸變?yōu)辄S紅色時)、盛花期(成熟為紅色時)、敗花期(在植株上枯敗為土紅色時)采摘開放的管狀花,置于50 ℃烘箱熱風烘干;將在盛花期采摘的鮮花,分別50 ℃烘干、陰干和曬干。以上樣品充分干燥后,粉碎,過三號篩,避光密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器Agilent 1260 Infinity Ⅱ 高效液相色譜分析儀(美國安捷倫科技有限公司);GFL-230型烘箱(天津市萊玻特瑞儀器設備有限公司);LG-01粉碎機(瑞安市百信制藥機械有限公司);MSA6.6S-0CE電子天平[賽多利斯(上海)貿(mào)易有限公司];PL203型電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司];KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司);HH-S6數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國宇儀器制造有限公司);SpectraMax M5酶標儀[美谷分子儀器(上海)有限公司]。

1.3 試劑羥基紅花黃色素A(純度≥98%,批號：606H021)、山柰酚(純度≥98%,批號：1208J022)、槲皮素(純度≥99.85%,批號：MUST-22042012)、蘆丁(純度≥98%,批號：SR8250)、原兒茶酸(純度≥98%,批號：310E023)、沒食子酸(純度≥98%,批號：1008U021)、1,1-二苯基-苦基肼(DPPH,純度≥98%,批號：914S021)、2,2′-聯(lián)氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽(ABTS,純度≥98%,批號：1031F022)均購自北京索萊寶科技有限公司。

流動相用甲醇、磷酸為色譜純,水為純凈水,其他試劑均為分析純。

2 試驗方法

2.1 含量測定

2.1.1 供試品溶液的制備羥基紅花黃色素A、槲皮素、蘆丁、原兒茶酸及沒食子酸的方法依照文獻[8]并稍做改進。取紅花樣品粉末約0.20 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入50%甲醇10 mL,稱定重量,超聲處理(功率300 W,頻率50 kHz,50 ℃)40 min,放冷,用50%甲醇補足減失的重量,2 000 r·min-1離心2 min,取上清液,用0.22 μm微孔濾膜過濾,即得供試品溶液。依照《中國藥典》2020年版(以下簡稱藥典)紅花[1]中山柰酚制備方法制備山柰酚供試品溶液。

2.1.2 對照品溶液的制備精密稱定羥基紅花黃色素A、山柰酚、槲皮素、蘆丁、原兒茶酸及沒食子酸對照品各12.065、13.121、17.976、9.023、6.911、5.424 mg,加25%甲醇10 mL,制成混合標準品儲備溶液,精密量取1 mL用25%甲醇稀釋至10 mL,混勻。

2.1.3 色譜條件色譜柱：Zorbax SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相：選用0.7%的磷酸-水溶液(A)和甲醇(B)進行梯度洗脫;梯度條件：0～15 min,2% B→20% B;15～30 min,20% B→30% B;30～35 min,30% B;35～70 min,30% B→80% B;檢測波長：254 nm;流速：1.0 mL·min-1;柱溫：(30±0.8)℃;樣品室溫度10 ℃,進樣量：10 μL。色譜圖見圖1。

1.沒食子酸;2.原兒茶酸;3.羥基紅花黃色素A;4.蘆丁;5.槲皮素;6.山柰酚圖1 混合對照品(A)、供試品(B、C)在254 nm下HPLC圖

2.2 方法學考察

2.2.1 精密度試驗取“2.1.2”項下混合對照品溶液,連續(xù)進樣6次,記錄羥基紅花黃色素A、山柰酚、蘆丁、槲皮素、沒食子酸、原兒茶酸峰面積,計算各成分峰面積的RSD值,結(jié)果顯示的RSD值分別為0.9%、1.1%、1.2%、0.9%、1.3%、1.1%,證明儀器的精密度良好。

2.2.2 線性關系考察取混合標準品儲備溶液1 mL,用25%甲醇分別定容于5、25、50、100、200 mL容量瓶中,配置成一系列濃度梯度的混合對照品線性溶液,按“2.1.3”項下色譜條件進行梯度洗脫,以樣品濃度(X)為橫坐標,峰面積(Y)為縱坐標,進行線性回歸分析,并計算相關系數(shù)。結(jié)果如表1所示,由表1可知,6種成分在相應濃度范圍內(nèi)線性關系良好。

