Lmo7對MC3T3-E1細(xì)胞增殖、遷移及成骨分化影響的實驗研究

毛佳奕， 王佐林

（同濟(jì)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，同濟(jì)大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔種植科，上海牙組織修復(fù)與再生工程技術(shù)研究中心，上海 200072）

Lmo7 是一類蛋白質(zhì)編碼基因，其編碼的同名蛋白是一類存在于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜中的多功能蛋白，隸屬于 PDZ-LIM 蛋白家族，廣泛分布在從蠕蟲到人類的動物界[1-2]?，F(xiàn)有研究[3-4]中，Lmo7被證實作為轉(zhuǎn)錄激活因子與emerin 結(jié)合并調(diào)控成肌細(xì)胞的分化，與心肌和骨骼肌的發(fā)育密切相關(guān)[5]。另一方面，Lmo7 被證實其定位于細(xì)胞間的黏附連接，是2 種F-肌動蛋白——afadin 和α-actinin 的結(jié)合蛋白[6]，這提示Lmo7 可能參與多種細(xì)胞生物學(xué)功能，包括形態(tài)發(fā)生、分化、增殖[7]和遷移。近年來，有學(xué)者[8]研究發(fā)現(xiàn)Lmo7 由轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）誘導(dǎo)產(chǎn)生，并且通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)TGF-β1 信號通路來限制血管纖維化反應(yīng)。基于TGF-β1 在促進(jìn)骨祖細(xì)胞增殖、早期分化過程中發(fā)揮了重要作用[9-10]，Lmo7 與成骨過程是否存在聯(lián)系，發(fā)揮了怎樣的功能，目前尚無文獻(xiàn)報道。

本研究采用小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞（MC3T3-E1 cells），通過慢病毒介導(dǎo)的RNA 干擾技術(shù)敲低Lmo7 的表達(dá)，觀察其對細(xì)胞增殖、遷移和成骨分化的影響，初步探索Lmo7 在成骨過程中的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗試劑及儀器

MC3T3-E1 細(xì)胞（亞克隆 14；普諾賽公司，中國）；α-MEM 培養(yǎng)液（hyclone 公司，美國）；血清（BI公司，以色列）；胰蛋白酶（Gibco 公司，美國）；青鏈霉素雙抗（hyclone 公司；美國）；成骨誘導(dǎo)液（賽業(yè)公司，中國）；慢病毒載體（北京擎科生物科技有限公司，中國）；siRNA（北京擎科生物科技有限公司，中國）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa 公司，日本）；實時定量 PCR 試劑盒（上海翊圣生物科技有限公司，中國）；PCR 引物（北京擎科生物科技有限公司，中國）；Lmo7 抗體（Santa Cruz 公司，美國）；GAPDH 抗體（Cell Signaling Technology 公司，美國）；堿性磷酸酶（ALP）顯色試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，中國）；熒光定量 PCR 儀（Roche 公司，瑞士）；Al 680 超靈敏多功能成像儀（GE 公司，美國）；倒置熒光顯微鏡（蔡司公司，德國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 MC3T3-E1 細(xì)胞的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng) 將MC3T3-E1 細(xì)胞加入10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的α-MEM 培養(yǎng)液中，在37 ℃、5%CO2的環(huán)境下培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度為60%。再將其加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液中進(jìn)行誘導(dǎo)分化，每2～3 天更換1 次培養(yǎng)液，分別在成骨誘導(dǎo)0、3、7、14 d 時收集細(xì)胞樣品以進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建穩(wěn)定干擾Lmo7 的MC3T3-E1 細(xì)胞株 MC3T3-E1 細(xì)胞以2.5×105個/孔鋪板至6 孔板中，次日更換培養(yǎng)液為含10 μg/mL 聚凝胺（polybrene）的完全培養(yǎng)液，加入慢病毒pLVshLmo7-mCherry（干擾組）或pLV-mCherry（對照組）進(jìn)行轉(zhuǎn)染，24 h 后更換為含10%胎牛血清的α-MEM 培養(yǎng)液，待細(xì)胞生長狀況恢復(fù)后加入10 μg/mL 嘌呤霉素篩選，得到穩(wěn)定干擾Lmo7 表達(dá)的MC3T3-E1 細(xì)胞株。

1.2.3 實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）檢測mRNA 表達(dá)水平 收集細(xì)胞樣本，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清 洗2 次，TRIzol提取總RNA 后，使用紫外分光光度計測定RNA 純度與濃度，調(diào)平后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行RT-qPCR檢測，反應(yīng)體系：正、反引物各0.5 μL，cDNA 模板1 μL，SYBR Green Master mix 5 μL，二次蒸餾水（ddH2O）補(bǔ)足至10 μL，每組樣本設(shè)3 個復(fù)孔。所使用的引物序列如表1。

表1 RT-qPCR 引物序列Table 1 Primer sequences used for RT-qPCR

1.2.4 Western blotting 檢測蛋白表達(dá)水平 收集細(xì)胞樣品，用PBS 清洗2 次，使用RIPA 裂解液充分裂解細(xì)胞提取總蛋白，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒測定蛋白濃度，調(diào)平后上樣行10% 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），再轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜 上，5% 脫脂奶 粉封閉1 h，一抗 4 ℃下孵育過夜。隔天加入辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）偶聯(lián)的二抗室溫孵育1 h，放入超靈敏多功能成像儀，掃描成像。

1.2.5 CCK-8 實驗 將處于對數(shù)生長期的MC3T3-E1 細(xì)胞用胰蛋白酶消化后制備成細(xì)胞懸液，以2 000 個/孔接種至96 孔板中，每組設(shè)5 個復(fù)孔。培養(yǎng)1～6 d，每孔加入100 μL 含10% CCK-8 溶液的完全培養(yǎng)液孵育2 h，再用酶標(biāo)儀測定450 nm 波長處下每孔的吸光度值。

1.2.6 EdU 實驗 將MC3T3-E1 細(xì)胞以3 000 個/孔接種于96 孔板中，至次日細(xì)胞貼壁后，加入EdU培養(yǎng)液繼續(xù)孵育5 h。標(biāo)記完成后用PBS 洗脫多余的EdU，4%多聚甲醛室溫固定30 min，用2 mg/mL甘氨酸與PBS 各清洗1 遍。加入滲透劑（含0.5%TritonX-100 的PBS）室溫通 透10 min，PBS 清 洗后每孔加入100 μL Apollo 反應(yīng)液，室溫避光孵育30 min。滲透劑再次清洗2～3 次，使用Hoechst 溶液對DNA 染色，室溫避光孵育10 min，PBS 清洗3 次后在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.2.7 細(xì)胞劃痕實驗 將MC3T3-E1細(xì)胞以1×105個/孔接種至12 孔板，待細(xì)胞生長至100%的匯合狀態(tài)后，盡量垂直于細(xì)胞皿底用無菌槍頭劃出一條直線，PBS 清洗去除漂浮細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，分別拍攝記錄0、12、24 h 時的細(xì)胞遷移情況。

1.2.8 Transwell 實驗 用無血清培養(yǎng)液重懸MC3T3-E1 細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個/mL，取100 μL細(xì)胞懸液接種于Transwell 小室上室，下室加入600 μL 含20%胎牛血清的α-MEM 培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后取出，再使用4%多聚甲醛固定15 min 后，用PBS 清洗，結(jié)晶紫溶液染色10 min，用棉簽擦去上室未遷移細(xì)胞，PBS 清洗后在顯微鏡下觀察拍照。

1.2.9 堿性磷酸酶(ALP)染色 收集成骨誘導(dǎo)7 d后的細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定15 min，PBS 清洗，ALP 染色液孵育3 h，PBS 清洗后拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間差異采用單因素方差分析進(jìn)行比較，P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。統(tǒng)計繪圖使用Graphpad Prism 8 軟件（Graphpad公司，美國）。

2 結(jié)果

2.1 Lmo7 基因在成骨誘導(dǎo)過程中表達(dá)上調(diào)

對MC3T3-E1 細(xì)胞成骨誘導(dǎo)0、3、7、14 d 后，收集細(xì)胞樣品提取總RNA和蛋白，RT-qPCR和Western blotting 結(jié)果顯示，與未進(jìn)行成骨誘導(dǎo)的對照組相比，Lmo7 的表達(dá)水平在14 d 內(nèi)持續(xù)上調(diào)（圖1）。

圖1 RT-qPCR 和Western blotting 檢測Lmo7 在成骨誘導(dǎo)過程中的表達(dá)Figure 1 RT-qPCR and Western blotting detection of Lmo7 expression during osteogenic induction

2.2 構(gòu)建穩(wěn)定干擾Lmo7 的MC3T3-E1 細(xì)胞株

通過慢病毒轉(zhuǎn)染，嘌呤霉素篩選后獲得穩(wěn)定干擾Lmo7 的MC3T3-E1 細(xì)胞株及對照組MC3T3-E1細(xì)胞株，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，熒光顯微鏡下觀察到mCherry 紅色熒光標(biāo)記。收集細(xì)胞樣品，對轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中Lmo7 的mRNA 及蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測，RT-qPCR 及Western blotting 結(jié)果顯示（圖2A、B），與對照組相比，干擾組Lmo7 mRNA 的相對表達(dá)敲低約80%（P<0.01），蛋白水平的表達(dá)也顯著下調(diào)，熒光顯微鏡下觀察帶有紅色熒光標(biāo)記的細(xì)胞與明場細(xì)胞基本重合，證明2 組穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建成功（圖2C）。