表1 各成分的回歸方程、相關系數(shù)、線性范圍

2.2.3 重復性試驗取烘干處理的中花期紅花粉末樣品0.2 g,精密稱定,平行6組,按“2.1.1”項分別制成兩種供試品溶液,在“2.1.3”項下的色譜條件分別進樣,計算羥基紅花黃色素A、山柰酚、蘆丁、槲皮素、沒食子酸、原兒茶酸含量的RSD,結(jié)果顯示6種成分含量的RSD值分別為1.4%、1.6%、0.9%、1.3%、0.9%、1.3%,表明該方法測定6種化學成分的重復性良好。

2.2.4 加樣回收試驗取已知含量的烘干處理的中花期紅花粉末樣品0.2 g,精密稱量,按“2.1.1”項下分別制備成兩種供試品溶液,平行9組,按1.5∶1、1∶1、1∶0.5分為高、中、低各3組,分別加入相應對照品,按“2.1.3”項中的色譜條件進行檢測,計算羥基紅花黃色素A、山柰酚、蘆丁、槲皮素、沒食子酸、原兒茶酸6種成分加樣回收率,回收率范圍分別為97.5%～101.8%、97.9%～101.2%、98.3%～100.9%、98.5%～101.5%、98.1%～102.3%、98.5%～102.7%,RSD值分別為1.8%、1.5%、0.9%、1.3%、1.7%、1.3%。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗分別取“重復性”項下的兩種供試品溶液的第一份,在“2.1.3”項下的色譜條件分別在0、2、4、6、10、16、24 h連續(xù)進樣,記錄羥基紅花黃色素A、山柰酚、蘆丁、槲皮素、沒食子酸、原兒茶酸的峰面積,計算峰面積的RSD,分別為0.9%、0.7%、1.1%、0.9%、1.7%、1.9%,表明供試品溶液在10 ℃條件下,24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3 抗氧化活性分析樣品提取：紅花醇提取物制備參照文獻[9]并稍做改進。精密稱取紅花樣品0.2 g,加入50%甲醇25 mL,超聲處理(功率300 W,頻率50 kHz,50 ℃)30 min,2 000 r·min-1離心2 min,取上清液備用。

DPPH清除能力測定：參照文獻[10]并稍做改進。移取上述紅花樣品提取液,用50%甲醇稀釋適當倍數(shù),向100 μL樣品溶液中加入0.015 mg·mL-1DPPH溶液100 μL,混合均勻,室溫避光放置30 min。在517 nm波長下測定反應溶液的吸光度。以50%甲醇作為空白對照。重復3次。根據(jù)以下公式計算 DPPH 自由基清除率：

DPPH自由基清除率(%)=1-(Ai-Aj)/Ao×100

其中,Ai為DPPH溶液+樣品溶液的吸光度;Aj為樣品溶液+50%甲醇溶液的吸光度;Ao為DPPH溶液+50%甲醇溶液的吸光度。

ABTS清除能力的測定：參照文獻[11]并稍做改進。取7.4 mmol·L-1ABTS 儲備液和2.6 mmol·L-1過硫酸鉀溶液以1∶1(V/V)混勻,室溫避光靜置12 h后,作為ABTS工作液。移取上述紅花提取液,用50%甲醇稀釋適當倍數(shù),向100 μL樣品溶液中加入上述配制的ABTS工作液100 μL,混合均勻,室溫避光下靜置30 min,在734 nm波長下測定反應溶液的吸光度。以50%甲醇作為空白對照。重復3次。ABTS自由基清除率計算公式同DPPH。

3 結(jié)果與分析

3.1 采摘時間對藏產(chǎn)紅花化學成分含量及抗氧化活性的影響

3.1.1 對化學成分含量的影響經(jīng)測定,采摘時間對藏產(chǎn)紅花化學成分含量的影響參見圖2,藏產(chǎn)紅花中羥基紅花黃色素A、山柰酚含量在4個不同時期采摘均符合藥典標準。羥基紅花黃色素A、蘆丁含量顯示中花期>盛花期>初花期>敗花期,山柰酚、原兒茶酸含量顯示中花期>盛花期>敗花期>初花期,槲皮素含量顯示敗花期>盛花期>中花期>初花期,沒食子酸含量顯示中花期>初花期>盛花期>敗花期。4個花期之間的沒食子酸含量均有顯著性差異(P<0.05),中花期和盛花期的羥基紅花黃色素A、蘆丁、槲皮素和山柰酚含量無顯著性差異,盛花期和敗花期的原兒茶酸含量無顯著性差異。