圖2 慢病毒轉(zhuǎn)染MC3T3-E1 細(xì)胞后Lmo7 的表達(dá)Figure 2 Expression of Lmo7 after lentivirus transfection to MC3T3-E1 cells

2.3 干擾Lmo7 對MC3T3-E1 細(xì)胞增殖能力的影響

如圖3 所示，第2 天時干擾組細(xì)胞的吸光度值顯著高于對照組，2 組間的差異在第3、4 天時更加明顯，并一直維持到第6 天，表明干擾組細(xì)胞的增殖活性得到了促進(jìn)。EdU 實驗也驗證了這一結(jié)論，熒光顯微鏡下觀察到相同的細(xì)胞接種數(shù)和孵育時間下，干擾組細(xì)胞被EdU 標(biāo)記的數(shù)量要多于對照組，計算2 組的陽性率，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

圖3 慢病毒轉(zhuǎn)染后MC3T3-E1 細(xì)胞的增殖情況Figure 3 Proliferation of MC3T3-E1 cells after lentivirus transfection

2.4 干擾Lmo7 對MC3T3-E1 細(xì)胞遷移能力的影響

如圖4 所示，劃痕實驗顯示在12、24 h 時，干擾組遷移到劃痕區(qū)域的細(xì)胞明顯少于對照組，用Image J 軟件（美國國家衛(wèi)生研究院，美國）測量2 組細(xì)胞劃痕面積，并統(tǒng)計愈合率，結(jié)果顯示干擾組的細(xì)胞遷移能力較低，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。進(jìn)一步通過Transwell 實驗驗證上述結(jié)論，培養(yǎng)24 h 后的結(jié)晶紫染色情況可以看出，干擾組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量更少。

圖4 慢病毒轉(zhuǎn)染后MC3T3-E1 細(xì)胞的遷移情況Figure 4 Migration of MC3T3-E1 cells after lentivirus transfection

2.5 干擾Lmo7 對MC3T3-E1 細(xì)胞成骨分化能力的影響

對慢病毒轉(zhuǎn)染并篩選后的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，第7 天時，RT-qPCR 檢測了2 組細(xì)胞中成骨相關(guān)基因Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runx2）、Osterix、ALP、骨鈣素（OCN）的相對表達(dá)水平。結(jié)果如圖5A—D 所示，干擾組Runx2、Osterix、ALP、OCN 基因的mRNA 相對表達(dá)量均低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。ALP 染色結(jié)果（圖5E、F）顯示，干擾組著色較淺且著色細(xì)胞數(shù)量少，光學(xué)顯微鏡下可見干擾組著色細(xì)胞數(shù)量較少且著色較淺。

圖5 慢病毒轉(zhuǎn)染后MC3T3-E1 細(xì)胞的成骨分化情況Figure 5 Osteogensis of MC3T3-E1 cells after lentivirus transfection

3 討論

Lmo7 隸屬于PDZ-LIM 蛋白家族，是一類在進(jìn)化上具有高度保守性的蛋白，主要包含了鈣調(diào)蛋白同源性（calmodulin homology，CH）結(jié)構(gòu)域、LIM 結(jié)構(gòu)域和 PDZ 結(jié)構(gòu)域[11-12]。作為常見的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用結(jié)構(gòu)域，LIM 結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合高度多樣性的蛋白，包括信號分子、細(xì)胞骨架及轉(zhuǎn)錄因子，能夠支持包括肌動蛋白組裝、整合素依賴性黏附及信號傳遞在內(nèi)的細(xì)胞功能，并使該家族有機(jī)會參與許多生物學(xué)功能，包括在骨形成中的表達(dá)。LIM 礦化蛋白1（LIM mineralization protein-1，LMP-1）被認(rèn)為是骨形成的細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)劑，其關(guān)鍵機(jī)制是通過上調(diào)骨形態(tài)生成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）和穩(wěn)定BMP/Smad 信號通路來增強(qiáng)成骨作用[13-14]。并且在牙周膜干細(xì)胞中，LMP-1 作為TGF-β1 的下游靶基因，是前成骨細(xì)胞增殖和分化中的關(guān)鍵早期信號[15]。在動物模型中，LIMK1-/-小鼠表現(xiàn)出與成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞功能缺陷相關(guān)的骨質(zhì)減少表型[16]。鑒于這些蛋白與Lmo7 同屬PDZ-LIM 家族并擁有相同的結(jié)構(gòu)域，我們猜測在其功能上可能具有類似之處。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，Lmo7在小鼠上頜竇早期成骨前后有表達(dá)差異，但其功能仍需進(jìn)一步驗證。

本實驗中，在成骨誘導(dǎo)0、3、7、14 d 的MC3T3-E1 細(xì)胞中檢測了Lmo7 的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)Lmo7 的mRNA 與蛋白表達(dá)水平均隨著誘導(dǎo)時間的增加而持續(xù)上調(diào)，提示Lmo7 可能參與體外培養(yǎng)細(xì)胞的成骨分化過程。為了進(jìn)一步研究Lmo7 在成骨細(xì)胞分化過程中的具體作用，本實驗運(yùn)用慢病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)檢測Lmo7 表達(dá)水平變化后對細(xì)胞分化及生物學(xué)行為的影響。該技術(shù)是以人類免疫缺陷Ⅰ型病毒（human immunodeficiency virus type 1，HIV-1）為基礎(chǔ)的基因載體，可以將shRNA 整合到細(xì)胞的基因組內(nèi)，實現(xiàn)體內(nèi)轉(zhuǎn)錄siRNA，從而可以長期穩(wěn)定干擾RNA 表達(dá)，獲得高質(zhì)量的穩(wěn)轉(zhuǎn)株[17]。相較于使用siRNA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞，慢病毒載體能夠整合較長外源性目的基因片段，更適合Lmo7 這樣的長片段基因。

成骨是一個復(fù)雜且有序的生理過程，從位于骨髓和骨膜中的間充質(zhì)干細(xì)胞局部增殖開始，在每個階段表達(dá)不同的標(biāo)志基因。其中，前成骨細(xì)胞向成骨細(xì)胞進(jìn)一步分化需要表達(dá) Runx2、Osterix，成熟的成骨細(xì)胞表達(dá)Ⅰ型膠原蛋白（collagenⅠ，ColⅠ）、OCN 及礦化過程中的關(guān)鍵酶ALP[18]。因此，我們選擇了Runx2、Osterix、ALP、OCN 這幾個成骨相關(guān)基因作為觀察Lmo7 對細(xì)胞成骨分化影響的指標(biāo)。成骨誘導(dǎo)7 d 時，RT-qPCR 結(jié)果顯示，小鼠前成骨細(xì)胞低表達(dá)Lmo7 時，成骨相關(guān)基因Runx2、Osterix、ALP、OCN 的mRNA 表達(dá)水平明顯低于對照組（P<0.01）。與此同時，ALP 染色結(jié)果顯示，敲低Lmo7 的細(xì)胞著色較淺，即Lmo7 的低表達(dá)抑制了ALP 活性。Runx2是最重要的成骨主開關(guān)，它通過激活骨表型基因來促進(jìn)多能間充質(zhì)干細(xì)胞向前成骨細(xì)胞分化，也是成骨過程中最早發(fā)揮功能的轉(zhuǎn)錄激活因子[19]?，F(xiàn)有文獻(xiàn)[20]證實，Runx2 是TGF-β1 和BMP-2 的共同靶點，TGF-β1 可以通過Smad 非依賴途徑MAPK 通路正向調(diào)控Runx2 的表達(dá)和功能，以促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的分化。通過Xie 等[8]的研究可知，Lmo7 是TGF-β1 的下游靶基因，因此我們猜測Lmo7 可能在TGF-β1 調(diào)控成骨的過程中發(fā)揮了一定的作用。

Lmo7 被證實通過其LIM 結(jié)構(gòu)域與激活蛋白-1（activator protein-1，AP-1）、轉(zhuǎn)錄因子亞基 c-FOS 和c-JUN 相互作用，并促進(jìn)它們的泛素化和降解[8]。其中，c-FOS 和c-JUN 是由原癌基因編碼的蛋白，其具有正向調(diào)控細(xì)胞增殖的作用[21-22]。這可能解釋了該研究中，敲低Lmo7 后，細(xì)胞增殖能力得到促進(jìn)的情況。此外，在本實驗中，細(xì)胞劃痕實驗與Transwell 實驗均顯示，敲低Lmo7 后，細(xì)胞遷移能力受到抑制，這與現(xiàn)有文獻(xiàn)的結(jié)論一致。有研究[23-24]發(fā)現(xiàn)，Lmo7 能夠協(xié)同Rho 或直接通過降低G-肌動蛋白/F-肌動蛋白比率來調(diào)節(jié)肌動蛋白動力學(xué)，在胰腺癌、乳腺癌細(xì)胞中，Lmo7 的敲低均減弱了細(xì)胞的遷移能力。

綜上所述，本實驗探討了Lmo7 對MC3T3-E1細(xì)胞增殖、遷移及成骨分化的影響，初步證明體外敲低Lmo7 能正向調(diào)控細(xì)胞的增殖活性，同時抑制細(xì)胞的遷移和成骨分化的能力。本實驗為研究Lmo7 在成骨領(lǐng)域的作用提供了新的見解，其機(jī)制有待進(jìn)一步探討。