圖2 采摘時間對藏產(chǎn)紅花6種化學成分含量的影響

3.1.2 對抗氧化活性的影響經(jīng)測定,不同花期紅花甲醇提取液對DPPH和ABTS自由基的清除能力如圖3所示,采摘時間對藏產(chǎn)紅花抗氧化活性的影響較大。中花期、盛花期采摘的紅花對兩種自由基的清除率均較高,說明這兩個時期的紅花抗氧化活性較強。擬合各采摘時間抗氧化活性曲線,得出紅花DPPH自由基清除率的IC50值在初花期、中花期、盛花期和敗花期分別為3.232、2.422、2.625、5.257;ABTS自由基清除率的IC50值在初花期、中花期、盛花期和敗花期分別為0.416、0.306、0.340、0.578。

圖3 采摘時間對藏產(chǎn)紅花DPPH(A)和ABTS(B)自由基清除率的影響

3.2 干燥方法對藏產(chǎn)紅花化學成分含量及抗氧化活性的影響

3.2.1 對化學成分含量的影響干燥方式對藏產(chǎn)紅花化學成分含量的影響如圖4所示,陰干、曬干與烘干藏產(chǎn)紅花的羥基紅花黃色素A和山柰酚含量均符合國家藥典標準,且羥基紅花黃色素A含量均是藥典規(guī)定標準的2倍以上。烘干紅花的羥基紅花黃色素A、蘆丁和沒食子酸3種成分含量均最高,分別是陰干和曬干的1.024、1.243,1.149、1.182,1.239、1.257倍。陰干紅花的山柰酚和槲皮素含量最高,分別是烘干和曬干的1.061、1.273倍及1.208、1.203倍。曬干紅花的原兒茶酸含量最高,分別是陰干和烘干的1.226、1.314倍。差異性分析結(jié)果顯示,陰干、曬干及烘干紅花的羥基紅花黃色素A和沒食子酸含量均有顯著性差異(P<0.05),而陰干與烘干紅花的山柰酚、原兒茶酸含量,烘干與曬干紅花的槲皮素含量,陰干和曬干紅花的蘆丁含量,均無顯著性差異。

圖4 干燥方式對藏產(chǎn)紅花6種化學成分含量的影響

3.2.2 對抗氧化活性的影響干燥方式對藏產(chǎn)紅花抗氧化活性的影響,如圖5所示。圖5結(jié)果顯示,干燥方式對藏產(chǎn)紅花抗氧化活性影響較大。烘干紅花對兩種自由基的清除率均高于其他2種干燥方式,其次是陰干和曬干。擬合各干燥方式抗氧化活性曲線,得出紅花DPPH自由基清除率的IC50值在烘干、陰干和曬干的處理下分別為2.670、3.185、5.656;ABTS自由基清除率的IC50值在烘干、陰干和曬干的處理下分別為0.339、0.416、0.757。

圖5 干燥方式對藏產(chǎn)紅花DPPH(A)和ABTS(B)自由基清除率的影響

3.3 統(tǒng)計分析

3.3.1 化學成分與抗氧化活性間的相關性分析采用Excel軟件,將不同時間采摘、不同方式干燥藏產(chǎn)紅花DPPH、ABTS的IC50值,分別與6種化學成分含量進行灰色關聯(lián)度分析,結(jié)果如表2所示,藏產(chǎn)紅花6種化學成分含量與DPPH、ABTS IC50值的關聯(lián)系數(shù)均大于0.6,表明關聯(lián)度較高。

表2 藏產(chǎn)紅花化學成分含量與抗氧化活性間的灰色關聯(lián)系數(shù)

采用SPSS軟件中的斯皮爾曼法進行雙變量相關性分析,結(jié)果如表3所示,藏產(chǎn)紅花DPPH IC50值與羥基紅花黃色素A、蘆丁含量,ABTS IC50值與羥基紅花黃色素A、蘆丁、沒食子酸含量,存在顯著負相關(P<0.05);而沒食子酸和山柰酚的含量與DPPH的IC50值中度相關,山柰酚、槲皮素和原兒茶酸的含量與ABTS的IC50值中度相關。

表3 藏產(chǎn)紅花6種化學成分和抗氧化活性的雙變量相關性分析

3.3.2 回歸分析采用SPSS軟件中的偏最小二乘法分別對兩種抗氧化活性的IC50值和顯著相關成分之間建立多元回歸方程,其中以IC50值為因變量,相關成分為自變量,DPPH的多元回歸方程為Y=10.240-2.374X1-11.559X2,X1為羥基紅花黃色素A,X2為蘆丁;ABTS的多元回歸方程為Y=1.420-0.320X1-0.320X2-9.366X3;X1為羥基紅花黃色素A,X2為蘆丁,X3為原兒茶酸。在DPPH的多元回歸方程中,蘆丁系數(shù)為-11.559,在回歸方程里負向貢獻最大,且在相關性分析中,蘆丁含量與抗氧化活性的相關系數(shù)為-0.893,也是具有極顯著(P<0.01)負相關的成分。在ABTS的多元回歸方程中,沒食子酸的系數(shù)為-9.366,在回歸方程里負向貢獻最大,羥基紅花黃色素A、蘆丁的系數(shù)均為-0.320,貢獻較小。綜上,在清除DPPH自由基的過程中,6種成分起主要作用的是蘆丁,而在清除ABTS自由基的過程中,沒食子酸為發(fā)揮主要作用的成分。

4 討論與結(jié)論

紅花在開花過程中會經(jīng)歷因化學成分變化導致的花色變化,因此,為了獲得花色好、有效成分含量高的紅花藥材,適宜的采摘時間非常重要。丁麗麗等[12]研究表明紅花羥基紅花黃色素A的含量變化為盛花期>始初期>花蕾期>衰落期;山柰酚的含量變化為衰落期>盛花期>始初期>花蕾期。胡喜巧等[13]對始花期、盛花期和衰落期的新鄉(xiāng)紅花進行黃酮、羥基紅花黃色素A、多糖含量的測定,結(jié)果以上成分在紅花盛開后3～4 d左右的盛花期含量最高。干燥是中藥材加工必不可少的環(huán)節(jié),干燥能降低藥材的含水量,便于貯藏運輸。中藥材的干燥方法較多,較常用的有曬干、陰干、烘干、紅外干燥等。不同干燥方法由于干燥時間、溫度控制等不同,形成的藥材在性狀、成分含量上存在差異。如張彥等[14]分別測定了陰干、曬干、45 ℃烘干和60 ℃烘干處理下新疆產(chǎn)紅花羥基紅花黃色素A和山柰酚的含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)45 ℃烘干條件下兩種成分保留的更多。許蘭杰等[15]研究發(fā)現(xiàn)紅花中的羥基紅花黃色素A隨著溫度50～100 ℃范圍內(nèi)升高呈直線下降趨勢,說明采用50 ℃以下的烘干溫度能使羥基紅花黃色素A得到更多的保留。

藥典規(guī)定紅花藥材的采收加工為夏季花由黃變紅時釆摘,陰干或曬干。據(jù)實地觀察,藏產(chǎn)紅花花色會經(jīng)歷黃色、橙色、紅色至土紅色的變化;紅花藥材在當?shù)丶庸r,常采用曬干、陰干和低溫烘干。為此本研究收集了黃色初花、橙色中花、紅花盛花和土紅色敗花幾種花期的紅花,選擇產(chǎn)地常用3種干燥方式,考察其中4種黃酮類成分和2種酚酸類成分的含量及其提取液抗氧化性的影響。結(jié)果表明,中花期紅花羥基紅花黃色素A、蘆丁、山柰酚、原兒茶酸和沒食子酸的含量均是最高的,且中花期和盛花期的羥基紅花黃色素A、蘆丁、山柰酚和槲皮素含量無顯著性差異;抗氧化活性測定結(jié)果也表明,中花期和盛花期采摘的紅花對兩種自由基清除率較高;因此在藏產(chǎn)紅花的實際生產(chǎn)中,應該盡量于花冠發(fā)育至黃紅色到紅色期間進行采摘。采摘過早,不僅藥效成分含量少、抗氧化活性較弱,產(chǎn)量也較低;采摘過晚,紅花干枯,藥材色澤變差,藥效成分含量也較低。烘干紅花羥基紅花黃色素A、蘆丁和沒食子酸的含量最高,陰干紅花山柰酚和槲皮素的含量最高,但陰干和烘干紅花的山柰酚含量無顯著性差異;且烘干紅花兩種自由基清除率均是最高的,其次為陰干和曬干;因此在藏產(chǎn)紅花的產(chǎn)地加工過程中,應該盡量選擇低溫烘干的方式,沒有烘干設備的條件下盡量選擇通風處陰干,并注意時時翻動。